Name: synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
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Los autores desean agradecer al Sr. Michael Connolly y Dr. Ronald Zuckermann (la fundición Molecular, laboratorio nacional Lawrence Berkeley) ayuda de la técnica en la síntesis de peptoid. Reconocemos el apoyo de la National Science Foundation (-1301505). Todos los experimentos de espectrometría de masas se llevaron a cabo en las instalaciones de espectrometría de masa química en la Universidad del Pacífico.

1. síntesis de Peptoid
Nota: La síntesis comienza con la activación de la resina por la hinchazón de la resina y eliminar el grupo de protección. Esto es seguido por crecimiento de la cadena de peptoid en la resina a través de la repetición de ciclos de la adición de monómero. El primer monómero juntado a la resina es el residuo c-terminal. El peptoid es alargado de la terminal C a la N-terminal. Una vez lograda la secuencia deseada de la peptoid, la resina es troceada apagado y se purifica el producto peptoid.
<ol><li>Preparación de los reactivos Nota: Los reactivos líquidos se miden utilizando una micropipeta y los reactivos sólidos se miden utilizando una balanza analítica.<ol>
<li>6,2 ml de N, N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) y 43,8 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) para preparar un 0,8 M de solución DIC/DMF.</li>
		<li>Disolver 5,56 g de BMA en 50,0 mL de DMF para preparar una solución de M BMA/DMF 0,8.</li>
		<li>Mezclar 2 mL de piperidina (Pip) y 8 mL de DMF para lograr la solución al 20% Pip/DMF.</li>
		<li>Disolver 1.9 mL de Npe a 13,1 mL de DMF para alcanzar 1.0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Disolver 1,3 mL de Nme en 13,7 mL DMF para alcanzar 1.0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Disolver 0,32 mL de Nae en 2 mL de DMF para alcanzar 1.0 M Nae/DMF. PRECAUCIÓN: La mayoría de los productos químicos utilizados en la síntesis es peligrosa. Ácido trifluoroacético (TFA), DIC, Pip y BMA son peligrosos para la piel, ojos y vías respiratorias. DMF y diclorometano (DCM) son sospechosos cancerígenos. Todas las reacciones deben realizarse en una campana de humos y debe usarse equipo de protección personal. Por favor revise la hoja de datos de seguridad del material (MSDS) de todos los productos químicos utilizados en la síntesis.</li>
	</ol></li>
	<li>Activación de resina
	<ol>
<li>Mida 84 mg de resina amida de pista (resina, 0.047 mmol, carga de 0,56 mmol/g) y añadir a un recipiente de la reacción de fase sólida polipropileno de 10 mL. Inserte el émbolo en el recipiente.</li>
		<li>Añadir 2 mL de DMF en el recipiente de la reacción y tapa el recipiente con una tapa de presión. Coloque el vaso en un agitador y agitar el recipiente a temperatura ambiente en un ángulo de movimiento de aproximadamente 12 grados y 385 oscilaciones/min durante 30 min drenaje la solución a un recipiente retirar la tapa y empujando el émbolo del recipiente de reacción.</li>
		<li>Añadir 2 mL de solución al 20% Pip/DMF al recipiente y la tapa el recipiente. Agitar en el agitador por 2 min y drenar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Añadir 2 mL de solución al 20% Pip/DMF al recipiente, el recipiente, la tapa y agitar a temperatura ambiente durante 12 min., retire la tapa y vaciar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Lavar la resina mediante la adición de 1 mL de DMF, tapado el recipiente y agitar el recipiente durante 1 minuto sacar el tapón y vaciar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina con DMF para 4 veces adicionales.</li>
	</ol></li>
	<li>Además del monómero y la acetilación N-terminal Nota: Cada ciclo de la adición de monómero implica desplazamiento, bromoacetylation y reacción de dos pasos.<ol>
<li>Llevar a cabo el primer ciclo de adición de monómero para formar Nme-resina.</li>
		<li>Llevar a cabo una reacción de bromoacetylation. Mezclar 1 mL de solución M BMA/DMF 0,8 y 1 mL de 0,8 M DIC/DMF solución en un vaso de precipitados. Transferir la mezcla a un recipiente de reacción que contienen resina y tapa el recipiente. Coloque el vaso en el agitador y agitar a temperatura ambiente durante 20 minutos Retire la tapa y vaciar la solución para el depósito de residuos.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DMF, tapado el recipiente, agitar durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución. Lavar la resina con DCM una vez más y luego lavar dos veces con DMF.</li>
		<li>Llevar a cabo una reacción de desplazamiento. Añadir 1 mL de 1,0 solución de M Nme/DMF, tapa el recipiente, agitar el recipiente a temperatura ambiente durante 60 minutos Retire la tapa y vaciar la solución empujando el émbolo.</li>
		<li>Lavar la resina agregando 1 mL DMF, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina en 1 mL de DCM, agitando durante 1 minuto, y drenar la solución. Lave el DCM una vez más, seguido de lavado dos veces con DMF.</li>
		<li>Repetir ciclos de adición de monómero de pasos 1.3.2 a 1.3.5 formar Nae-(Npe-Nme)4-resina. Cuando repitiendo el paso de la reacción de desplazamiento (1.3.4), utilice una solución de Amina específicos según la secuencia peptoid. Nota: La cadena peptoid es alargada de la terminal C a la N-terminal con el residuo c-terminal a la resina.</li>
		<li>Realizar la acetilación N-terminal para formar Ac-Nae-(Npe-Nme)4-resina.</li>
		<li>Anhídrido acético Mix 92 μl of, 43.5 μl de N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) y 2 mL de DMF en un vaso de precipitados para hacer aproximadamente 2 mL de la acetilación de cóctel.</li>
		<li>Añadir 2 mL de acetilación cóctel al recipiente que contiene resina, tapa el recipiente y agitar a temperatura ambiente por 60 min., retire la tapa y vaciar la solución empujando el émbolo.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DMF, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución. Repita el lavado de la resina con DCM una vez más, luego lavado con DMF dos veces más.</li>
		<li>Lavar la resina por agregar 1 mL de DCM, agitando el recipiente durante 1 min y drenar la solución empujando el émbolo. Repetir el lavado dos veces con DCM. Retire la tapa y deje que la resina seque al aire en el recipiente de reacción durante 10 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Escote y purificación
	<ol>
<li>Mezclar 3,8 mL de TFA, 100 μl de Triisopropilsilano (consejos) y 100 μl de grado HPLC H2O en un vaso de precipitados para hacer 4 mL de escote cocktail.</li>
		<li>Añadir 4 mL de recién hechos escote cóctel al recipiente que contiene la resina, tapa el recipiente y agitar a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
		<li>Retire la tapa y recoger la solución de filtrado en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL. Añadir 1 mL de TFA al recipiente, tápalo y agitar durante 1 minuto recoge la solución de filtrado en el mismo tubo de centrífuga.</li>
		<li>Soplando en una corriente de gas nitrógeno suavemente hasta aproximadamente 1 mL solución viscosa se deja evaporar la TFA.</li>
		<li>Añadir 15 mL de éter etílico a la solución restante, tapa el tubo de centrífuga e incube en un congelador de-20 ° C por 2 h para toda la noche. El peptoid crudo precipita como sólido blanco.</li>
		<li>Pellet sólido utilizando una centrífuga a 4.427 x g durante 10 minutos Retire la tapa del tubo de centrífuga y decantar el éter dietílico en un vaso de precipitados con cuidado sin perder el sólido. PRECAUCIÓN: el éter dietílico es un solvente orgánico inflamable. Utilice una centrifugadora seguro de éter dietílico.</li>
		<li>Lave el sólido añadiendo 10 mL de éter dietílico helado en la centrifugadora del tubo que contiene el sólido, tapado el tubo y colocarlo en la centrífuga. Realizar la centrifugación a 4.427 x g durante 10 minutos Retire la centrifugadora del tubo de la centrífuga y decantar el éter dietílico en un vaso de precipitados con cuidado sin perder el sólido.</li>
		<li>Secar el sólido soplando suavemente en una corriente de gas nitrógeno.</li>
		<li>Añadir 10 mL de grado HPLC H2O para disolver el sólido seco. Pasar la solución a través de un filtro de jeringa de nylon con tamaño de poro de 0.45 μm y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL previamente ponderada.</li>
		<li>Cáscara de congelar la solución colocando y rotando el tubo de centrífuga que contiene la solución de peptoid en 12 onzas, doble-apilan ampliada poliestireno taza 1/3 lleno con nitrógeno líquido. Liofilizar la solución congelada durante la noche para producir sólido peptoid.</li>
		<li>Repetir una vez más la liofilización disolviendo el sólido peptoid en 10 mL de grado HPLC H2O, shell de congelación en nitrógeno líquido y 1.llenar durante la noche. El peptoid resultante es lo suficientemente puro para análisis de la secuencia por espectrometría de masas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS medidas y análisis de la secuencia
Nota: El experimento de MS/MS se realiza en un espectrómetro de masas triple cuadrupolo acoplado a una fuente de electrospray (ESI) de ionización. Recolección de datos se controla mediante el software de adquisición de datos junto con el instrumento. El procedimiento general incluye 1) realizar el experimento de espectrometría de masas de análisis completo y registrar el espectro de masas, 2) realizar el CID MS/MS experimentar y registrar el espectro MS/MS y 3) que compararon los datos espectrales MS/MS con teóricos esquema de fragmentación predicho basado en la característica estructural de la peptoid.
<ol><li>Preparación de la solución de la muestra
	<ol>
<li>Pesar 1.0-2.0 mg sólido peptoid en un frasco de vidrio de 3 a 5 mL. Añadir 1 mL de mezcla solvente de acetonitrilo y agua (ACN/H2O, 1:1, v/v) para disolver el peptoid. Esto da la solución de muestra común con una concentración de 10-3 M.</li>
		<li>Transferir 20 μl de la solución madre a un tubo de centrífuga de 1.5 mL y añadir 1 mL de mezcla solvente de ACN/H2O para dar una solución muestra diluida de cerca de 10-5 M.</li>
		<li>Eliminar las posibles partículas insolubles en la solución muestra diluida por la realización de centrifugación a 4.427 x g por 3 minutos transferir unos 700 μl de la parte superior de la solución a otra centrífuga de 1,5 mL del tubo para hacer el peptoid MS solución de trabajo con concentración de 10-5 M.</li>
		<li>Ajustar la concentración de la solución de trabajo de MS basada en la intensidad de la señal observada durante las mediciones de espectrometría de masas.</li>
		<li>Una manera alternativa para eliminar las posibles partículas insolubles en la solución muestra diluida es la solución de la muestra a través de un filtro de jeringa 0.20 μm y recoger el filtrado en un tubo de centrífuga de 1.5 mL para hacer la peptoid MS solución de trabajo de alrededor de 10-5 M.</li>
	</ol></li>
	<li>Grabación de espectros de masas
	<ol>
<li>Recorren solvente mezclado de ACN/H2O (1:1, v/v) de la fuente (ESI) de la ionización de electrospray y configurar el instrumento en un ion positivo estándar, modo de barrido completo de espectrometría de masas con una gama de la relación masa / carga (m/z) de 100-1500. Nota: Parámetros de funcionamiento típicos: Tensión de la aguja ESI, 5 kV Tensión capilar, 40 V Secado temperatura del gas (nitrógeno), 200 ° C.</li>
		<li>Agregar aproximadamente 300 μL de solución de trabajo de peptoid MS (10-5 M) en una jeringa de 1 mL o 500 μl y conectar la jeringa a la entrada ESI usando tubos de capilares de poliéter éter cetona (PEEK). Coloque la jeringa en la bomba de la jeringuilla y el caudal en 10 μl/min para infundir la solución de muestra en la entrada ESI.</li>
		<li>Encienda la tensión de la aguja ESI para activar el proceso ESI y luego encienda el detector. Configurar la pantalla en modo de perfil y la gama de m/z de 100-1.500. Ver un perfil de espectro de masas mostrado en la ventana de perfil. El pico en m/z 1.265 (aparece como m/z de 1,264.6) corresponde a la peptoid de peptoid ion o protonada.</li>
		<li>Registrar el espectro de MS por 2 min. En la "ventana de método", utilizar 2 min como el "tiempo de ejecución". Abrir la ventana de grabación rellenar un nombre de archivo adecuado y empezar a grabar el espectro. Nota: El espectro de masas resultante se muestra en la figura 3.</li>
		<li>Optimizar la intensidad del pico en m/z de 1.265. La gama de m/z a 1.150-1.350 y ajuste la tensión capilar mientras se visualiza la intensidad de pico en mV que se muestra en la ventana de perfil. Por ejemplo, aumentar la tensión capilar a 50 V o más y ver el cambio de la intensidad de pico. La intensidad de pico óptima es alrededor de 150-200 mV. Nota: Ajuste la tensión capilar puede cambiar significativamente la abundancia de ciertos iones. Aumento de la tensión capilar puede aumentar la intensidad del ion del peptoid. Sin embargo, un alto voltaje capilar también puede inducir la disociación del ion peptoid en la fuente de iones y disminuir la intensidad observada. Ajustar la temperatura del gas de secado puede aumentar la intensidad del pico en m/z 1.265, pero es menos efectivo que el ajuste de la tensión capilar. Si el pico a m/z 1.265 no alcanza la intensidad óptima, ajuste la concentración de muestra (o ejemplo, doble la concentración de la solución de trabajo de MS).</li>
		<li>Cambiar el instrumento en el modo MS/MS. El ion precursor en m/z 1.265 y MS/MS total rango en m/z de 100-1.400. En la "ventana de método", utilizar m/z 1.265 como la "Misa primera Q1" y deje en blanco el "Q1 última misa". Uso de m/z 100 como la "Primera Misa de la Q3" y m/z 1.400 como la Misa "Q3 pasado." Nota: En el modo MS/MS, el primer cuadrupolo (Q1) funciones como filtro masa para aislar el peptoid ion como el ion del precursor, la segunda unidad de cuadrupolo (Q2) es una celda de colisión y el tercer cuadrupolo (Q3) funciones como un analizador de masas.</li>
		<li>Sistema de presión de la energía de colisión en 40 eV y el gas de colisión (argón, en este caso) en 1.5 mTorr.</li>
		<li>Ver un perfil de espectro de masas muestra en la ventana de perfil. El pico en m/z de 1.265 corresponde al ion peptoid, y los picos con valores más bajos de m/z representan los fragmentos del peptoid ion.</li>
		<li>Ajustar la energía de la colisión para optimizar la visualización del espectro de fragmentación. Por ejemplo, aumentar la energía de la colisión a 45 eV y ver el cambio del perfil del espectro. Nota: en general, aumentando la energía de colisión realzará la abundancia de los iones del fragmento y reducir la abundancia del ion del peptoid. Aumento de la presión de gas de colisión también mejorará la abundancia de los iones del fragmento. PRECAUCIÓN: No aumentar la presión del gas de colisión más allá de 2 mTorr.</li>
		<li>Registrar el espectro MS/MS por 2 min. En la "ventana de método", utilizar 2 min como el "tiempo de ejecución". Abrir la ventana de grabación rellenar un nombre de archivo adecuado y empezar a grabar el espectro.</li>
		<li>Repetir 1 - 2 veces la grabación.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de la secuencia de Peptoid Nota: Bajo la condición de CID, el ion peptoid fragmentaría en los enlaces de la amida a lo largo de la columna vertebral de peptoid para producir una serie de fragmentos N-terminal llamado B-iones y una serie de fragmentos c-terminal llamadas iones Y<ol>
<li>Dibujar la estructura química de la peptoid acetilado colocando el N-terminal en el lado izquierdo y el c-terminal a la derecha y dibuja una línea discontinua en cada enlace amida para generar un esquema de fragmentación como se muestra en la Figura 2a. Dibujar un protón con un círculo de puntos para indicar que el portador de la carga. A partir del lado izquierdo de la estructura, colocar etiquetas en las líneas punteadas para indicar los fragmentos N-terminal como B1, B2, B8. A partir de la derecha, coloque las etiquetas en las líneas discontinuas para indicar los fragmentos c-terminal Y1, Y2, Y8. Nota: Un software de dibujo químico puede ser utilizado para dibujar la estructura de peptoid.</li>
		<li>Imaginar la fragmentación en el enlace de amidath 4 del lado izquierdo y dibujar las estructuras del fragmento N-terminal y el fragmento c-terminal con cargos formales adecuados, como se muestra en la figura 2b. Coloque la etiqueta de B4 en el fragmento N-terminal y coloque la etiqueta de Y5 en el fragmento del c-terminal. Calcular el valor de m/z de B4 sumando las masas nominales de los elementos de la estructura para producir un valor de 580 y coloque m/z 580 en el fragmento N-terminal. Calcular el valor de m/z de Y5 y m/z 685 en el fragmento del c-terminal.</li>
		<li>Calcular los valores de m/z para los ocho iones de B y todos los de ocho Y en iones y montarlos en una tabla, como se muestra en la tabla 1. Nota: Los valores de m/z de los fragmentos pueden calcularse usando un producto químico, software de dibujo.</li>
		<li>Abrir el espectro MS/MS grabado de la peptoid usando el software de revisión de datos acompañado con el instrumento. Establecer las preferencias de etiquetado a "Mostrar etiquetas de iones" y sello umbral al 3%. Esto genera un espectro MS/MS con los valores de m/z en los picos.</li>
		<li>La MS/MS datos espectrales como archivo de texto en el formato CSV reconstrucción el espectro utilizando software de procesamiento de datos y el formato de exportación. Colocar valores de m/z en las cumbres. El espectro MS/MS resultante se muestra en la figura 4. Nota: Algunos espectrómetros de masas están equipados con software de procesamiento de datos capaz para generar el espectro MS/MS. En este caso, exportar los datos espectrales MS/MS no es necesario.</li>
		<li>Asignar los valores de m/z aparece en el espectro MS/MS a las que se muestran en el cuadro 1 para identificar el correspondiente B - y Y-iones. Por ejemplo, el pico en el 580 de m/z se identifica como B4-ion y m/z 685 es identificado como el Y5-ion. Etiqueta los picos con los símbolos B y Y correspondientes en el espectro, como se muestra en la figura 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, ha sido sintetizado mediante el protocolo presentado. El aparato de síntesis consiste en un recipiente de polipropileno jeringuilla-como en la reacción de fase sólida y un agitador mecánico. Los reactores están comercialmente disponibles y de bajo costo. Un agitador mecánico es un aparato común en laboratorios de química. Con el uso de un recipiente de reacción similar a la jeringa, soluciones pueden ser arrastradas y empujadas fuera de la nave mov...

Peptoides son una clase de secuencia controlada de polímeros con estructuras de la columna vertebral imitando la estructura de los péptidos. Peptoides pueden ser sintetizados de aminas diversas, que permite peptoides exhibir propiedades altamente ajustables1,2. Peptoides se han utilizado como modelos moleculares para la investigación biofísica, considerados como agentes terapéuticos y diseñado como ligandos para proteínas3,4,5,6. Peptoides se han desarrollado en una variedad de compuestos biológicamente activos, como los materiales anti-fouling y anticuerpo miméticos, agentes antimicrobianos y enzima inhibidores7,8,9. Con una naturaleza altamente ordenada y armoniosa, peptoides han también sido considerados como un tipo de almacenamiento de información molecular10. El descubrimiento de estas llamadas de diversas aplicaciones para el desarrollo de eficientes métodos analíticos para caracterizar la secuencia y estructura de peptoides. Técnicas basadas en espectrometría de masa Tandem han demostrado promesa como el método de elección para el análisis de las propiedades de la secuencia de polímeros de secuencia controlada, incluyendo peptoides11,12,13, 14,15. Sin embargo, estudios sistemáticos de la correlación de los patrones de fragmentación de iones peptoid resultantes de estudios de espectrometría de masas y la información estructural de peptoides son muy limitadas.
Peptoides pueden sintetizarse fácilmente utilizando un método de fase sólida. El método desarrollado consiste en una iteración de un proceso de dos pasos monómero además ciclo16,17. En cada ciclo además, una amina resina es acetilada por un ácido Haloacético (típicamente Ácido bromoacético, BMA), y esto es seguido por una reacción de desplazamiento con una amina primaria. Aunque han aplicado rutinariamente protocolos de síntesis automatizada para peptoid síntesis, peptoides pueden sintetizarse manualmente con excelentes rendimientos en una química estándar laboratorio16,18,19, 20.
Nuestro laboratorio ha adoptado el método de síntesis de peptoid manual y simplificado del aparato utilizado en los métodos existentes. Anteriormente hemos estudiado los patrones de fragmentación de una serie de peptoides usando MS/MS técnicas21,22,23. Nuestros resultados muestran que peptoides producen fragmentaciones característica cuando se someten a disociación colisión-inducida (CID)21,23 o22 experimentos de disociación (ECD) de captura de electrón. En este artículo se demuestra cómo oligo-peptoides pueden sintetizarse en un laboratorio de química estándar, cómo realizar los experimentos de CID utilizando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo y cómo analizar los datos espectrales. El peptoid a ser sintetizado y caracterizado es un nonamer con acetilación N-terminal y c-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. La estructura de la peptoid se muestra en la figura 1.

<table><tbody><tr><td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>The software is a part of the Varian 320L package</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pressure caps for reaction vessels</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.45 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styrofoam cup, 12 Oz</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rink amide resin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>N, N&amp;rsquo;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Bromoacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-ethylenediamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>N, N-diisopropylethylamine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>For generating HPLC grade water</td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td></td><td></td><td>Produced from Millipore MILLI-Q&amp;reg; Academic Water Purification System</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr></tbody></table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoides son oligómeros de péptido imitando secuencia controlado que consta de unidades de N-alquilados glicina. Entre muchas aplicaciones potenciales, peptoides han pensado de como un tipo de almacenamiento de información molecular. Análisis de espectrometría de masas se ha considerado el método de elección para la secuencia peptoides. Peptoides pueden ser sintetizados vía química de fase sólida usando un ciclo de reacción de dos pasos repetidos. Aquí presentamos un método para sintetizar manualmente oligo-peptoides y analizar la secuencia de peptoides mediante técnicas de espectrometría de masas (MS/MS) de tándem. La peptoid de la muestra es un nonamer consisten en alternar N-(2-methyloxyethyl) glicina (Nme) y N-(2-FENILETILO) glicina (Npe), así como una N-(2-aminoetil) glicina (Nae) a N-terminal. La fórmula de la secuencia de la peptoid es Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, donde Ac es el grupo acetilo. La síntesis tiene lugar en un recipiente de la reacción de fase sólida disponible en el mercado. La resina amida de pista se utiliza como soporte sólido para la peptoid con un grupo amida en el c-término. El producto resultante de la peptoid se somete a análisis de la secuencia usando un espectrómetro de masas triple cuadrupolo acoplado a una fuente de ionización por electrospray. La medida MS/MS produce un espectro de iones fragmento resultante de la disociación de peptoid cargado. Los iones fragmento se clasifican hacia fuera basado en los valores de su relación masa / carga (m/z). Los valores de m/z de los iones del fragmento se comparan con las masas nominales de iones fragmento teóricamente predicho, según el esquema de fragmentación de peptoid. El análisis genera un patrón de fragmentación de la peptoid cargada. El patrón de fragmentación está correlacionado con la secuencia de monómeros de peptoid neutro. En este sentido, el análisis por MS lee la información de la secuencia de la peptoides.

La estructura de un peptoid 9-mer con la acetilación N-terminal, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, se muestra en la figura 1. El peptoid fue sintetizado manualmente en un recipiente de la reacción de polipropileno sinterizado vía fase sólida. Pista amida resina (0,047 mmol, mg 84 con una carga de 0,56 mmol/g) es utilizado como soporte sólido para el peptoid con un amidated c-término. La cadena peptoid está construida por varios ciclos de la ...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Síntesis y análisis de espectrometría de masas de peptoides Oligo

Un protocolo se describe para la manual síntesis de oligo-peptoides seguido por análisis de la secuencia por espectrometría de masas.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K vistas.  University of the Pacific. Un protocolo se describe para la manual síntesis de oligo-peptoides seguido por análisis de la secuencia por espectrometría de masas.

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Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Investigación

Química

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

La secuenciación de pared planta heteroxilanos Usando enzimática, química (metilación) y (espectrometría de masas, resonancia magnética nuclear) Técnicas Físicas

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Bioquímica

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Síntesis de peptoides que llevan información y su autoensamblaje covalente dinámico dirigido por secuencia

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Preparación de muestras y cuantificación relativa mediante metilación reductiva de aminas para estudios de peptidómica

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Seguimiento de partículas sensibles a la masa para caracterizar la dinámica de macromoléculas asociada a la membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo perfiles Misa (OLIMP) de polisacáridos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biología

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.