Name: hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
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Un premio de desarrollo de carrera del Departamento de Asuntos Veteranos [BX002797] apoyó L.E.W. y los institutos nacionales de salud [R01-DK095867] y Asociación Americana del corazón [15GRNT25700209] apoyado J.C. Los institutos nacionales de salud [DK093660], Departamento de asuntos de veteranos [BX002190] y el centro de Vanderbilt para enfermedad renal compatible M.H.W. Este material es el resultado del trabajo apoyado con recursos y uso de instalaciones en el sistema de Healthcare del Valle de Tennessee de VA.

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	<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA.">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li><li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA.">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).</li><li>Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Imaging+of+the+Intracellular+Fate+of+Plasmid+DNA+and+Transgene+Expression:+ZsGreen1+and+Tissue+Clearing+Method+CUBIC+Are+an+Optimal+Combination+for+Multicolor+Deep+Imaging+in+Murine+Tissues.">Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues.</a> PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).</li><li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume.">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).</li><li>Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,+lobe-specific+hydrodynamic+gene+delivery+to+swine+liver.">Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver.</a> Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).</li><li>Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-guided,intravascular+hydrodynamic+gene+delivery+to+skeletal+muscle+in+pigs.">Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs.</a> Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).</li><li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+gene+delivery:+its+principles+and+applications.">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).</li><li>Alino, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naked+DNA+delivery+to+whole+pig+cardiac+tissue+by+coronary+sinus+retrograde+injection+employing+non-invasive+catheterization.">Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization.</a> J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).</li><li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver.">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).</li><li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice.">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Woodard, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney-specific+transposon-mediated+gene+transfer+in+vivo.">Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo.</a> Sci Rep. 7, 44904 (2017).</li><li>Liang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutathione+S-transferase+A4+accelerates+obstruction-induced+tubule+damage+and+renal+fibrosis.">Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis.</a> Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).</li><li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+insulin-like+growth+factor-1+receptor+in+endothelial+cells+against+unilateral+ureteral+obstruction-induced+renal+fibrosis.">Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).</li><li>Corridon, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+facilitate+and+monitor+expression+of+exogenous+genes+in+the+rat+kidney+using+plasmid+and+viral+vectors.">A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).</li><li>Wallace, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+kidney+volume+in+mice+with+polycystic+kidney+disease+by+magnetic+resonance+imaging.">Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging.</a> Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).</li><li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies.">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li><li>Yeikilis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamics+based+transfection+in+normal+and+fibrotic+rats.">Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats.</a> World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li><li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent.">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li><li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles.">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li><li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery:+conclusion+of+a+comparative+study.">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar y no declarar ningún conflicto de interés.

En este protocolo se describe un método robusto para alcanzar expresión génica reproducible específicamente en el riñón. En manos de un cirujano experimentado moderado encontramos el porcentaje de ratones transfectadas por esta técnica en el rango de 50-100%, dependiendo de la edad del ratón y la sensibilidad de la lectura del transgén. El nivel de expresión del gen de luciferasa fue sobre el fondo durante varios meses en ratones recibiendo transposones piggyBac y totalmente mantenida durante varias semanas en ratones inmunocomprometidos recibir los mismos transposones11. Mientras que muchas células mancharon brillantemente para el transgen en áreas cerca del sitio de inyección, la eficiencia de transfección global fue relativamente bajo (figura 3D). El material más importante para lograr el resultado deseado es la jeringa de inyección sí mismo. Esto se debe a 29 x ½" jeringa de insulina con una aguja fija y no de seguridad para impedir la inyección. La inyección debe ser rápida, dentro de s tres. La preparación de ADN de plásmido debe ser pura, con muy baja endotoxina y ADN genómico bacteriano niveles19.
Es concebible que las inyecciones de otras sustancias, tales como RNA, virus o proteínas, pueden hacerse de una manera similar. La pelvis renal fue superior como una vía de entrada a otros sitios de inyección a prueba, como la vena renal o la inyección directa del parénquima renal. Las inyecciones condujeron a sangrado y menor expresión del gen11. Debido a la pelvis renal es una estructura elástica, a veces necesaria para mantener el reflujo de orina, puede ser mejor capaz de estirar y acomodar la aguja. No se ha observado pérdida de solución de ADN u orina del agujero creado por la jeringa de insulina, sugiriendo que la pelvis renal se repara rápidamente. El mecanismo exacto por el cual el fluido inyectado transfects el riñón no ha sido estudiado en profundidad ya que tiene para el hígado, por ejemplo. Estudios de microscopia electrónica futura pueden aclarar aún más este mecanismo. La naturaleza retrógrada de la inyección tiene precedencia en que el método de inyección hidrodinámica cola vena invierte el flujo de la vena hepática20 y otros métodos exitosos de la transfección de riñón han inyectado a través de la vena renal12, 13 , 14 , 21. daño renal es probablemente necesario de eficacias de transfección óptima por lo que presumimos que la transfección ocurre a través de daños a la membrana celular causada por la inyección rápida, de gran volumen. Los podocitos, túbulos y conductos colectores tienen una interfaz directa con el espacio urinario como su función principal es filtrar y concentrar la orina.
Aunque reproducible y específicos del riñón, este método está limitado por la eficiencia de transfección relativamente baja observada (figura 3D). Inyección hidrodinámica la pelvis renal no es un sustituto para la creación de un animal transgénico el transgén de la conducción de un promotor específico de riñón, en que cada célula de un determinado subtipo en el animal expresa el gen de interés. Este método es algo mejor adaptado a enfoques de transferencia de gene para enfermedades en las que un pequeño número de células corregidas tendría un efecto dramático en el fenotipo, de secreción de hormonas u otras sustancias producidas normalmente por el riñón o para la creación de un población de células raras que ejercerá un efecto positivo sobre el riñón para reparar o regenerarlo. Alternativamente, también podría ser utilizado en sentido contrario para desarrollar un nuevo modelo de la lesión renal mediante la introducción de un transgen con una influencia negativa.

La técnica de inyección hidrodinámica cola vena se ha convertido en una forma comúnmente usada para alcanzar altos niveles de expresión génica en mouse de hígado1,2. Los riñones también son transfectados por esta técnica en un nivel mucho más bajo, aproximadamente 100-fold menos3. La inyección hidrodinámica renal pelvis descrita aquí proporciona una manera simple para controlar la especificidad de la expresión del órgano a través de medios físicos, utilizando los mismos principios hidrodinámicos que se han establecido previamente en el hígado4,5 , músculo6y otros órganos7,8. Este método transfects las células de animales vivos en vivo mediante el uso de presión y velocidad para forzar fluido que contienen ADN en las células, induciendo simultáneamente daño al órgano que es rápidamente resueltos9. Usando técnicas quirúrgicas bien establecidas para visualizar el riñón a través de una incisión de flanco10 junto con una sola inyección de la jeringuilla de la insulina, hemos encontrado exitosa transfección de varios tipos de células del riñón, principalmente fibroblastos intersticiales, túbulos y conductos que recoge11. La disección de estos ratones ha demostrado que otros órganos no son transfectados en niveles suficientemente altos como para visualizar por luciferase imágenes técnicas11. Ya que la técnica es no-viral, uso de ADN plásmido para transfección permite fácil y rápida preparación de los reactivos necesarios para la inyección.
Hemos utilizado las inyecciones localizadas de hidrodinámicas para expresar el antioxidante glutatión S-transferasa A4, el receptor de factor de crecimiento 1 similar a la insulina y la hormona eritropoyetina en el riñón, con los esperados efectos biológicos11, 12 , 13. evaluación detallada de la ruta de administración, volumen de inyección, dosis de ADN y elección del promotor ha sido realizado11. Además, tanto en el piggyBac transposon sistema o ciclofosfamida tratamiento para suprimir la reacción inmune a la transgénica han demostrado para mejorar a largo plazo de los resultados de expresión génica11. Otros investigadores han utilizado un enfoque de la vena renal en rata con éxito, logrando eficiencia de transfección alta durante períodos de tiempo de más de un mes14. Sin embargo, la corrección genética de fenotipos mímico enfermedad humana se realizan generalmente en ratones primero como una prueba de concepto ya que los modelos genéticos más mamíferos son modelos de ratón. En comparación con la inyección en la vena renal a la inyección de la pelvis renal y encontraron que la inyección en la pelvis renal es superior a la vena renal para la expresión de genes (aproximadamente diez veces mayor) y supervivencia11. La pelvis renal es la vía ideal de entrada en el riñón porque es lo suficientemente flexible para tolerar fluctuaciones en la producción de orina y a menudo es capaz de mantener su integridad estructural, incluso cuando se dilatan durante la hidronefrosis. Adicionalmente, la inyección en la pelvis renal permite acceso al riñón sin perforación de la cápsula del riñón, permitiendo que el líquido inyectado para conservarse visiblemente por el riñón mejor que la inyección de la intraparenchymal. Otros órganos de ratón no tiene una ruta de entrada distinta a la vasculatura y el espacio urinario del riñón es un sitio ideal de la inyección. Además, la inyección en la vena renal dio lugar a la salida de sangre en la cavidad abdominal. El volumen total renal de riñones de tipo salvaje ratón ha estimado la proyección de imagen de resonancia magnética a ser aproximadamente de 0,2 cm3, por lo que el volumen de un solo riñón es aproximadamente igual a la cantidad de líquido inyectado por la hidrodinámica de la pelvis renal inyección (100 μL)15. En este documento, nos hemos puesto a disposición todos los matices detallados del Protocolo de inyección hidrodinámica la pelvis renal para lograr reproducible de la transfección del riñón.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Anesthetic - Not controlled substance</td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>Required syringes</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Pharmacist/Veterinarian</td><td></td><td>Analgesia - Controlled Substance</td></tr><tr><td>Dynarex Disposable Towel Drape</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Place over heat pad</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Use only endotoxin-free plasmid DNA</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Positive control for endotoxin test</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>Endotoxin test</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5882</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>For autoclaving surgical tools</td></tr><tr><td>Gaymar Heat Pump</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Water-circulating heat pump</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>DS-401</td><td>To reuse surgical tools during surgery</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5136</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Graefe Tissue Forceps</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-5153</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Halsey Needle Holder, 5&quot; Length</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-7841</td><td>Surgical tool</td></tr><tr><td>Heat pads - 15&quot; x 21&quot; - need at least 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>For use with Gaymar Heat Pump</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>For imaging and euthanasia</td></tr><tr><td>Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>For imaging and euthanasia</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Pharmacist/Veterinarian</td><td></td><td>Anesthetic - Controlled Substance</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Laboratory tissues</td></tr><tr><td>Living Image software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>For live animal imaging</td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122796</td><td>For live animal imaging</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Spectrophotometer for DNA measurement</td></tr><tr><td>Prevantics Swabs</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>For skin surgery prep</td></tr><tr><td>Prolene 5-0 sutures Taper 30&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Non-absorbable sutures for skin</td></tr><tr><td>Puralube Brand Opthalmic Ointment</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>To keep eyes moist during surgery</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Sutures J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Absorbable sutures for muscle layer</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Shaver for skin prep</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>For live animal imaging</td></tr></tbody></table>

hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney

Inyección hidrodinámica crea un ambiente local, alta presión para transfectar varios tejidos con ADN plasmídico y otras sustancias. Inyección en la vena hidrodinámica cola, por ejemplo, es un método bien establecido de que el hígado puede ser transfectado. Este manuscrito describe una aplicación de los principios hidrodinámicos por inyección del riñón de ratón directamente con ADN de plásmido de expresión génica específicos de riñón. Ratones son anestesiados y se expone el riñón por una incisión flanco seguida de una inyección rápida de un plásmido que contiene el ADN de la solución directamente en la pelvis renal. La aguja se mantiene en el lugar durante diez segundos y el sitio de la incisión es suturado. Al día siguiente, en vivo la proyección de imagen animal, Western blot o inmunohistoquímica puede utilizarse para análisis de expresión génica, u otros ensayos para el transgén de la opción se utilizan para la detección de la proteína de interés. Métodos publicados para prolongar la expresión de genes incluyen el transgén mediada por transposones integración y ciclofosfamida tratamiento para inhibir la respuesta inmune a la transgénica.

La técnica de la cirugía y la inyección son sencillas para llevar a cabo una vez dominado, que no requiere equipos o materiales costosos. Si a la cirugía de incisión flanco renal, se debe un día de entrenamiento en varios ratones programados para eutanasia en que los ratones no son recuperados después de la cirugía porque el primer intento de esta cirugía puede tomar mucho más tiempo de lo normal. Alternativamente, los investigadores familiarizados con las técnicas similares pueden encontrar bastante simple. Siga la ilustración en la figura 1 y las instrucciones ilustradas en la figura 2. Para colocar correctamente la incisión, el cirujano puede utilizar los dedos para empujar sobre el estómago del ratón mientras sienta a su lado. El riñón es visualizado por una pequeña protuberancia que se eleva cerca de la espina dorsal con ligera presión abdominal y la incisión debe hacerse sobre esta zona (figura 1 y figura 2). Es importante hacer la incisión a través de las capas de piel y músculo del tamaño correcto (figura 1). Si la incisión es demasiado grande, el riñón se desliza hacia la cavidad abdominal fácilmente, haciendo difícil la inyección. Si la incisión es muy pequeña, será difícil empujar el riñón fuera de la cavidad abdominal y podría dañar el órgano. Otro punto importante es la colocación de la aguja en la pelvis renal. El cirujano debe bajar el riñón con la pinza cerrada, luego insertar la aguja en la pelvis renal en un ángulo paralelo a la superficie de trabajo tal que la mayor parte del volumen de inyección entra directamente en el parénquima renal (figura 2). Es importante que la inyección sea realizado lo antes posible para inducir la presión hidrodinámica necesaria para transfección de riñón.
Ratones de cepas distintas, edades, pesos y sexo tienen diferencias en la posición del riñón y la cantidad de grasa que rodea el riñón, por lo que algunos ajustes pueden ser necesarios trabajar con los ratones de interés. Si es posible, el primer intento quirúrgico de que se recuperan los ratones debe incluir una lectura inmediata de la expresión de genes específicos del riñón, como luciferase proyección de imagen (Figura 3A). Si se utilizan ratones jóvenes, el resultado esperado es que todos los ratones tendrá un resplandor que está dentro de un orden de magnitud (figura 3B). En ocasiones, incluso después de una segunda inyección de luciferin, es evidente por proyección de imagen que un ratón o ratones no ser transfectadas en un nivel comparable a los otros o que algunos ratones inyectados faltan incluso totalmente en la expresión génica. Estos ratones pueden excluidos del estudio debido a la entrega del transgen fallido. Si muchos de los ratones carecen de expresión génica, el cirujano debe disminuir el tiempo de inyección de la solución de ADN. Incapacidad para inducir el daño necesario a través de la alta presión de la inyección es el culpable más probable falta constante de la expresión génica. Ratones deben ser cuidadosamente vigilados después de la cirugía para problemas de salud (ver tabla 1 para posibles problemas de salud con soluciones de acompañamiento y consulta con el equipo veterinario de la institución según sea necesario). Tras un periodo de formación inicial, la cirugía sí mismo debe tener menos de diez minutos. El período quirúrgico debe hacerse lo más corto posible operando en un ratón a la vez para evitar la desecación de los tejidos durante la cirugía. La mayoría de la inversión de tiempo en este procedimiento es debido a la inducción de y la recuperación de la anestesia ketamina/xilacina. Dos personal experimentado trabaja como un equipo debe esperar realizar cirugías hasta diez por día, con quince años como un máximo razonable.
Los investigadores deben esperar un bajo número de células de a tinción altamente positiva para el transgen dentro de los primeros días después de la inyección. Estas células positivas se traducirá en parches alrededor de áreas donde el fluido de inyección se infiltraron en el riñón (figura 3-D). Algunas partes del riñón será totalmente negativos para células transfected. Tales áreas negativas también se carece de eritrocitos y tienen histología completamente normal ya que la inyección no llegó a estas zonas. Tinción de protocolos y promotores debe optimizarse cuidadosamente para capturar la expresión génica. Los investigadores deben esperar que la célula tipos transfected será variable, los niveles de expresión de gene en el bajo porcentaje de células transfectadas son altos, y la localización de las proteínas dentro de las células no puede ser como se esperaba debido a altos niveles de expresión (figura 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56324/56324fig3.jpg"> Figura 3. Resultados de inyección hidrodinámica la pelvis renal en riñón específicos genes de luciferasa y TdTomato. (A) FVB semana 7-8 ratones machos viejos recibieron inyecciones de pelvis renal hidrodinámico de 20 μg de pTEeL, un plásmido de expresión mejorada luciferasa de luciérnaga de la promotora de EF-1α. Ratones 2, 3 y 5 también fueron inyectados con 20 μg de plásmido reportero fluorescente. (B) parcela punto del resplandor de los ratones que se muestra en (A). (C y D) Ratones se les dio ya sea entrega hidrodinámico buffer solo (C) o (D) microesferas fluorescentes (puntos verdes brillantes) y pEF1α-TdTomato expresando el reportero fluorescente rojo TdTomato de la promotora de EF-1α. Túbulos proximales fueron manchados por la aglutinina del tetragonolobus Lotus (LTA; verde) y células transfected aparecen después de la tinción con anticuerpos anti-RFP para amplificar la señal de TdTomato (rojo). Los núcleos se tiñen de DAPI (azul). Las imágenes se muestra en (C) y (D) son 13,2 mm x 17,5 mm. barras de Error representan el error estándar de la media. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56324/56324fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón

Este protocolo describe un método para inyectar ADN plásmido en el riñón de ratón a través de la pelvis renal para producir la expresión del transgen específicamente en el riñón.

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.4K vistas.  Tennessee Valley Healthcare System. Este protocolo describe un método para inyectar ADN plásmido en el riñón de ratón a través de la pelvis renal para producir la expresión del transgen específicamente en el riñón.

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biología

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only one-fourth of these patients achieving transplantation, there is a dire need for alternatives for those with failing organs. In order to decrease the harmful consequences of dialysis along with the overall healthcare costs it incurs, active investigation is ongoing in search of alternative solutions to organ transplantation. Implantable tissue-engineered renal cellular constructs are one such feasible approach to replacing lost renal functionality. Here, described for the first time, is the microdissection of murine kidneys for isolation of living corticomedullary renal segments. These segments are capable of rapid incorporation within scaffold-free endothelial-fibroblast constructs which may enable rapid connection with host vasculature once implanted. Adult mouse kidneys were procured from living donors, followed by stereoscope microdissection to obtain renal segments 200 - 300 &#181;m in diameter. Multiple renal constructs were fabricated using primary renal segments harvested from only one kidney. This method demonstrates a procedure which could salvage functional renal tissue from organs that would otherwise be discarded.

Tissue-engineered renal constructs provide a solution for the organ shortage and deleterious effects of dialysis. Here, we describe a protocol to micro dissect murine kidneys for isolation of cortico-medullary segments. These segments are implanted into scaffold-free cellular constructs, forming renal organoids.

Microdisección de segmentos de tejido Renal primaria y la incorporación con la tecnología de construcción de andamio-libre nuevo

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Bioingeniería

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

The administration of drugs for recovery of kidney function requires control of the localization and distribution of the therapeutic compound. Here, we describe in detail a simple technique for intrarenal delivery of drugs in rats. This procedure may be easily performed with no mortality and high reproducibility.

Intravascular de entrega de los productos biológicos para el riñón de rata

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Medicina

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal inflammation and fibrosis ultimately resulting in declining kidney function. Before improved clinical management and prevention of pyelonephritis can be instituted, a reliable animal model must be established in order to study the mechanisms of progression, recurrence, and therapeutic efficacy. The transurethral infection model closely mimics human pyelonephritis but exhibits considerable variation due to its reliance on urethral reflux to transport the bacteria to the kidney. Herein, a detailed surgical protocol for performing bacterial injections into the rat renal pelvis is provided and confirmed by non-invasive Magnetic Resonance Imaging (MRI). Using this protocol, animals receive direct exposure to a desired concentration of E. coli bacteria and can fully recover from the surgical procedure with adequate post-operative care. This facilitates subsequent longitudinal MRI assessments of the experimental animal models for comparison with saline (sham) controls. Using this direct delivery approach, the severity of infection is controllable and applicable for mechanistic studies of progression as well as development of novel treatment strategies.

Intrarenal Injection of Escherichia coli in a Rat Model of Pyelonephritis

This manuscript describes a rat surgical model of pyelonephritis using direct intra-renal infection by Escherichia coli into the renal pelvis. The experimental procedure can be utilized to study the pathogenesis of pyelonephritis as well as the associated inflammation and fibrosis.

Intrarrenal Inyección de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En un modelo de rata de pielonefritis

Pyelonephritis is a bacterial infection of the kidney and is most commonly caused by Escherichia coli. Recurrent infections can cause significant renal ...

Direct Drug Delivery to Kidney via the Renal Artery

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research field. Accumulation of drugs in certain organs may give rise to adverse and unwanted effects, depending on the nature of injectate. To minimize spillover and/or accumulation in other tissues, the herein described method directs the formulation into the renal artery bloodstream by inserting a catheter in the infra renal aorta, just below where it branches into the renal artery, resulting in the kidney as first reached organ and distributing of formulation throughout the kidney.
This manuscript provides a detailed description of the method, as well as its challenges and difficulties. It guides the experimenter to become skillful with this type of microsurgery that requires accuracy under sterile conditions. Speed is crucial for minimizing the ischemia and practicing the procedure will increase the chance of successful injections without adverse effects. By modulating the time between injection and reperfusion as well as the injected volume, the risk of spillover to other organs is mitigated. 
Note that this technique is suitable for single dosing strategies.

This manuscript describes a method for targeted delivery to a single kidney via a catheter placed in the infrarenal abdominal aorta in the mouse.

Entrega directa de medicamentos al riñón a través de la arteria renal

There is a need for directed injections to enable increased and specific renal exposure for efficient evaluation of drug targets in the renal research ...

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by destabilizing and inhibiting their translation in various kidney diseases. Therefore, alternation of miRNA expression by exogenous artificially synthesized miRNA mimics is a potentially useful treatment option for inhibiting the development of many kidney diseases. However, because serum RNAase immediately degrades systematically administered exogenous miRNA mimics in vivo, delivery of miRNA to the kidney remains a challenge. Therefore, vectors that can protect exogenous miRNA mimics from degradation by RNAase and significantly deliver them to the kidney are necessary. Many studies have used viral vectors to deliver exogenous miRNA mimics or inhibitors to the kidney. However, viral vectors may cause an interferon response and/or genetic instability. Therefore, the development of viral vectors is also a hurdle for the clinical use of exogenous miRNA mimics or inhibitors. To overcome these concerns regarding viral vectors, we developed a nonviral vector method to deliver miRNA mimics to the kidney using tail vein injection of polyethylenimine nanoparticles (PEI-NPs), which led to significant overexpression of target miRNAs in several mouse models of kidney disease.

Here, we deliver exogenous artificially synthesized miRNA mimics to the kidney via tail vein injection of a nonviral vector and polyethylenimine nanoparticles in several kidney disease mouse models. This led to significant overexpression of target miRNA in the kidney, resulting in inhibited progression of kidney disease in several mouse models.

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Estudio de la expresión de proteínas durante el desarrollo del cristalino de los pollos

Microinjection of Recombinant RCAS(A) Retrovirus into Embryonic Chicken Lens

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of similarity with the human lens. RCAS(A) is a replication-competent chicken retrovirus that infects dividing cells, which serves as a powerful tool to study the in situ expression and function of wild-type and mutant proteins during lens development by microinjection into the empty lumen of lens vesicle at early developmental stages, restricting its action to surrounding proliferating lens cells. Compared to other approaches, such as transgenic models and ex vivo cultures, the use of an RCAS(A) replication-competent avian retrovirus provides a highly effective, rapid, and customizable system to express exogenous proteins in chick embryos. Specifically, targeted gene transfer can be confined to proliferative lens fiber cells without the need for tissue-specific promoters. In this article, we will briefly overview the steps needed for recombinant retrovirus RCAS(A) preparation, provide a detailed, comprehensive overview of the microinjection procedure, and provide sample results of the technique.

Autor destacado: Investigación del desarrollo y la función del cristalino mediante la microinyección de retrovirus RCAS(A) en el cristalino de pollo embrionario 

This protocol paper describes the methodology of embryonic chicken lens microinjection of an RCAS(A) retrovirus as a tool for studying in situ function and expression of proteins during lens development.

Microinyección de retrovirus RCAS(A) recombinante en lentes embrionarias de pollo

Embryonic chicken (Gallus domesticus) is a well-established animal model for the study of lens development and physiology, given its high degree of ...

Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón

Resumen

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Capítulos en este video

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo

Microinyecciones intravenosa de larvas de pez cebra para el Estudio de la lesión renal aguda

Microdisección de segmentos de tejido Renal primaria y la incorporación con la tecnología de construcción de andamio-libre nuevo

Intravascular de entrega de los productos biológicos para el riñón de rata

Intrarrenal Inyección de

Entrega directa de medicamentos al riñón a través de la arteria renal

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

Microinyección de retrovirus RCAS(A) recombinante en lentes embrionarias de pollo

Microinyección de retrovirus RCAS(A) recombinante en lentes embrionarias de pollo