細胞分裂は細胞周期中に発生する核量の非常に整頓されていた、制御部門です。有糸分裂は適切な個体の開発、および組織の増殖、保守、および修理のために根本的に重要です。このプロセスの混乱は、がんのような特定の病気にされています。タイムラプス蛍光顕微鏡でライブセル イメージングは、ラボでの有糸分裂を調査する今日の最も一般的な方法の 1 つです。
このビデオで、有糸分裂の段階をご紹介し、この細胞プロセスの生きているセルイメージ投射の実験的考慮事項をについて説明します。詳細なデータ集録/解析プロトコルが表示され、私達はこの手法のいくつかのアプリケーションを包むでしょう。
科学者がこれらのイメージング実験で探しているものを理解、最初、有糸分裂の段階を通って歩きます。
細胞周期は、細胞の成長と分裂の全体的なプロセスを説明します。分裂期は六つの段階に分けることできますこのサイクルの 1 つの短い部分を表す: すなわち前期、prometaphase、中期、後期、終期、および細胞質分裂。
前期の間に DNA 凝縮して妹に染色分け体は動原体で参加しています。質で 2 つのキー中心微小管構造の組み立てを開始すると呼ばれる細胞小器官-紡錘繊維としてよく知られている-車輪のようなパターンで。
次の段階は、prometaphase、原子膜の破壊と、セントロメアで動原体として知られている蛋白質の複合体のアセンブリが表示されます。このフェーズは、動原体と紡錘繊維のリンケージを目撃します。
染色、染色体は、中期のプレートは、2 つのセントロメアから等距離にある仮想平面でラインアップします。後期では、間に染色体"離れて"破る個々 の妹、セントロメアで染色分け体セルの反対側に移行します。終期、紡錘を逆アセンブルし、クロマチンが脱凝縮したりし始めます。最後に、細胞質分裂時に-「胸の谷間ファロー」を形成するアクチン/ミオシン リングの収縮を介して — 親細胞が 2 つの娘細胞に分裂します。
このような細胞分裂の進行の理解、ライブセル イメージングを使用して、このプロセスを表示するための実用的な考慮事項を見てをみましょう。
求める最初の質問は: 有糸分裂を視覚化するために細胞をラベルする方法ですか?この実験のための最も一般的に使用される「タグ」は、1 つの波長の光を吸収し、別の波長の光を発する蛍光分子です。
核酸ラベルするために、1 つは細胞透過性 DNA 結合色素、ヘキストのようなを使用できます。微小管などタンパク質をラベルには、1 つは蛍光付けられた抗体を使用できます。これらは一般に不浸透性、膜で、サンプルにそれらを挿入するマイクロインジェクション技術を採用するため。
別の戦略は遺伝標識細胞分裂、染色体などに積極的に関与するコンポーネントのラベルの蛍光付けられた蛋白質を表現する細胞を操作ことができます。蛍光分子を操作する場合は、光退色を避けるために過度の暴露を避ける必要があります。
右の顕微鏡を選択は重要です。2 つの最も一般的に使用される顕微鏡、epifluorescent および共焦点。Epifluorescent または広視野顕微鏡共焦点顕微鏡による単一点に光を集中するレーザーを使用しますが、全体視野を光を渡します。
Epifluorescent 顕微鏡は通常より安く、ポイント照明提供増加の光学解像度、鮮明な画像を生成するので、共焦点顕微鏡が優先されます。照明の一点も、光毒性を軽減または光に過度の露出によって引き起こされる細胞死を増加します。
今ではいくつかの実験的考察を確認しましたところ、ライブセル イメージング有糸分裂を可視化する実験を実行する方法を見てみましょう。
ガラス底培養皿または coverslips 有糸分裂の最高の可視化を可能にする、細胞を培養する必要があります。次に、ラベル付けが実行されるまで制御された環境ではこのフィールドに維持する必要があります。前述のとおり、標識法の選択は、手での実験によって異なります。ラベル付け後に顕微鏡を専用チャンバーに細胞培養皿を配置します。これにより、細胞イメージング中維持する培養条件。
次に、ラベリングの分子によって顕微鏡を励起し、発光波長を設定します。データ集録のセットアップ時間ポイント、イメージの位置をキャプチャします。ここで、タイム ポイント、画像がすべて分裂段階のビジュアルを完全にカバーを提供するために取得するインスタンスです。位置は培養皿上の X と Y 座標を参照してください。さらに、各位置の 1 つはフィールドの異なる深さで画像を取得できます。各画像は、z 軸上の光学的スライスを表します。したがって、彼らは総称して Z スタックと呼ばれます。すべてのパラメーターを入力した後設定をテストして、後ろに座るし、お楽しみください!
時間経過のデータを取得、それを提示するいくつかの方法があります。これらの方法のいくつかを説明しましょう。
モンタージュは、時間に基づいてグリッドのようなパターンで複数の画像を配置する場所、時間経過のデータを表示する最も一般的な方法の 1 つです。これらは明らかに細胞分裂の進行を表示することができます、個々 の細胞分裂の段階で費やされた時間などの情報を確認する研究者を許可します。「映画」を作るため、シーケンシャルにこれらの画像を組み合わせることはより動的なプレゼンテーションをすることができます。
最後に、サンプルの 3 D レクリエーションを提示する共焦点顕微鏡を用いて Z スタックを結合できます。これは正確に細胞分裂の機械の部分間の空間関係を明らかにできます。2 D で隣同士に見えるコンポーネントが 3 次元で遠く離れて実際にありますので、これは重要です。
今、ライブセル イメージング実験を実行する方法を知っていると、この手法のいくつかのアプリケーションを確認してみましょう。
有糸分裂は開発の重要な部分です。ここでは、研究者はマウス萌芽期の神経前駆細胞の細胞分裂を観察する脳を分離しました。これらの細胞の制御部門は、適切な脳の発育や機能に不可欠です。次の分離、脳は神経前駆細胞の有糸分裂を明確に可視化する vibratome、膜透過性の核酸結合色素で染色し、共焦点顕微鏡によるイメージングを使用して断面でした。
DNA 修復は細胞増殖と分裂に関与する重要な細胞プロセスです。この実験では、研究者は、DNA 損傷に応答で作成したフォームの巣、点状のスポットである DNA 修復タンパク質を研究しました。生細胞イメージング、3 D 解析の結果には、細胞分裂の過程で DNA 修復タンパク質の局在化が強調表示されます。
最後に、研究者の研究部門を続ける前に細胞の条件が評価されます「一時停止」のポイントである分裂チェックポイント。有糸分裂、紡錘アセンブリ チェックポイントまたは嚢、有糸分裂紡錘体と染色体との間の適切な接続を保証します。これを調査するには、科学者は、遺伝子組換えハエの胚に SAC を誘発する試薬を microinjected、ライブセル イメージングを使用して有糸分裂を分析します。結果は、逮捕された体、有糸分裂を経て進行する発生しているセルを示すを表示します。
有糸分裂の生きているセルイメージ投射のゼウスのビデオを見てきただけ。有糸分裂の段階については、次は、このビデオは生きているセルイメージ投射の重要な考慮事項とデータ解析技術を導入しました。最後に、この手法の適用が発表されました。生きている細胞イメージングは大幅に開発、組織維持、病気に関連する細胞分裂のメカニズムの理解の科学者を助けています。いつも見てくれてありがとう!
