La mitosis es la división de contenidos nucleares altamente organizada y controlada que se produce durante el ciclo celular. La mitosis es fundamental para el desarrollo adecuado del organismo y para reparación, mantenimiento y crecimiento de tejido. La interrupción de este proceso se ha indicado en algunas enfermedades, como cáncer. Imágenes de células vivas mediante microscopia fluorescente Time-lapse son uno de los métodos más comunes de estudiar la mitosis en los laboratorios de hoy.
En este video, nosotros presentar brevemente las fases de la mitosis y luego discutir consideraciones experimentales para la proyección de imagen de células vivas de este proceso celular. Aparecerá un protocolo de adquisición y análisis de datos detallados y a terminar con algunas aplicaciones de esta técnica.
Para entender mejor lo que buscan los científicos en estos experimentos de proyección de imagen, primero caminemos a través de las etapas de la mitosis.
El ciclo celular se describe el proceso general de división y crecimiento celular. La fase mitótica representa una porción corta de este ciclo, que puede dividirse además en seis fases: es decir, profase, Prometafase, metafase, anafase, telofase y citocinesis.
Durante la profase, el ADN se condensa en hermana cromátides Unidos por el centrómero. En el citoplasma, dos principales organelas denominadas centrosomas comienzan armar estructuras de microtúbulos, conocida comúnmente como fibras del huso, en un patrón de rueda.
La siguiente fase, Prometafase, ve la ruptura de la membrana nuclear y montaje de un complejo de proteínas, conocidas como los cinetocoros en los centrómeros. Esta fase también atestigua el acoplamiento de las fibras del huso con el cinetocoro.
En la metafase, los cromosomas se alinean en la placa de la metafase, un plano imaginario equidistante de los dos centrómeros. Durante la anafase, los cromosomas "rompen aparte" en el centrómero, con cada hermana cromátidas hermanas migran a los extremos opuestos de la célula. En telofase, el huso mitótico se desarma y la cromatina comienza a decondense. Finalmente, durante la citocinesis, por contracción de un anillo de actina/miosina que forma el "surco de la hendidura", la célula madre se divide en dos células hijas.
Con este entendimiento de la progresión mitótica, echemos un vistazo a las consideraciones prácticas para la visualización de este proceso usando proyección de imagen de células vivas.
La primera pregunta es: ¿cómo las células de etiqueta para poder visualizar la mitosis? Las "etiquetas" más comúnmente empleadas para este experimento son moléculas fluorescentes, que absorben la luz en una longitud de onda y emiten luz a otra longitud de onda.
A los ácidos nucleicos etiqueta, uno puede utilizar un célula permeable al ADN vinculante tinte, como Hoechst. Para el etiquetado de proteínas como microtúbulos, uno puede utilizar anticuerpos fluorescente etiquetados. Se trata generalmente de membrana impermeable, y por lo tanto, se emplean técnicas de microinyección para insertarlos en las muestras.
Otra estrategia es etiquetado genética, en el cual las células pueden ser manipuladas para expresar proteínas fluorescencia etiquetas etiqueta componentes involucrados en la mitosis, tales como los cromosomas. Cuando se trabaja con moléculas fluorescentes, se debe evitar la exposición excesiva a la luz para evitar el fotoblanqueo.
Elegir el microscopio adecuado es una decisión importante. Dos microscopios más utilizados son epifluorescente y confocal. Epifluorescente o microscopía de amplio campo pasa luz por el campo entero, mientras que la microscopia confocal utiliza láseres para luz de foco en puntos únicos.
Mientras que el microscopio epifluorescente es típicamente más barato, microscopios confocales se prefieren como iluminación del punto de la mayor resolución óptica, produciendo imágenes más claras. El único punto de iluminación también reduce la fototoxicidad, o aumenta la muerte celular causada por la exposición excesiva a la luz.
Ahora que hemos revisado algunas consideraciones experimentales, vamos a ver cómo realizar un experimento para visualizar la mitosis de la proyección de imagen vivo de la célula.
Las células se deben cultivar en platos de fondo de cristal o en cubreobjetos, que permite la mejor visualización de la mitosis. A continuación, sean mantenidas en del envioronment controlado hasta que se realiza el etiquetado. Como se mencionó anteriormente, la elección de la técnica de etiquetado depende de la experiencia a la mano. Después de etiquetar, coloque la placa de cultivo de células en la cámara especializada en el microscopio. Esto permite que la célula condiciones de cultivo que se mantendrán durante proyección de imagen.
A continuación, dependiendo de la molécula de etiquetado, establece las longitudes de onda de excitación y emisión en el microscopio. Para adquisición de datos, capturan de puntos de tiempo de configuración y posición de imagen. En este contexto, puntos del tiempo son las instancias en que se adquirirán imágenes para proporcionar una cobertura visual completa para todas las fases mitóticas. Posiciones se refieren a las coordenadas X-Y en la placa de cultivo. Además, para cada posición uno puede adquirir imágenes a diferentes profundidades de campo. Cada imagen representa un corte óptico en el eje z. Por lo tanto, se conocen colectivamente como pilas de Z. Después de introducir todos los parámetros, la configuración de prueba y relájate y disfruta!
Haber adquirido los datos Time-lapse, hay varias formas de presentarlo. Vamos a discutir algunas de estas maneras.
Un montaje es una de las maneras más comunes para presentar los datos de Time-lapse, donde varias imágenes están dispuestas en a rejilla-como patrón en base al tiempo. Claramente estos pueden mostrar progresión mitótica y permiten a los investigadores a determinar información como el tiempo invertido en las fases mitóticas individuales. Combinar estas imágenes secuencialmente para hacer una "película" puede ser una presentación más dinámica.
Por último, pueden combinarse Z-pilas obtenidas usando un microscopio confocal para presentar una recreación 3D de una muestra. Esto puede revelar con precisión las relaciones espaciales entre piezas de la maquinaria mitótica. Esto es importante ya que los componentes que se ven al lado de uno en 2D pueden ser separados en tres dimensiones.
Ahora que sabes cómo ejecutar un vivo de la célula experimento de la proyección de imagen, vamos a revisar algunas aplicaciones de esta técnica.
La mitosis es una parte esencial del desarrollo. Aquí, los investigadores aislaron cerebros embrionarios de ratón para observar la mitosis en las células progenitoras neuronales. División controlada de estas células es fundamental para la función y crecimiento cerebral adecuada. Tras aislamiento, cerebros se seccionaron con un vibratome, teñidas con tinte de unión a ácidos nucleicos permeable membrana y reflejada a través de microscopía confocal para visualizar claramente la mitosis de las células progenitoras neurales.
La reparación del ADN es un proceso celular esencial que participa en la división y crecimiento celular. En este experimento, los investigadores estudiaron una proteína de reparación del ADN que focos de formas, que son manchas punteadas creados en respuesta al daño del ADN. Resultados del análisis 3D e imágenes de células vivas destacan la localización de la proteína de reparación del ADN durante el proceso de división celular.
Por último, los investigadores estudian mitotic puestos de control, que son puntos de "pausa", donde se evalúan las condiciones celulares antes de que la división continúa. En la mitosis, el puesto de control de ensamblaje del huso o saco, asegura una conexión apropiada entre el huso mitótico y los cromosomas. Para estudiar esto, científicos microinyectados reactivos SAC-inducción en embriones de mosca transgénicos y analizan usando proyección de imagen de vivo de la célula mitosis. Los resultados muestran cinetocoros arrestados, demostrando las células que no progresan a través de mitosis.
Sólo has visto video de Zeus en proyección de imagen de células vivas de la mitosis. Tras una introducción a las etapas de la mitosis, este video presenta importantes técnicas de análisis de datos y consideraciones para la proyección de imagen de células vivas. Por último, se presentaron aplicaciones de esta técnica. En vivo la proyección de imagen de la célula substancialmente ha ayudado a los científicos en la comprensión de mitotic mecanismos relacionados con el desarrollo, el mantenimiento de tejido y la enfermedad. ¡Como siempre, gracias por ver!
