El ensayo toxicológico de C.elegans es valioso. Este protocolo describe cómo tratar a C.elegans con productos químicos en una placa de 384 pozos, capturar videos y cuantificar fenotipos relacionados con toxicológicos. Este método podría ayudar a identificar y predecir la toxicidad aguda potencial de un producto químico.
Esta técnica cuantitativa ha sido desarrollada para analizar automáticamente los 33 parámetros de C.elegans después de 12 a 24 horas de tratamiento químico en una placa de 384 pozos con medio líquido. C.elegans es valioso como un buen modelo de evaluación rápida de la toxicidad para nuevos productos químicos. Como ratones, se puede aplicar a la toxicidad detección y pruebas de nuevos productos químicos, o el compuesto como la contaminación del agente aditivo alimentario, compuesto farmacéutico, medio ambiente compuesto exógeno, y así sucesivamente.
Lea el protocolo cuidadosamente y siempre siga el paso a paso, entonces usted será el bueno. La demostración visual es más fácil para el usuario ver el funcionamiento de cada paso y el resultado de la operación. Demostrando el procedimiento estarán Wenjing Zhang y Gaochao Han.
Son estudiantes graduados de mi laboratorio. Para empezar, realizar una prueba preliminar de letalidad del gusano para un nuevo producto químico, para determinar la dosis más alta, y la dosis más baja, que son la concentración mínima de 100% letalidad, y la concentración máxima de 100%no letalidad. Para este experimento, prepare siete concentraciones de gradiente de cloruro de cadmio.
Para preparar dos veces la solución acuosa concentrada más alta, disolver 92,8 miligramos de polvo sólido de cloruro de cadmio en un tubo centrífugo lleno de ocho mililitros de K medio. Vórtice para mezclar. Después de que el polvo se disuelva por completo, utilice una pipeta para llenar hasta 10 mililitros.
Preparar los otros niveles de concentración por dilución con medio K. En un banco súper limpio, usa una punta estéril para elegir una sola colonia de E.coli OP50 de la placa de rayas, y colócalo en el matraz con 100 mililitros de caldo LB para inocular la colonia. Cultivarlo durante la noche a 37 grados centígrados en la coctelera incubadora.
Vierta NGM en una placa Petri de plástico de 90 mililitros. Semilla cada placa con 300 microlitros de solución E.coli OP50. Incubar gusanos N2 en las placas NGM con OP50 a 20 grados Celsius durante unos 2 a 3 días, hasta que la mayoría de los gusanos hayan alcanzado la etapa adulta.
Con agua estéril, lave los gusanos gravídicos en un tubo de centrífuga cónica estéril de 15 mililitros para cosechar. Deje que los gusanos se calmen durante al menos 2 minutos. Aspirar el agua y añadir cinco mililitros de tampón de lejía.
Vórtice el tubo durante cinco minutos, y luego poner el tubo en una centrífuga para girar a una fuerza centrífuga relativa de 1300 durante 30 segundos para peletizar los huevos. Utilice una pipeta para aspirar el sobrenadante. Agregue cinco mililitros de agua esterilizada en el tubo para lavar los huevos, y vórtice el tubo durante cinco segundos.
Centrifugar el tubo durante 30 segundos, a una fuerza centrífuga relativa de 1300. Retire el sobrenadante y agregue cinco mililitros de agua esterilizada para lavar de nuevo. Pipetear los huevos en una nueva placa NGM con OP50.
Incubarlos a 20 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, los gusanos eclosionados llegan a la etapa L1. Después de aproximadamente 40 horas, los gusanos llegan a la etapa L4.
Con el medio K, lave los gusanos de la etapa L4 de las placas Petri en un tubo cónico estéril de 50 mililitros. Pipetear 50 microlitros del líquido de gusano desde el tubo hasta un portaobjetos de vidrio. Bajo un microscopio estéreo, utilice una pipeta para ajustar la concentración de gusanos a aproximadamente 40 animales por cada 100 microlitros de medio K.
Agregue 50 microlitros del medio preparado en cada pozo de la placa de 384 pozos. Estos gusanos de etapa L4 sincronizados están listos para seguir el tratamiento por productos químicos. Antes de añadir los productos químicos, coloque la placa de 384 pozos, con los gusanos sincronizados en el escenario automático, y configure la cámara de vídeo con el procedimiento de adquisición programado.
En la placa de 384 pozos, los gusanos se tratan con seis a siete dosis de cada producto químico individual, con ocho pozos paralelos que contienen 50 microlitros de la solución química de dos veces para cada dosis. Preparar al menos tres grupos de ocho pozos paralelos del medio K como control. Añadir 50 microlitros de la solución química dos veces para cada pozo.
Establezca la hora como punto de hora cero. A continuación, coloque la placa de 384 pozos en la coctelera de incubadora en 20 grados centígrados y 80 revoluciones por minuto. Después del tiempo deseado, retire la placa de la incubadora y transfiétela a la etapa automática.
Tome videos de cada pozo de la placa, a las 12 horas, y a las 24 horas para comprobar los fenotipos de los gusanos. Para empezar a procesar el vídeo experimental, transfiera los archivos de vídeo al ordenador. A través de la interfaz gráfica de usuario, haga clic en el botón Seleccionar para elegir el directorio de imágenes de origen.
Agregue el directorio de resultados intermedios. Los resultados medios incluyen las imágenes segmentadas, que son útiles para la observación visual de las imágenes procesadas. Agregue el directorio de resultados final en la interfaz.
Establezca el parámetro de tamaño de gusano promedio en 2.000, en el cuadro de texto Tamaño de gusano de la interfaz. Establezca el umbral de la relación movida en 0,93 en la interfaz. Haga clic en el botón Analizar para iniciar el procesamiento de imágenes.
El programa desarrollado puede reconocer gusanos y cuantificar fenotipos automáticamente. En este experimento, se cuantificaron 33 características distintas para el tratamiento con cloruro de cadmio en tres puntos de tiempo, hora cero, 12 horas y 24 horas. Las imágenes experimentales muestran que los gusanos murieron más rápidamente a medida que aumentaba la concentración química.
Al principio, no había diferencia significativa entre el control y los tratamientos químicos. Después de 12 horas de tratamiento, los gusanos tratados con una alta concentración se volvieron más rectos y menos curvados que en concentraciones más bajas o en grupos de control. La longitud del eje principal de la región cubierta del cuerpo del gusano aumentó a medida que aumentaba el tiempo.
También hay una tendencia de gradiente de concentraciones químicas más bajas a más altas tanto en el eje principal como en la longitud del eje menor. La motilidad de los gusanos, basada en el área y la relación, mostró patrones similares. No se observó ninguna diferencia significativa al principio.
Con el paso del tiempo, los gusanos del grupo de control mostraron una disminución estable de la motilidad. Después de 12 y 24 horas, los gusanos que fueron tratados con cloruro de cadmio mostraron diferencias significativas en la motilidad, en comparación con los grupos de control. Además, los gusanos bajo tratamientos de mayor concentración mostraron una motilidad más débil, en comparación con los gusanos bajo tratamientos de menor concentración.
En resumen, esta técnica allana una forma de evaluación rápida de la toxicidad en múltiples áreas. Investigadores que podrían aplicar el método al análisis de emergencia de toxicidad en la toxicosis transmitida por los alimentos, la evaluación de la seguridad de los compuestos farmacéuticos, así como el cribado de toxicidad aguda, y la detección de nuevos productos químicos, y los compuestos exógenos ambientales. El cloruro de cadmio es una sustancia tóxica baja.
Por favor, use guantes y una máscara durante su manejo, y siga las instrucciones de funcionamiento.
