Mitose ist die hoch organisierten und kontrollierten Aufteilung der nuklearen Inhalte, die während des Zellzyklus eintreten. Mitose ist von grundlegender Bedeutung für die richtige organismal Entwicklung und für Zellwachstum, Wartung und Reparatur. Störungen dieses Prozesses hat bei bestimmten Krankheiten wie Krebs angegeben. Live Cell Imaging per Zeitraffer Fluoreszenz-Mikroskopie ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden der Mitose in Laboren heute studieren.
In diesem Video wir die Phasen der Mitose kurz vorstellen, und dann diskutieren experimentelle Überlegungen für das live Cell Imaging cellular dabei. Eine detaillierte Erfassung und Analyse Datenprotokoll angezeigt werden, und wir werden mit wenigen Anwendungen dieser Technik einpacken.
Um besser zu verstehen, was Wissenschaftler in diesen bildgebenden Experimenten suchen, lassen Sie uns zuerst zu Fuß durch die Phasen der Mitose.
Der Zellzyklus beschreibt den gesamten Prozess der Zelle Wachstum und Teilung. Die mitotische Phase stellt einen kleinen Teil dieses Zyklus, der wiederum in sechs Phasen unterteilt werden kann: nämlich Prophase, prometaphase, Metaphase, Anaphase, Telophase und Cytokinese.
Während der Prophase, verdichtet die DNA zu Schwester Chromatiden trat an das Zentromer. Im Zytoplasma, zwei wichtige Organellen bezeichnet als Zentrosomen beginnen Montage Mikrotubuli Strukturen – allgemein bekannt als Spindelfasern — in einem Rad-Muster.
Die nächste Phase, prometaphase, sieht die Aufteilung der Kernmembran und Montage eines komplexen Proteine, bekannt als das Kinetochor, bei der Zentromere. Dieser Phase zeugen auch die Verknüpfung von den Spindelfasern mit der Kinetochor.
In Metaphase Line-up der Chromosomen in der Metaphase-Platte, eine imaginäre Ebene gleich weit entfernt von den beiden Zentromere. Während Anaphase, Chromosomen "brechen auseinander" an das Zentromer, mit einzelnen Schwester Chromatiden Migration auf den gegenüberliegenden Enden der Zelle. In der Telophase der mitotische Spindel zerlegt und das Chromatin beginnt zu decondense. Schließlich, während Zytokinese — über Kontraktion eines Aktin/Myosin-Rings, der die "Spaltung Furche" bildet — der Mutterzelle teilt sich in zwei Tochterzellen.
Mit diesem Verständnis der mitotischen Progression, werfen wir einen Blick auf die praktischen Erwägungen für die Anzeige von diesem Prozess mit live Cell Imaging.
Die erste Frage ist: wie man Label Zellen um Mitose sichtbar zu machen? Die am meisten verwendeten "Tags" für dieses Experiment sind fluoreszierende Moleküle, die Licht mit einer Wellenlänge absorbieren und emittieren Licht einer anderen Wellenlänge.
In Ordnung, Label Nukleinsäuren kann man einen Zelle durchlässigen DNA bindenden Farbstoff, wie Hoechst benutzen. Für die Kennzeichnung Proteine wie Mikrotubuli, können eine Eindringmittel tagged Antikörper. Diese sind in der Regel Membran undurchlässig, und daher Mikroinjektion Techniken werden eingesetzt, um sie in Muster einfügen.
Eine andere Strategie ist genetische Kennzeichnung, in denen Zellen lässt Eindringmittel tagged Proteine auszudrücken, die Komponenten aktiv in Mitose, wie Chromosomen beschriften. Beim Arbeiten mit fluoreszierenden Molekülen müssen Sie vermeiden, übermäßiger Lichteinwirkung Immunofluoreszenz zu vermeiden.
Die Wahl des richtigen Mikroskops ist eine ebenso wichtige Entscheidung. Die zwei am häufigsten verwendeten Mikroskope sind Epifluorescent und konfokale. Epifluorescent oder breite Nahfeldmikroskopie dringt Licht über das gesamte Sichtfeld, während konfokalen Mikroskopie Laser Licht fokussieren auf einzelne Punkte verwendet.
Während Epifluorescent Mikroskope in der Regel billiger sind, werden konfokale Mikroskope bevorzugt, da die Punkt-Beleuchtung erhöhte optischen Auflösung bietet, klarere Bilder produzieren. Der single Point of Beleuchtung auch Phototoxizität reduziert oder erhöht Zelltod verursacht durch übermäßige Belastung durch Licht.
Jetzt, wo wir einige experimentelle Überlegungen überprüft haben, mal sehen, wie ein live Cell imaging Experiment zur Visualisierung von Mitose laufen.
Zellen sollten auf unteren Glasschalen oder Deckgläsern, wodurch für die beste Darstellung der Mitose kultiviert werden. Als nächstes sollten sie in einer kontrollierten Envioronment gewartet werden, bis Kennzeichnung erfolgt. Wie bereits erwähnt, hängt die Wahl des Benennens Technik auf das Experiment zur hand. Nach Kennzeichnung, Ort der Zelle Kulturschale in die spezialisierte Kammer am Mikroskop. Dies ermöglicht Zelle Kulturbedingungen während der Aufnahme beibehalten werden.
Legen Sie anschließend je nach Kennzeichnung Moleküls, die Anregung und Emission Wellenlängen am Mikroskop. Für die Datenerfassung Einstellpunkte Zeit und Position für Bild erfassen. In diesem Zusammenhang sind Zeitpunkten die Instanzen auf die Bilder zur vollständigen visuellen Abdeckung für alle mitotischen Phasen erworben werden. Positionen beziehen sich auf die X / Y-Koordinaten in der Kulturschale. Darüber hinaus für jede Position kann man Bilder in unterschiedlichen Tiefen des Feldes erwerben. Jedes Bild stellt eine optische Scheibe auf der z-Achse. Daher sind sie gemeinsam als Z-Stapel bekannt. Nach Eingabe aller Parameter, die Einstellungen zu testen und dann lehnen Sie sich zurück und genießen Sie!
Die Time-Lapse Daten erworben haben, gibt es mehrere Möglichkeiten, um es zu präsentieren. Sprechen wir über ein paar von diesen Möglichkeiten.
Eine Montage ist eines der am häufigsten verwendeten Möglichkeiten, Time-Lapse Daten zu präsentieren, wo mehrere Bilder in einem gitterartigen Muster anhand der Zeit gekleidet gewesen. Diese können deutlich zeigen mitotischen Fortschreiten und erlauben Forschern, Informationen wie Zeit im einzelnen mitotischen Phasen zu ermitteln. Kombination dieser Bilder nacheinander um einen "Film" zu machen, kann eine dynamischere Präsentation sein.
Zu guter Letzt können Z-Stapel erhalten mit einem konfokalen Mikroskop kombiniert werden, um eine 3D Nachbildung einer Probe zu präsentieren. Dadurch kann räumliche Beziehungen zwischen der mitotischen Maschinen genau erkennbar. Dies ist wichtig, da die Komponenten, die neben einander in 2D schauen wirklich weit auseinander in drei Dimensionen sein können.
Nun, da Sie wissen, wie ein live Cell imaging Experiment ausführen, betrachten wir nun einige Anwendungen dieser Technik.
Mitose ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung. Hier, isolierten Forscher embryonalen Mäusegehirnen Mitose in neurale Vorläuferzellen zu beobachten. Kontrollierten Teilung dieser Zellen ist für richtige Gehirn Wachstum und Funktion von entscheidender Bedeutung. Nach Isolierung wurden Gehirne geschnitten mit einer Vibratome, gebeizt mit Membran durchlässig Nukleinsäure-Bindung Farbstoff und abgebildet über konfokalen Mikroskopie deutlich Mitose neurale Vorläuferzellen zu visualisieren.
DNA-Reparatur ist ein kritischer zellulärer Prozess, der in der Abteilung und Zellwachstum beteiligt ist. In diesem Experiment haben Forscher ein DNA-Reparatur-Protein, das Formen Herde, die punktförmige Flecken sind als Reaktion auf DNA-Schäden erstellt. Ergebnisse live Cell imaging und 3D Analyse hervorgehoben, die Lokalisierung von DNA-Reparatur-Protein während der Zellteilung.
Schließlich untersuchen Forscher mitotischen Prüfpunkte, die "pause" Punkte wo zelluläre Bedingungen geprüft werden, bevor die Division fortgesetzt wird. In Mitose, die Spindel Baugruppe Checkpoint oder SAC sorgt für die ordnungsgemäße Verbindung zwischen der mitotischen Spindel und die Chromosomen. Um dies zu untersuchen, Wissenschaftler mikroinjiziert SAC-induzierende Reagenzien in transgenen fliegen Embryonen und Mitose mit live Cell Imaging analysiert. Ergebnisse zeigen verhafteten Kinetochore, Zellen, die nicht durch Mitose Fortschritte demonstrieren.
Sie haben nur Jupiters Video auf live Cell Imaging der Mitose beobachtet. Nach einer Einführung in die Phasen der Mitose eingeführt dieses Video wichtige Überlegungen und Daten-Analyse-Techniken für das live Cell Imaging. Zu guter Letzt wurden die Anwendungen dieser Technik vorgestellt. Live Cell Imaging hat wesentlich dazu beigetragen, Wissenschaftler mitotische Mechanismen im Zusammenhang mit Entwicklung, Gewebe Wartung und Krankheit zu verstehen. Wie immer vielen Dank für das ansehen!
