Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención NIDDK (K01DK092320) y la financiación de inicio del Departamento de Pediatría de la Universidad de la Escuela de Medicina de Texas McGovern.

El siguiente protocolo ha sido aprobado por la Universidad de Texas Health Science Center en el Centro de Houston para el Laboratorio de Medicina Animal Comité de Bienestar Animal, que sirve de Atención Institucional y el empleo Comisión (protocolo #: HSC-AWC-13-135). 1. Identificación y Selección de blastómeros para inyección de riñón de orientación <ol><li> Antes de generar embriones, utilice la Tabla normal de Xenopus Desarrollo 21 para entender la orientación de las divisiones celulares tempranos en el embrión. Como alternativa, los diagramas de acceso de las etapas tempranas del desarrollo de Xenopus en Xenbase 11. </li><li> Acceder a los mapas interactivos del destino celular de Xenopus en Xenbase 11 para seleccionar qué blastómeras serán objeto de microinyección. </li><li> Observe que el embrión de una sola célula tiene un polo animal pigmentación oscura y un polo vegetal, que es blanco y Yolky. Tenga en cuenta que una membrana protectora, conocido como el vitelino envelope, cubre el embrión. </li><li> Observe que la primera división se produce típicamente entre los lados izquierdo y derecho del embrión. Estas células contribuyen por igual al linaje pronephric. </li><li> Tenga en cuenta que la segunda escisión divide el dorsal y mitades ventral del embrión, lo que lleva a un embrión de 4 células. Las células dorsales son más pequeños y tienen menos pigmento que las células ventrales (Figura 2A y la Figura 3A). <ol><li> Identificar los blastómeros ventral (V; los grandes, células oscuras) en los lados izquierdo y derecho, que contribuyen más al riñón en desarrollo que el dorsal (D; luz, células pequeñas) blastómeras (Figura 2A). </li><li> Si la inyección en un embrión de 4 celdas, inyectar el blastómeras ventral izquierdo para apuntar el riñón izquierdo (Figura 3A y la Sección 3). </li></ol></li><li> La tercera escisión biseca los lados animales y vegetales, lo que resulta en un embrión de ocho células. En este punto, hay cuatro blastómeras animales [izquierda y derecha ventral(V1) y dorsal (D1)] y cuatro blastómeros vegetales [izquierda y derecha ventral (V2) y dorsal (D2)] (Figura 2B y la Figura 3B). <ol><li> Localizar los vegetales, blastómeras ventral (V2). Estos blastómeras contribuyen más al riñón en desarrollo cualquier otra célula en esta fase (Figura 2B). Para orientar el riñón izquierdo de un embrión de 8 células, inyectar en el blastómeras la izquierda V2 (Figura 3B y la Sección 3). </li></ol></li><li> Observe que las divisiones cuarta y quinta bisecan los blastómeros animales y vegetales. Dos progenie se generó a partir de cada blastómero, resultando en un embrión de 16 células. Las células llevan el nombre de su predecesor. Por ejemplo, el blastómero V2 de la etapa de 8 células da lugar a V2.1 y V2.2 progenie en la fase de 16 células (Figura 2C). La célula V2.2 en la fase de 16 células proporciona la mayoría de las células que contribuyen a la riñón en desarrollo. </li><li> Tenga en cuenta las divisiones sexto y séptimo dan como resultado un embry 32 célulaso. Una vez más, dos progenie se generó a partir de cada blastómero, nombrados después de su predecesor. Por ejemplo, el blastómero V2.2 desde la etapa 16 de células da lugar a V2.2.1 y V2.2.2 en la etapa de 32 células. Hay un sistema de nomenclatura alternativa en la etapa de 32 células en el que se identifican las células en cuatro filas como A, B, C, y D (de animal a vegetal), y en cuatro columnas como 1, 2, 3, y 4 ( de dorsal a ventral). Por lo tanto, la blastómeros V2.2.2, que contribuye en mayor medida a los pronefros en desarrollo, se llama C3 bajo este sistema de denominación alternativa (Figura 2D). </li></ol> 2. Preparación de embriones <ol><li> Preparar 50 ml de Dejelly solución (2% de cisteína, NaOH a pH 8,0). </li><li> Aislar ambos testículos de un solo rana macho de acuerdo con protocolos estándar 14. Coloque los testículos en un plato de 60 mm Petri llena de 10 ml de solución de testículos de almacenamiento (de Marc 1x Modificado Ringers [MMR; 0,1 M NaCl, KCl 2 mM, 1 mM MgSO 4, 2 mMCaCl 2, 5 mM de HEPES pH 8, EDTA 0,1 mM] 12, 1% de albúmina de suero bovino, 50 mg / ml de gentamicina). Almacenar los testículos a 4 ° C. Nota: Los testículos se pueden almacenar durante aproximadamente 7 a 10 días a 4 ° C, pero la eficiencia de fertilización disminuirá cuanto más tiempo los testículos se han almacenado. </li><li> Exprimir una rana hembra para obtener huevos de acuerdo con protocolos estándar 14. Recoge los huevos en una placa de Petri de 100 mm. Verter el exceso de agua. </li><li> Cortar ¼ de un testículo mientras está en solución de almacenamiento Testículos utilizando fórceps y una hoja de afeitar. La transferencia de la pieza de testículo a la placa de Petri que contiene los huevos. Ajustar el tamaño de la porción de testículo utilizado para contabilizar el tamaño de los testículos, el tiempo que el testículo se ha almacenado, y cuántos son los huevos para ser fertilizados. Generalmente utilizar ¼ a 1/3 de un testículo recién disecados para fertilizar un embrague de huevos. </li><li> Cortar la parte de testículo en trozos pequeños con fórceps y una hoja de afeitar. Agregar suficiente MMR 0.3x+ 30 mg / ml de gentamicina a la placa de Petri para cubrir los huevos. Agitar la MMR en el plato para mezclar. </li><li> Espere aproximadamente 30 minutos para la fertilización se lleve a cabo a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el hemisferio animal (por el lado pigmentada del embrión) se sentará en la parte superior del embrión tras la fecundación efectiva. A continuación, retire el MMR de la placa de Petri con una pipeta de transferencia. Agregar suficiente Solución Dejelly al plato para cubrir los embriones. </li><li> En los próximos minutos, agitar suavemente el plato de forma intermitente. agitación vigorosa del plato en este momento puede causar defectos de eje. &#160; La capa de gelatina en los embriones se disolverá, y los embriones se congregan en el centro del plato durante el revolver. Una vez que los embriones se tocan de cerca el uno al otro en el centro del plato, eliminar la solución Dejelly con una pipeta de transferencia. No deje embriones en la solución Dejelly durante más de 5 minutos, o los embriones pueden ser dañados. </li><li> Lavar los embriones dejellied 3 - 5 veces en 0.3xMMR + 30 mg / ml de gentamicina mediante el vertido de cuidado o de pipeteado de la triple vírica y llenar el plato con el nuevo MMR. No quite toda la MMR del plato, o los embriones pueden ser dañados. </li><li> Retire cualquier huevos no fertilizados o piezas de testículo de la placa de Petri con una pipeta de transferencia. </li><li> Incubar los embriones entre 14 y 22 ° C. Nota: Los embriones se cultivan a temperaturas más bajas se desarrollan más lentamente que los embriones cultivados a temperaturas más altas. El momento de las etapas de desarrollo se puede encontrar en Xenbase 22. <ol><li> Para espaciar su desarrollo, el lugar de la mitad de los embriones de una sola fertilización en una placa de Petri se mantuvo a 14 ° C, y la otra mitad de los embriones en una placa de Petri se mantuvo a 18 ° C. Esto permite utilizar dos conjuntos de inyecciones en 4 u 8 de células de células de embriones de una sola fertilización. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de soluciones de inyección y microinyección de embriones <ol><li> Preparar la solución inyectable que contiene 0,01ng / nl proteína unida a la membrana roja fluorescente (RFP-MEM) ARNm 9, mientras que los embriones se desarrollan para la etapa de 4 células o de 8 celdas. Almacenar la solución de inyección en hielo hasta que esté listo para inyectar. </li><li> Cargar un &quot;tubo capilar de vidrio de repuesto en un extractor de aguja, con la parte superior del tubo de reemplazo alineado con la parte superior de la caja de aguja extractora. Establecer el valor de calor No. 2 a 800, y el valor de extracción a 650. Pulse la tecla&quot; 7 tire &quot;botón para tirar de la aguja. Esto creará 2 agujas de un solo 7&quot; tubo capilar de vidrio. </li><li> Cortar la punta de una aguja desmenuzado con un par de pinzas Dumont. Nota: Después de sacar la aguja, la punta está sellada y debe ser cortada abierta. Cuanto más cerca de la punta de la aguja que se corta, menor es el diámetro será la punta de la aguja. Aunque el diámetro de la punta no afectará el volumen de inyección con el sistema de microinyección se utiliza aquí, una punta con un diámetro más grande es más probable que el daño del embrión. </li><li> Deslizar el mpinza icropipette en la parte posterior de la aguja. A continuación, deslice el anillo O grande agujero en la parte posterior de la aguja detrás de la pinza. </li><li> Llene la aguja con aceite mineral utilizando una aguja hipodérmica de calibre 27, con cuidado de no obtener burbujas de aire en la aguja. </li><li> Slip la aguja en el émbolo de la microinyector, con capacidad para la aguja en el agujero grande del espaciador de plástico blanco instalado en el émbolo. El émbolo debe tener una pequeña junta tórica más cercana al cuerpo del microinyector, seguido por el espaciador blanco, gran junta tórica agujero, y el collar. Asegure la aguja apretando la pinza. Tire suavemente de la aguja para asegurarse de que está bien sujeto. </li><li> Pulse y mantenga pulsado el botón de &quot;vacío&quot; en la caja de control microinyector hasta hay dos pitidos. </li><li> Pipetear 3 l de solución de inyección en un trozo de Parafilm. Inserte la punta de la aguja en el talón de la solución de inyección en el Parafilm. Mantenga pulsado el botón de &quot;relleno&quot; en la microinjector caja de control para dibujar la solución de inyección en la aguja. </li><li> Llenar un plato de 60 mm Petri forrada con 500 micras de poliéster de malla con 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Con cuidado, pipetear 20 - 30 4 células o 8 de células de embriones en el plato. </li><li> El uso de un bucle de pelo 14, manipular los embriones de modo que el blastómero a inyectar se enfrenta a la aguja. Para orientar el riñón izquierdo, alinee los embriones para que los blastómeros ventral izquierda de embriones de 4 células o los blastómeros V2 dejado de embriones de 8 células se enfrentan a la aguja. </li><li> Inyectar 10 nl de solución de inyección en el blastómero seleccionado de cada embrión en el plato. Nota: La malla en la parte inferior de la placa de Petri estabiliza los embriones y les impide laminados, lo que les permite ser inyectados sin el uso de un bucle de pelo para la estabilización. </li><li> Transferencia de embriones inyecta en los pocillos de una placa de cultivo que se han llenado con un 5% de Ficoll en 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina. Incubar el embrión inyectados a 16 ° C durante al menos una hora para permitir que los blastómeros inyectados para sanar. </li><li> La transferencia de los embriones curadas en pocillos de una nueva placa de cultivo que se han llenado con 0.3x MMR + 30 mg / ml de gentamicina por la etapa 9 (antes de la gastrulación). </li><li> Incubar los embriones a 14-22 ° C hasta que los embriones alcanzan etapa 38 a 40 21. </li></ol> 4. La fijación y la inmunotinción de embriones <ol><li> Preparar 50 ml de sulfato de MOPS / EGTA / magnesio / formaldehído Buffer [MEMFA: MOPS 100 mM (pH 7,4), EGTA 2 mM, MgSO mM 4, 3,7% (v / v) de formaldehído 1]. </li><li> Usando una pipeta de transferencia, puesto 10-20 etapa 38 - 40 embriones en un vial de vidrio. Añadir 10 l 5% benzocaína en 100% de etanol al vial vial y invertido para mezclar. Espere 10 minutos para anestesiar a los embriones. </li><li> Eliminar la MMR del vial usando una pipeta de vidrio. Si el procesamiento de múltiples viales al mismo tiempo, los viales se pueden mantener en posición vertical en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. </li><li> Con un tubo de vidrioTTE, llenar el vial con MEMFA. Colocar el vial en una plataforma oscilante en tres dimensiones durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar la MEMFA del vial usando una pipeta de vidrio. Llene el vial con metanol al 100%. Colocar el vial en una plataforma oscilante en tres dimensiones para 10 min a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado una vez más, y almacenar los embriones en 100% durante la noche metanol a -20 ° C. </li><li> Preparar 1x Phosphate Buffered Saline-albúmina de suero bovino-Triton (PBT): 1x PBS, 2 mg / ml de albúmina de suero bovino, 0,1% de Triton X-100. </li><li> Preparar la solución de anticuerpo primario: 1x PBT con 10% de suero de cabra con una dilución 1: 5 de ratón monoclonal 4A6 anticuerpo (para etiquetar las membranas de los túbulos intermedios, distales y de conexión 20), una dilución de uno y treinta minutos de anticuerpo monoclonal de ratón 3G8 (a lumen de la etiqueta de los túbulos proximales 20), y una dilución 1: 250 de anticuerpo policlonal de conejo RFP (para etiquetar el trazador MEM-RFP). Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar la secondasolución de anticuerpo ry: 1x PBT con suero de cabra al 10%, 1: 500 Alexa 488 cabra anti-ratón IgG (concentración de solución madre 2 mg / ml; a la etiqueta 4A6 y 3G8) y 1: 500 Alexa 555 IgG de cabra anti-conejo (Stock concentración 2 mg / ml; para etiquetar el trazador MEM-RFP). Almacenar a 4 ° C, que cubre el tubo de papel de aluminio para protegerlo de la luz. </li><li> Alternativamente, recoger los anticuerpos primarios y secundarios después de la tinción, y guardar a 4 ° C para su reutilización en futuros experimentos. Si el anticuerpo se va a guardar para su reutilización, añadir azida de sodio al 0,01%. </li><li> Immunostain los embriones utilizando protocolos establecidos 18. </li></ol> 5. La visualización de los embriones y los análisis del tejido pronephric Targeted <ol><li> Se tamizan los embriones inmunoteñidas para verificar que el blastómero correcta se inyectó mediante la visualización de la fluorescencia del trazador bajo un estereomicroscopio fluorescente a 1X (para ver embrión entero) y 5X (para ver riñón) ampliación. Coloque los embriones en una placa de vidrio de múltiples pocillos con el queLLS llenos de 1x PBT utilizando una pipeta de transferencia con la punta cortada. Manipular los embriones con un bucle de cabello. Usar sólo los embriones que tienen la co-inyección de trazador presente en el pronefros en el lado izquierdo del embrión (Figura 3C, F y la Figura 4C, F) para la sobreexpresión del gen o el análisis de caída. </li><li> Como alternativa, desactive los embriones de Murray en Clear (2 partes de benzoato de bencilo: 1 de alcohol de bencilo parte) mediante la colocación de los embriones en un vial de vidrio y llenar el vial de Murray con Claro. Visualizar los embriones utilizando una placa de vidrio. Nota: Claro de Murray es un disolvente orgánico, y debe ser manejado con cuidado. Use guantes, y sólo utilizar viales de vidrio y pipetas de Murray con Claro. </li><li> embriones se almacena a 4 ° C en 1x PBT durante 2 - 3 semanas. Para el almacenamiento a largo plazo de embriones, los embriones deshidratar por lavado dos veces en 100% de metanol a temperatura ambiente durante 10 min. Almacenar los embriones a -20 ° C en metanol al 100%. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chloride+conductance+channel+ClC-K+is+a+specific+marker+for+the+Xenopus+pronephric+distal+tubule+and+duct.">The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct.</a> Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).</li><li>Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Na+,+K+-ATPase+alpha+subunit+requires+gastrulation+in+the+Xenopus+embryo.">The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo.</a> Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical &amp; chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastomeres+show+differential+fate+changes+in+8-cell+Xenopus+laevis+embryos+that+are+rotated+90+degrees+before+the+first+cleavage.">Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage.</a> Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).</li><li>Colman, A., Drummond, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stability+and+movement+of+mRNA+in+Xenopus+oocytes+and+embryos.">The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos.</a> J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Orientación de los pronefros de desarrollo de embriones de Xenopus se basa en la identificación y la inyección de la blastómeros correcta. La inyección de la V2 de blastómeros de embriones de 8 células se dirige a los pronefros izquierda 18. Esto deja el pronefros derecho contralateral como control interno. Si morfolino desmontables o ARN sobreexpresión se utiliza para modificar el desarrollo del riñón, el pronefros derecho contralateral se pueden utilizar para comparar los efectos del gen ...

El riñón embrionario de Xenopus, el pronefros, es un buen modelo para estudiar el desarrollo del riñón y la enfermedad. Los embriones se desarrollan externamente, son de tamaño grande, se pueden producir en grandes cantidades, y son fácilmente manipulados mediante microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se conservan los genes que regulan el desarrollo del riñón en mamíferos y anfibios. Riñón de los mamíferos desarrollará en tres etapas: el pronefros, mesonefros y metanefros 1, mientras que los anfibios embrionarias tienen un pronefros y anfibios adultos tienen un metanefros. La unidad de filtrado básico de estas formas de riñón es la nefrona, y ambos mamíferos y anfibios requieren las mismas cascadas de señalización y eventos de inducción para someterse a nefrogénesis 2, 3. Los pronefros Xenopus contiene una sola nefrona compuesto por proximal, intermedia, distal y la conexión de los túbulos, y un glomus (análogo al glomérulo mamífero) 1, 4 a 6 (Figura 1 </strong&gt;). El único, gran nefrona presente en el pronefros de Xenopus lo hace adecuado como un modelo simple para el estudio de genes implicados en los procesos de desarrollo del riñón y enfermedades. Mapas del destino celular se han establecido los primeros embriones de Xenopus, y están libremente disponibles en línea en Xenbase 7-11. A continuación, describimos una técnica de microinyección de marcadores de linaje para orientar el pronefros Xenopus en desarrollo, aunque la misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tejidos como el corazón o los ojos. trazadores Lineage son etiquetas (incluidos colorantes vitales, dextranos marcados con fluorescencia, enzimas histoquímicamente detectables, y mRNA que codifican proteínas fluorescentes) que se pueden inyectar en un blastómero temprano, lo que permite la visualización de la progenie de esa célula durante el desarrollo. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, que codifica la membrana dirigida proteína fluorescente roja 12, como trazador de linaje. La tecnología orientada microinyeccióntécnicas para blastómeros individuales en embriones de 8 celdas de 4 y descritos aquí pueden ser utilizados para la inyección con morfolinos para derribar la expresión de genes, o con ARN exógeno que sobreexpresan un gen de interés. Inyectando en el blastómeras ventral, vegetal, principalmente se dirigirán los pronefros del embrión, dejando el pronefros contralateral como control del desarrollo. Co-inyección de un trazador verifica que se inyectó el blastómero correcta, y muestra que los tejidos en el embrión surgió de la blastómero inyectado, la verificación de la orientación de los pronefros. La inmunotinción de las pronefros permite la visualización de lo bien que han sido blanco de los túbulos pronéfricos. Sobreexpresión y desmontables efectos pueden ser marcados contra el lado contralateral del embrión, que sirve como un control de desarrollo, y se pueden utilizar para calcular el índice pronephric 13. La disponibilidad de mapas destino celular permite que esta técnica de microinyección concretas, que sirva a los tejidos diana OTHer que los pronefros y co-inyección de un trazador fluorescente permite la microinyección dirigida a cada tejido a ser verificada antes del análisis. Durante la microinyección de embriones, la temperatura de desarrollo debe ser regulada fuertemente, dado que la tasa de desarrollo de Xenopus es altamente dependiente de ella 14. Los embriones se incubaron a temperaturas más bajas (14 - 16 ° C) para las inyecciones de células 4- 8 y debido a que el tiempo de desarrollo se hace más lenta. A 22 ° C, el tiempo de desarrollo de la etapa 1 (1 célula) a la etapa 3 (4 celdas) es de aproximadamente 2 horas, mientras que a los 16 años el tiempo de desarrollo ° C a la etapa 3 es de aproximadamente 4 horas. Se tarda aproximadamente 15 minutos para el final de un embrión de 4 células a una de 8 celdas (etapa 4) de embriones a los 22 ° C, pero tarda aproximadamente 30 minutos a 16 ° C. Del mismo modo, a 22 ° C, sólo se tarda 30 minutos para que un embrión de 8 células para pasar a un embrión de 16 células (etapa 5). Este tiempo se aumentó a 45 minutos a 16 ° C. losrefore, es útil para disminuir la tasa de desarrollo de los embriones para permitir tiempo suficiente para que las inyecciones en la etapa de 8 células antes de que los embriones pasar a la fase de 16 células. Además, las temperaturas de crecimiento pueden modularse para acelerar o ralentizar el desarrollo embrionario hasta que el riñón ha desarrollado plenamente. La epidermis de renacuajo etapa embriones de Xenopus es relativamente transparente, permitiendo una fácil obtención de imágenes de los pronefros en desarrollo sin disección o limpieza del tejido 15. Debido a la relativa transparencia de los embriones de Xenopus, imágenes de células vivas es también factible 16,17. Todo el montaje inmunotinción para visualizar el pronefros es posible con anticuerpos establecidos que etiquetan los extremos proximal, intermedio y distal túbulos de conexión de fase de 38 - 40 embriones que permiten la evaluación del desarrollo pronephric después de la manipulación específica de la expresión génica en embriones de Xenopus 18-20.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin solution, 50 mg/mL</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>E737-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine, 99%+</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>52-90-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP525-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Fridge II</td>
			<td>Boekel</td>
			<td>260009</td>
			<td>Benchtop incubator for embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gap43-RFP plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine dextran, 10,000 M.W.</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1817</td>
			<td>Tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade, USP sterile purified water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7&#34; Drummond replacement tubes</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-203-G/XL</td>
			<td>Microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>For breaking microinjection needle tip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td>Microinjector.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, heavy</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CAS 8042-47-5</td>
			<td>Oil for needles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G monoject hypodermic needle</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881200508</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Luer-Lok syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td>For loading mineral oil into microinjection needle.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 micron polyester mesh</td>
			<td>Small Parts</td>
			<td>CMY-0800-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipets</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>67-42-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP531-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mm x 45 mm screw thread vial</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-339-25B</td>
			<td>For fixing, staining, and storing embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate</td>
			<td>Nest Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzocaine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>BE130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP661-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D mini rocker, model 135</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>57281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum, New Zealand origin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S227I-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 3G8 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label proximal tubules.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal 4A6 antibody</td>
			<td>European Xenopus Resource Centre</td>
			<td></td>
			<td>Primary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td>Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td>Secondary antibody to label distal tubule and duct.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21428</td>
			<td>Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 cavity spot plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>105862500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A396-500</td>
			<td>Optional - for clearing embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

technique to target microinjection to the developing xenopus kidney

El riñón embrionario de Xenopus laevis (rana), el pronefros, consta de una sola nefrona, y se puede utilizar como un modelo para la enfermedad renal. Embriones de Xenopus son grandes, desarrollar externamente, y pueden ser manipulados fácilmente por microinyección o procedimientos quirúrgicos. Además, se han establecido mapas de destino para los primeros embriones de Xenopus. microinyección dirigida en el blastómero individuo que finalmente dará lugar a un órgano o tejido de interés se puede utilizar para sobreexpresar selectivamente o derribar a la expresión de genes dentro de esta región restringida, la disminución de los efectos secundarios en el resto del embrión en desarrollo. En este protocolo, se describe la forma de utilizar los mapas de destino de Xenopus establecidos para apuntar el riñón en desarrollo Xenopus (el pronefros), a través de microinyección en blastómeros de embriones específicos de células y 8 4-. La inyección de trazadores linaje permite la verificación de la orientación específica de la inyección.Después de embriones se han desarrollado hasta la etapa 38 - 40, todo el montaje inmunotinción se utiliza para visualizar el desarrollo pronephric, y la contribución de las células diana a las pronefros se puede evaluar. La misma técnica se puede adaptar a dirigirse a otros tipos de tejidos además de las pronefros.

Microinyecciones de 4 y 8 células embriones de Xenopus con MEM-RFP ARNm muestran diferentes niveles de focalización para el pronefros. La figura 4 muestra la etapa 40 embriones con los patrones de expresión de ARNm MEM-RFP correctas. Los embriones fueron inyectados en el blastómero ventral izquierdo (Figura 4A), y clasifican para el patrón de expresión adecuado de MEM-RFP mRNA. Además de expresar MEM-RFP en el proximal, intermedio, distal...

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

technique-to-target-microinjection-to-the-developing-xenopus-kidney

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

11.1K vistas.  University of Texas McGovern Medical School. Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos. 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Uso del análisis confocal de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Encargado de investigar moduladores de Wnt y Shh morfógeno Degradados

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Injerto de Cuentas en desarrollo Miembros de embrión de pollo para identificar señales de transducción Pathways afectan la Expresión Génica

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

Un ensayo de transferencia de puntos de 5 mC cuantificando el nivel de metilación de ADN de la distredenciación de condrocitos<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Enfoque preciso de la ablación celular para modelar lesiones renales agudas en el desarrollo de pez cebra

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Generación de ratones modificados genéticamente a través de la microinyección de ovocitos

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

Evaluación del daño oxidativo en las células madre primarias del ratón/células madre en respuesta al daño ultravioleta-C (UV-C)

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...