La mitose est la division des matières nucléaires hautement organisée et contrôlée qui survient au cours du cycle cellulaire. La mitose revêt une importance fondamentale pour assurer le bon développement organismal et pour la réparation, l’entretien et la croissance des tissus. Perturbation de ce processus ait été indiquée dans certaines maladies, comme le cancer. L’imagerie de cellules vivantes par microscopie fluorescente Time-lapse est l’une des méthodes plus courantes d’étudier la mitose chez laboratoires aujourd'hui.
Dans cette vidéo, nous allons présenter brièvement les phases de la mitose et traite ensuite des considérations expérimentales pour l’imagerie de cellules vivantes de ce processus cellulaire. Un protocole d’acquisition et d’analyse de données détaillées sera montré, et nous allons conclure avec quelques applications de cette technique.
Pour mieux comprendre ce que les scientifiques recherchent dans ces expériences d’imagerie, nous allons tout d’abord à pied à travers les étapes de la mitose.
Le cycle cellulaire décrit le processus général de division et la croissance cellulaire. La phase mitotique représente une courte portion de ce cycle, qui peut être subdivisée en six phases : à savoir la prophase prométaphase, métaphase, anaphase, télophase et cytocinèse.
Pendant la prophase, l’ADN se condense en soeur chromatides s’est joint au centromère. Dans le cytoplasme, deux principaux organites appelées centrosomes commencent à assembler les structures de microtubules — communément appelé axe fibres — dans un roue-comme le modèle.
La phase suivante, prométaphase, voit la rupture de la membrane nucléaire et assemblage d’un complexe de protéines, connues comme le kinétochore, au niveau des centromères. Cette phase voit aussi le lien entre les fibres du fuseau avec le kinétochore.
En métaphase, les chromosomes s’alignent à la plaque métaphasique, un plan imaginaire équidistant de deux centromères. Au cours de l’anaphase, chromosomes « briser » au centromère, avec soeur individuel chromatides migration vers les extrémités opposées de la cellule. En télophase, désassemble le fuseau mitotique et la chromatine commence à acétylations. Enfin, au cours de la cytokinèse — par l’intermédiaire de contraction d’une bague d’actine/myosine qui forme le « sillon de clivage » — la cellule-mère se divise en deux cellules filles.
Grâce à cette compréhension de la progression mitotique, nous allons jeter un regard sur les considérations d’ordre pratiques pour visualiser ce processus à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes.
La première question à se poser est : Comment faire pour marquer les cellules afin de visualiser la mitose ? Les « balises » plus couramment utilisés pour cette expérience sont les molécules fluorescentes, qui absorbent la lumière à une longueur d’onde et émettent de la lumière à une autre longueur d’onde.
Dans l’ordre aux acides nucléiques étiquette, on peut utiliser un colorant cellule de liaison des ADN perméable, comme Hoechst. Pour le marquage des protéines telles que les microtubules, on peut utiliser des anticorps fluorescent étiquetés. Ce sont généralement des membrane imperméable, et donc les techniques de microinjection sont utilisées pour les insérer dans des échantillons.
Une autre stratégie consiste à étiquetage génétique, dans laquelle les cellules peuvent être manipulées pour exprimer les protéines fluorescent étiquetées qui étiquette les composants activement lors de la mitose, tels que les chromosomes. Lorsque vous travaillez avec des molécules fluorescentes, il faut éviter une exposition excessive à la lumière pour éviter le photoblanchiment.
Choisir le microscope droit est une décision aussi importante. Les deux microscopes plus couramment utilisés sont épifluorescente et confocale. Épifluorescence ou microscopie en champ large passe lumière sur le champ de vision complet, tandis que la microscopie confocale utilise des lasers à la lumière de se concentrer sur les points uniques.
Tandis qu’épifluorescente microscopes sont généralement moins chers, microscopes confocaux sont préférés car l’éclairage point offre une résolution optique accrue, produisant des images plus claires. Le seul point d’éclairage a également réduit la phototoxicité, ou augmenté la mort cellulaire provoquée par une exposition excessive à la lumière.
Maintenant que nous avons passé en revue quelques aspects expérimentaux, nous allons voir comment faire pour exécuter une expérience de visualisation mitose d’imagerie de cellules vivantes.
Cellules doivent être cultivées sur des plats en verre bas ou sur les lamelles, qui permet la meilleure visualisation de la mitose. Ensuite, elles doivent être placées dans un environnement contrôlé jusqu'à ce que l’étiquetage est effectué. Comme mentionné précédemment, le choix de la technique d’étiquetage dépend de l’expérience à portée de main. Après marquage, posez le plat de la culture de cellules dans la chambre spécialisée sur le microscope. Cela permet de cellule doit être conservée pendant l’imagerie, les conditions de culture.
Ensuite, selon la molécule étiquetage, définir les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sur le microscope. D’acquisition de données, capturent des points dans le temps d’installation et la position de l’image. Dans ce contexte, les points dans le temps sont les instances au cours de laquelle des images seront acquises pour fournir une couverture visuelle complète pour tous les stades mitotiques. Postes de consulter les coordonnées X-Y sur la boîte de Pétri. En outre, pour chaque poste, on peut acquérir des images à différentes profondeurs de champ. Chaque image représente une tranche d’optique sur l’axe z. C’est pourquoi, ils sont collectivement connus comme Z-piles. Après avoir saisi tous les paramètres, les paramètres de test et puis asseyez-vous et profitez !
Ayant acquis les données time-lapse, il existe plusieurs façons de le présenter. Nous allons discuter de quelques-uns de ces moyens.
Un montage est l’une des façons plus courantes pour présenter les données time-lapse, où plusieurs images sont rangés dans un grille-comme le modèle basé sur le temps. Ces peuvent clairement voir la progression mitotique et permettent aux chercheurs de déterminer les informations comme le temps passé dans chaque phase mitotique. La combinaison de ces images dans l’ordre pour faire un « film » peut être une présentation plus dynamique.
Enfin, Z-piles obtenues à l’aide d’un microscope confocal peuvent être combinés pour présenter une reconstitution 3D d’un échantillon. Ceci peut indiquer avec précision les relations spatiales entre les pièces de l’appareil mitotique. Ceci est important car les composants qui ont l’air à côté de l’autre en 2D peuvent effectivement être très éloignés en trois dimensions.
Maintenant que vous savez comment faire pour exécuter une expérience d’imagerie de cellules vivantes, passons en revue quelques applications de cette technique.
La mitose est un élément essentiel du développement. Ici, les chercheurs ont isolé cerveaux embryonnaires de souris pour observer la mitose dans les cellules progénitrices neurales. Contrôlé division de ces cellules est essentielle à la fonction et la croissance du cerveau bon. Après isolement, cerveaux ont été sectionnées en utilisant un vibratome, souillées avec membrane perméable colorant acide nucléique-liaison et imagé par l’intermédiaire de la microscopie confocale à visualiser clairement la mitose de cellules progénitrices neurales.
Réparation de l’ADN est un processus cellulaire essentiel qui participe à la division et la croissance cellulaire. Dans cette expérience, les chercheurs ont étudié une protéine de réparation d’ADN que des foyers de formes, qui sont des taches ponctuées créés en réponse aux dommages à l’ADN. Résultats de l’analyse 3D et d’imagerie de cellules vivantes a mis en évidence la localisation de la protéine de réparation de l’ADN pendant tout le processus de division cellulaire.
Enfin, les chercheurs étudient des points de contrôle mitotiques, qui sont des points de « pause » où les conditions cellulaires sont évaluées avant la division continue. Dans la mitose, la broche Assemblée checkpoint ou SAC, assure une connexion correcte entre les chromosomes et le fuseau mitotique. Pour ce faire, les scientifiques micro SAC induisant des réactifs dans des embryons de mouche transgéniques et analysé mitose à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes. Les résultats montrent kinétochores arrêtées, montrant des cellules qui ne parviennent pas à progresser à travers la mitose.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur l’imagerie de cellules vivantes de la mitose. Après une introduction aux étapes de la mitose, cette vidéo présente les techniques d’analyse des données et considérations importantes pour l’imagerie de cellules vivantes. Enfin, les applications de cette technique ont été présentées. Vivre imagerie cellulaire a considérablement aidé les scientifiques à comprendre les mécanismes mitotiques relies au développement et l’entretien des tissus, la maladie. Comme toujours, Merci pour regarder !
