מיטוזה היא החלוקה המאורגנת והמבוקרת ביותר של תוכן גרעיני המתרחשת במהלך מחזור התא. מיטוזה חשובה ביסודו להתפתחות אורגניזם נכונה, ולצמיחת רקמות, תחזוקה ותיקון. הפרעה של תהליך זה צוין במחלות מסוימות, כמו סרטן. הדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בזמן היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לחקר מיטוזה במעבדות כיום.
בסרטון זה, נציג בקצרה את שלבי המיטוזה, ולאחר מכן נדון בשיקולים ניסיוניים להדמיית תאים חיים של תהליך תאי זה. פרוטוקול מפורט של רכישת נתונים וניתוח נתונים יוצג, ואנו נסיים עם כמה יישומים של טכניקה זו.
כדי להבין טוב יותר מה מדענים מחפשים בניסויי ההדמיה האלה, בואו נלך תחילה דרך שלבי המיטוזה.
מחזור התא מתאר את התהליך הכולל של צמיחת תאים וחלוקה. השלב המיטוטי מייצג חלק קצר אחד של מחזור זה, אשר ניתן לפרק עוד יותר לשישה שלבים: כלומר פרופאזה, פרומטפאזה, metaphase, אנאפז, טלופז, וציטוקינזיס.
במהלך ההקדמה, הדנ"א מתכנס לכרומטידים אחות המחוברים בסנטרומר. בציטופלזמה, שני אברונים מרכזיים המכונים צנטרוזומים מתחילים להרכיב מבני מיקרוטובול – הידועים בכינוי סיבי ציר – בתבנית דמוית גלגל.
השלב הבא, פרומטפאזה, רואה את פירוק הממברנה הגרעינית, והרכבה של קומפלקס של חלבונים, המכונה הקינטוצ'ור, בסנטרומרים. שלב זה גם עדים לחיבור של סיבי הציר עם הקינטוצ'ורה.
במטפאזה, הכרומוזומים מסתדרים בשורה בצלחת המטפאזה, מישור דמיוני השווה משני המרכזים. במהלך אנאפאזה, כרומוזומים "מתפרקים" בסנטרומר, כאשר כרומטידים אחות בודדים נודדים לקצוות הנגדיים של התא. בטלופוז, הציר המיטוטי מתפרק והכרומטין מתחיל להתפרק. לבסוף, במהלך ציטוקינזיס – באמצעות התכווצות של טבעת אקטין/מיוסין היוצרת את "תלם המחשוף" - תא האב מתחלק לשני תאי בת.
עם הבנה זו של התקדמות מיטוטית, בואו נסתכל על השיקולים המעשיים לצפייה בתהליך זה באמצעות הדמיה של תאים חיים.
השאלה הראשונה שיש לשאול היא: כיצד לתייג תאים כדי לדמיין מיטוזה? ה"תגים" הנפוצים ביותר לניסוי זה הם מולקולות פלואורסצנטיות, הסופגות אור אורך גל אחד ולפולטות אור אורך גל אחר.
על מנת לתייג חומצות גרעין, ניתן להשתמש בצבע כריכת DNA חדיר לתא, כמו Hoechst. לסימון חלבונים כגון מיקרוטובולים, ניתן להשתמש בנוגדנים מתויגים פלואורסצנטית. אלה הם בדרך כלל ממברנה בלתי חדיר, ולכן טכניקות microinjection משמשים כדי להכניס אותם לתוך דגימות.
אסטרטגיה נוספת היא תיוג גנטי, שבו תאים ניתן לתמרן לבטא חלבונים מתויגים פלואורסצנטית המתייגים רכיבים המעורבים באופן פעיל במיטוזה, כגון כרומוזומים. בעת עבודה עם מולקולות פלואורסצנטיות, עליך להימנע מחשיפה מוגזמת לאור כדי למנוע הלבנת תמונות.
בחירת המיקרוסקופ הנכון היא החלטה חשובה לא פחות. שני המיקרוסקופים הנפוצים ביותר הם אפיפלואורסצנטי וקונפוקל. מיקרוסקופיית אפיפלואורסצנטית או רחבה מעבירה אור על פני כל שדה הראייה, בעוד מיקרוסקופיה קונפוקלית משתמשת בלייזר כדי למקד את האור בנקודות בודדות.
בעוד מיקרוסקופים אפיפלואורסצנטיים הם בדרך כלל זולים יותר, מיקרוסקופים קונפוקליים עדיפים כמו תאורת הנקודה מספקת רזולוציה אופטית מוגברת, לייצר תמונות ברורות יותר. נקודת התאורה היחידה גם מפחיתה פוטוטוקסיות, או מוות מוגבר של תאים הנגרמת על ידי חשיפה מוגזמת לאור.
עכשיו שבדקנו כמה שיקולים ניסיוניים, בואו נראה איך להריץ ניסוי הדמיית תאים חי להדמיית מיטוזה.
תאים צריכים להיות מתורבתים על מנות תחתון זכוכית או על כיסויים, אשר מאפשר הדמיה הטובה ביותר של מיטוזה. לאחר מכן, הם צריכים להישמר בסביבה מבוקרת עד תיוג מבוצע. כאמור, הבחירה בטכניקת תיוג תלויה בניסוי העומד על הפרק. לאחר התיוג, מניחים את צלחת תרבית התא בתא המיוחד על המיקרוסקופ. הדבר מאפשר לשמור על תנאי תרבית התא במהלך ההדמיה.
לאחר מכן, בהתאם למולקולת התיוג, הגדר את אורכי הגל של העירור והפליטה על המיקרוסקופ. לרכישת נתונים, הגדרת נקודות זמן ומיקום ללכידת תמונה. בהקשר זה, נקודות זמן הן המופעים שבהם יירכשו תמונות כדי לספק כיסוי חזותי מלא לכל השלבים המיטוטיים. עמדות מתייחסות לקואורדינטות X-Y על מנת התרבות. בנוסף, עבור כל עמדה ניתן לרכוש תמונות במעמקי שדה שונים. כל תמונה מייצגת פרוסה אופטית בציר Z. לכן, הם ידועים באופן קולקטיבי בשם Z-ערימות. לאחר הזנת כל הפרמטרים, בדוק את ההגדרות ולאחר מכן לשבת וליהנות!
לאחר שרכש את הנתונים לשגות זמן, ישנן מספר דרכים להציג אותו. בוא נדבר על כמה מהדרכים האלה.
מונטאז' הוא אחת הדרכים הנפוצות ביותר להציג נתונים בזמן- לשגות, שבהן תמונות מרובות ערוות בתבנית דמוית רשת המבוססת על זמן. אלה יכולים להראות בבירור התקדמות מיטוטית, ולאפשר לחוקרים לקבוע מידע כגון זמן בילה בשלבים מיטוטיים בודדים. שילוב תמונות אלה ברצף כדי ליצור "סרט" יכול להיות מצגת דינמית יותר.
לבסוף, Z-ערימות המתקבל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל ניתן לשלב כדי להציג בילוי 3D של מדגם. זה יכול לחשוף במדויק יחסים מרחביים בין חלקים של המכונות המיטוטיות. זה חשוב שכן רכיבים שנראים אחד ליד השני ב 2D עשוי למעשה להיות רחוקים זה מזה בשלושה ממדים.
עכשיו שאתם יודעים איך להריץ ניסוי הדמיה של תאים חיים, בואו נסקור כמה יישומים של טכניקה זו.
מיטוזה היא חלק חיוני בהתפתחות. כאן, החוקרים בודדו מוחות עכבר עוברי כדי להתבונן במיטוזה בתאי אבות עצביים. חלוקה מבוקרת של תאים אלה היא קריטית לצמיחה ותפקוד תקין של המוח. לאחר הבידוד, המוחות נותחו באמצעות ויברטום, מוכתמים בצבע קשירת גרעין חדיר ממברנה, וצוו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמיין בבירור מיטוזה של תאי אב עצביים.
תיקון DNA הוא תהליך תאי קריטי המעורב בצמיחת תאים וחלוקה. בניסוי זה, החוקרים חקרו חלבון לתיקון DNA היוצר מוקדים, שהם כתמי דקירה שנוצרו בתגובה לנזק לדנ"א. תוצאות הדמיית תאים חיים וניתוח תלת-ממדי הדגישו את לוקליזציה של חלבון תיקון ה- DNA לאורך כל תהליך חלוקת התאים.
לבסוף, החוקרים חוקרים מחסומים מיטוטיים, שהם נקודות "הפסקה" שבהן מעריכים את התנאים התאיים לפני שהחלוקה נמשכת. במיטוזה, נקודת הביקורת של הרכבת הציר, או SAC, מבטיחה חיבור נכון בין הציר המיטוטי לבין הכרומוזומים. כדי לחקור זאת, מדענים מיקרו-אינטג'נטים הגורמים ל-SAC לעוברים מהונדסים של זבובים, וניתחו מיטוזה באמצעות הדמיית תאים חיים. התוצאות מראות קינטוצ'ורים שנעצרו, מדגים תאים שלא מצליחים להתקדם באמצעות מיטוזה.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על הדמיית תאים בשידור חי של מיטוזה. לאחר היכרות עם שלבי המיטוזה, וידאו זה הציג שיקולים חשובים וטכניקות ניתוח נתונים עבור הדמיית תאים חיים. לבסוף, יישומים של טכניקה זו הוצגו. הדמיית תאים חיים סייעה באופן משמעותי למדענים להבין מנגנונים מיוטיים הקשורים להתפתחות, תחזוקת רקמות ומחלות. כמו תמיד, תודה שצפית!
