Name: synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
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著者は、peptoid 合成における技術支援のため氏マイケル ・ コノリーと博士ロナルド Zuckermann (の分子鋳造、ローレンス ・ バークレー国立研究所) を感謝したいです。我々 は、全米科学財団 (チェ ・ 1301505) からの支援を認めます。パシフィック大学で化学質量分析施設ですべての質量分析実験を行った。

1. Peptoid の合成
注: 合成樹脂の樹脂を膨潤・保護グループを削除するアクティブにするから始まります。樹脂モノマー添加サイクルの繰り返しで上に peptoid チェーンの成長が続きます。樹脂と結合した最初の単量体は、C 末端残基です。Peptoid は N 末端から C 末端細長い。目的の peptoid シーケンスを達成すると、樹脂はオフ切断、peptoid 製品を精製します。
<ol><li>試薬の調製 注: 液体の試薬、マイクロ ピペットを使用して測定したで、固体試薬分析用天秤を用いています。<ol>
<li>ミックス 6.2 mL の n、N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) と n, n-ジメチルホルムアミド (DMF) DIC/DMF 溶液の 0.8 M を準備する 43.8 mL。</li>
		<li>0.8 M BMA/DMF 溶液を調製する DMF の 50.0 mL に BMA の 5.56 g を溶解します。</li>
		<li>2 mL ピペリジン (Pip) の 20% DMF Pip/ソリューションを達成するために DMF の 8 mL を混ぜます。</li>
		<li>1.9 mL Npe の 1.0 を達成するために DMF の 13.1 mL に溶解 M Npe/DMF。</li>
		<li>13.7 mL 1.0 を達成するために DMF に Nme の 1.3 mL を溶かす M Nme/DMF。</li>
		<li>0.32 mL ナエの 1.0 を達成するために DMF の 2 mL に溶解 M ナエ/DMF。 注意: 合成に使用される化学物質のほとんどは、危険です。トリフルオロ酢酸 (TFA) や DIC、Pip、BMA は、皮膚、目、呼吸器に有害な。DMF、ジクロロ メタン (DCM) は、発がん性を疑われています。ヒューム フードすべての反応を実行して、適切な個人用保護具を使用する必要があります。合成で使用されるすべての化学物質の化学物質等安全データシート (MSDS) をご確認ください。</li>
	</ol></li>
	<li>樹脂活性化
	<ol>
<li>84 mg 場アミド樹脂 (樹脂、0.047 ミリ モル 0.56 ミリ モル/g の読み込み) を測定し、10 mL のポリプロピレンの固相反応容器に追加。プランジャーを容器に挿入します。</li>
		<li>反応容器に DMF の 2 mL を加えて圧力キャップと容器のキャップします。シェーカーに容器を置き、キャップを取り外し、反応容器のプランジャーを押すことによって廃棄物コンテナーに約 12 度と 385 振動/分 30 分排水ソリューションのための動きの角度で常温で容器を揺り動かしなさい。</li>
		<li>容器に 20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加えて、容器のキャップします。2 分、シェーカーの扇動し、ドレインの廃棄物コンテナーにソリューション。</li>
		<li>20 %pip/DMF 溶液 2 mL を加える容器、キャップ、容器とキャップ 12 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄容器への解決策をドレインします。</li>
		<li>DMF、キャップ、容器の 1 つの mL を追加することによって樹脂を洗い、キャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレイン 1 分の容器を攪拌します。4 追加回 DMF と樹脂を洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>モノマーを添加し、N 末端のアセチル化 注: 各モノマー添加サイクルは、2 つの反作用のステップ、bromoacetylation、変位を伴います。<ol>
<li>Nme 樹脂フォーム最初のモノマー添加サイクルを実行します。</li>
		<li>Bromoacetylation 反応を実行します。0.8 M BMA/DMF 溶液の 1 mL のビーカーに 0.8 M DIC/DMF 溶液 1 mL を混ぜます。樹脂を含む反応容器に混合物を転送し、容器のキャップします。シェーカーに容器を置くとキャップ 20 分削除の室温でそれを扇動し、廃棄物コンテナーにソリューションをドレインします。</li>
		<li>DMF の 1 mL を追加する、容器のキャップ、1 分攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水によって樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。もう一度、DCM の樹脂を洗浄し、DMF で 2 回洗ってください。</li>
		<li>置換反応を行います。1.0 M Nme/DMF 溶液の 1 mL を追加し、容器のキャップ、キャップ 60 分削除のため室温で容器を扇動、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインします。</li>
		<li>1 mL DMF を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。1 ml の DCM、1 分攪拌を描画し、排水ソリューションにより樹脂を洗浄します。DMF で 2 回洗浄後もう一度、DCM を洗います。</li>
		<li>1.3.2 に 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4を形成するための手順からモノマー添加サイクルを繰り返す-樹脂。置換反応 (1.3.4) の手順を繰り返し、peptoid 順序に従って特定アミン溶液を使用します。 注: peptoid チェーンが伸長する C 末端から N 末端に樹脂にバインドされている C 末端残基を持つ。</li>
		<li>Ac-Nae-(Npe-Nme)4を形成する N 末端アセチル化を実行-樹脂。</li>
		<li>ミックス 92年 μ L の酢酸無水、43.5 μ N、N diisopropylethylamine (DIPEA)、ビーカーに DMF の 2 mL、約 2 mL のアセチル化をカクテルを作る。</li>
		<li>樹脂を含む容器に 2 mL のアセチル化のカクテルを追加、キャップ、容器および 60 分のキャップをはずし、プランジャーを押すことにより、ソリューションをドレインの室温でそれを扇動します。</li>
		<li>DMF の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM の 1 つの mL を追加し、1 分の容器を撹拌排水ソリューション樹脂を洗浄します。DCM、一度より多くの樹脂、さらに 2 回 DMF で洗浄洗浄を繰り返します。</li>
		<li>DCM の 1 mL を追加し、1 分の容器を攪拌、プランジャーを押すことにより、ソリューションを排水樹脂を洗浄します。DCM で 2 回洗浄を繰り返します。キャップをはずし、10 分間反応容器内空気乾燥させる樹脂。</li>
	</ol></li>
	<li>胸の谷間と浄化
	<ol>
<li>TFA、triisopropylsilane (ヒント) を 100 μ l 添加 HPLC グレード H2O ビーカーに 100 μ L の胸の谷間の 4 mL のカクテルを作るための 3.8 mL を混ぜます。</li>
		<li>4 mL の新鮮な作った胸の谷間カクテル樹脂を含む容器に追加、容器、キャップ、2 時間室温で攪拌します。</li>
		<li>キャップをはずし、50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液ソリューションを収集します。容器に TFA の 1 mL を追加、キャップ、および 1 分同じ遠心管に収集濾液ソリューションを扇動します。</li>
		<li>粘性解は左が約 1 mL まで窒素ガスのストリームで優しく吹いて TFA を蒸発させます。</li>
		<li>残りの溶液にジエチル エーテル 15 mL を追加、遠心分離機管のキャップ、一夜にして 2 時間-20 ° C のフリーザーでそれを孵化させなさい。原油の peptoid は、白色固体として析出します。</li>
		<li>遠心分離機管のキャップ 10 分削除 4,427 × g で遠心分離機を用いた固体のペレットし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカントします。 注意: ジエチル エーテルは可燃性の有機溶剤です。ジエチル エーテルの安全なの遠心分離機を使用してください。</li>
		<li>洗浄は遠心分離機に冷たいジエチル エーテル 10 mL を加えることによって固体管、固体を含むチューブをキャップと遠心分離機で配置すること。10 分間遠心遠心分離機からチューブし、ソリッドを失うことがなく慎重にビーカーにジエチル エーテルをデカント削除 4,427 × g で遠心分離を行います。</li>
		<li>固体を乾燥するには、窒素ガスのストリームでやさしく吹いて。</li>
		<li>HPLC グレード H2O 乾燥した固体を溶解するための 10 mL を追加します。ソリューションを孔径 0.45 μ m のナイロン シリンジ フィルターを通過し、前加重 50 mL ポリプロピレン製遠心管に濾液を収集します。</li>
		<li>シェル固定ソリューションを配置し、液体窒素で満たされた 12 オンス、ダブル スタック拡張ポリスチレン カップに 1/3 peptoid ソリューションを含む遠心管を回転します。固体 peptoid を生成するため冷凍ソリューション一晩を凍結乾燥します。</li>
		<li>HPLC グレード H2O の mL の 10 に固体 peptoid を溶解して凍結 1 つより多くの時間を繰り返し、液体窒素で凍結し、一晩を lyophilizing をシェルします。結果として得られる peptoid は、質量分析法による配列解析のために十分に純粋です。</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS 測定と解析
注: MS/MS 実験はエレクトロ スプレー イオン化 (ESI) ソースに結合トリプル四重極質量分析計で実施です。データ コレクションは、楽器を伴うデータ集録ソフトウェアを使用して制御されます。一般的な手順が含まれています 1) フル スキャン質量分析実験を行うと実験 2) MS/MS シドを実行する質量スペクトルを記録、MS/MS スペクトルを記録し、3) 理論 MS/MS スペクトル データを比較します。フラグメント化スキームは、peptoid の構造的特徴に基づく予測します。
<ol><li>試料溶液の調製
	<ol>
<li>3-5 mL のガラス瓶で 1.0 2.0 mg 固体 peptoid を重量を量る。溶解、peptoid に 1 mL 混合溶剤のアセトニ トリルと水 (ACN/H2O、1:1、v/v) を追加します。これは約 10-3 M の濃度でストック サンプル ソリューションを提供します。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに 20 μ L の原液を転送し、ACN/H2O 約 10-5 M の希釈試料溶液を生成するための 1 mL 混合溶媒を追加します。</li>
		<li>3 分別 1.5 mL 遠心にソリューションのトップの部分の約 700 μ L を転送の 4,427 × g で遠心分離を実行することによって希釈試料溶液の任意の可能な不溶性粒子 peptoid MS の実用的なソリューションを作るにチューブを削除約 10-5 M の濃度。</li>
		<li>質量分析法による測定では, 観測信号強度に基づく MS 作業溶液の濃度を調整します。</li>
		<li>0.20 μ m シリンジ フィルターを試料溶液を通過し、濾液を収集 peptoid MS 約 10-5 の実用的なソリューションを作るに 1.5 mL 遠心チューブには希釈試料溶液の任意の可能な不溶性の粒子を除去する方法M。</li>
	</ol></li>
	<li>質量スペクトルを記録
	<ol>
<li>エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) 源によって ACN/H2O (1:1、v/v) の混合溶媒を実行し、標準的な肯定的なイオンの計測器、質量電荷比 (m/z) 100-1500 の範囲と完全なスキャン質量分析モードを設定します。 メモ: 典型的な動作パラメーター: ESI 針電圧 5 kV キャピラリー電圧 40 V 乾燥ガス (窒素ガス) の温度は、200 ° C</li>
		<li>500 μ L または 1 mL の注射器に peptoid MS 作業ソリューション (約 10-5 M) の約 300 μ L を追加し、キャピラリー ポリエーテル エーテル ケトン (ピーク) チューブを用いた ESI 入口に注射器を接続します。シリンジ ポンプに注射器を置き、ESI 入口に試料溶液を注入する 10 μ L/分の流量を設定します。</li>
		<li>ESI プロセスをアクティブに ESI 針電圧をオンにし、検出器の電源を入れます。プロフィール モードで 100-1,500 の m/z 範囲表示を設定します。プロファイル ウィンドウに示すように質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 (m/z 1,264.6 のとして表示) でピークは peptoid イオンまたはプロトン化 peptoid に対応します。</li>
		<li>2 分の MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。 注: 結果の質量スペクトルは図 3に示すです。</li>
		<li>M/z 1,265 のピークの強度を最適化します。1,150 1,350 m/z 範囲を設定し、プロフィール ウィンドウに表示される mV でピーク強度を表示しながら毛細血管の電圧を調整します。たとえば、増加するキャピラリー電圧 50 V をまたはより高いピーク強度の変化を見ると。最適なピーク強度は 150-200 mV。 注: キャピラリー電圧を調整すると、特定イオンの豊かさが大きく変わる。キャピラリー電圧を増加 peptoid イオンの強度を高めることができます。しかし、高キャピラリー電圧がイオン源の peptoid イオンの解離を引き起こすも、観測強度を減少します。M/z 1,265, ピークの強度を高めることができるガスを乾燥の温度を調整するキャピラリー電圧を調整するよりも効果的です。M/z 1,265 でピークが最適な強度が到達しない場合は、サンプルの濃度 (または二重 MS 作業溶液の濃度など) を調整します。</li>
		<li>楽器を MS/MS モードに切り替えます。M/z 1,265 前駆イオンを設定し、MS/質量質量 100 1,400 の m/z の範囲。「メソッド ウィンドウ」で「第 1 四半期最初のミサ」として m/z 1,265 を使用し、、「第 1 四半期最後のミサ」を空白のままにします。「Q3 最後質量」として「第 3 四半期最初のミサ」、m/z 1,400 m/z 100 を使用 注: MS/MS モード、前駆イオンと peptoid イオンを分離する質量フィルターとして最初の四重極ユニット (Q1) 機能で第 2 四重極ユニット (Q2) は衝突セルと 3 つ目の四重極ユニット (Q3) 機能質量分析器として。</li>
		<li>1.5 mtorr 圧 40 eV で衝突エネルギーと衝突ガス (アルゴン、この場合) セットします。</li>
		<li>プロファイル ウィンドウに表示質量スペクトル プロフィールを表示します。M/z 1,265 のピークは peptoid イオンに対応し、m/z 値の低いピークは peptoid イオンからフラグメントを表します。</li>
		<li>断片化スペクトルの表示を最適化するために衝突エネルギーを調整します。45 eV に衝突エネルギーを増やすなど、スペクトルの変化を表示します。 注: 一般的に、衝突エネルギーを増加強化フラグメント イオンの豊富なし peptoid イオンの豊かさを減らします。衝突ガス圧力を増加させると、フラグメント イオンの豊かさをまた高めます。 注意: 2 mTorr を超えて衝突ガス圧を増やさないでください。</li>
		<li>2 分の MS/MS スペクトルを記録します。「メソッド ウィンドウ」で「実行時間」として 2 分を使用記録ウィンドウを開き、適切なファイル名を入力、スペクトルを記録します。</li>
		<li>1-2 回の記録を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>Peptoid シーケンス解析 注: CID の条件の下で一連の B イオンと呼ばれる N 末端フラグメントと Y イオンと呼ばれる C 末端フラグメントのシリーズを生成する peptoid バックボーンに沿ってアミド結合でフラグメントは peptoid イオン<ol>
<li>左側と右側に、C 末端に N 末端を置くことによってアセチル化 peptoid の化学構造を描画し、フラグメント化スキームを図 2 aに示すように、生成する各アミド結合で破線を描画します。電荷キャリアを示す破線の円内でプロトンを描画します。構造体の左側から開始して、B1B2B8として N 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。右側から始まって、Y1Y2Y8として C 末端フラグメントを示す破線にラベルを配置します。 注: 化学ソフトウェアの描画は、peptoid 構造を描画する使用できます。</li>
		<li>左から 4番目のアミド結合での断片化を想像して、N 末端フラグメントと図 2 bに示すように、適切な正式な料金と C 末端フラグメントの構造を描きます。N 末端フラグメントで B4のラベルを配置し、C 末端フラグメントの Y5のラベルを配置します。580 の値を生成するための構造の要素の公称質量を合計することによって B4の m/z 値を計算し、N 末端フラグメントで 580 m/z を配置します。Y5 m/z 値を計算し、C 末端フラグメントの 685 m/z を配置します。</li>
		<li>すべて 8 B イオンおよびすべての 8 Y イオンの m/z 値を計算し、表 1に示すように、テーブルでは、それらを組み立てます。 注: フラグメントの m/z 値は描画ソフトウェア化学を使用して計算できます。</li>
		<li>楽器を伴うデータ レビュー ソフトウェアを使用して peptoid の記録の MS/MS スペクトルを開きます。「イオンのラベルを表示する」にラベル設定とラベルしきい値を 3% に設定します。これはピークのラベルの付いた m/z 値の MS/MS スペクトルを生成します。</li>
		<li>MS/MS スペクトル データを csv ファイル形式のテキスト ファイルとして書式設定し、データ処理ソフトウェアを使用してスペクトルを再構築をエクスポートします。ピークの m/z 値を配置します。結果の MS/MS スペクトルを図 4に示します。 メモ: いくつかの質量分析計は、MS/MS スペクトルを生成するデータ処理ソフトウェアが装備されています。この場合、MS/MS スペクトル データをエクスポートする必要はありません。</li>
		<li>表示、対応する B と Y-イオンを識別するために表 1に示されるように MS/MS スペクトル m/z 値を割り当てます。B4m/z 580 でピークを識別するたとえば、-イオンと 685 m/z が Y5として識別されて-イオン。図 4に示すように、スペクトルに対応する B と Y 記号のピークのラベルを付けます。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

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提示プロトコルを使用して nonamer peptoid、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2は合成されています。合成装置には、注射器のようなポリプロピレン固相反応容器と機械的シェーカーが含まれます。反応容器は商業的に低コストです。機械的シェーカーは、化学実験室で一般的な装置です。注射器のような反応容器を使って、ソリューションは引き込まれるしプランジャーを手動で移動することに?...

ペプチドは、ペプチドの構造を模したバックボーン構造を持つシーケンス制御された高分子のクラスです。ペプチド合成できる多様なアミンから高度可変プロパティ1,2を展示するペプチドを可能にします。ペプチドは、生物物理学的研究、治療薬として考えられている、タンパク質3,4,5,6配位子として設計されて分子モデルとして使用されています。ペプチドは、防汚と抗体ミメティック材料、抗菌薬、酵素阻害剤7,8,9などの生理活性物質の多様性に開発されています。高い順序と可変自然とペプチドも考えられたの分子情報ストレージ10の種類として。シーケンスとペプチドの構造を特徴付けるため効率的な分析法の開発のためのこれらの多様なアプリケーション呼び出しの発見。タンデム質量分析を用いた手法は、ペプチド11,12,13を含む、シーケンス制御された高分子のシーケンスのプロパティを分析するための選択の方法として約束を示しています。 14,15。しかし、体系的な研究から生じる peptoid イオン断片化パターンを関連付ける質量分析研究、ペプチドの構造情報が非常に限られました。
ペプチドは、固相メソッドを使用して容易に合成することができます。よく発達したメソッドには、2 段階モノマー添加サイクル16,17のイテレーションが含まれます。またサイクルごとに樹脂連結アミンはハロ酸 (通常ブロモ酢酸、BMA)、によってアセチル化し、第一次アミンの置換反応が続きます。標準化学研究所16,18,19、で優秀な利回りとペプチドを手動で合成できる自動合成プロトコルは、peptoid 合成の日常的に適用されているが20。
当研究室は、手動 peptoid 合成法を採用したあり、既存のメソッドで使用される装置を簡略化します。ペプチド ・ MS/MS テクニック21,22,23を使用して一連の分裂パターンは学んだこともあります。衝突誘起解離 (CID)21,23にさらされるまたは電子捕獲解離 (ECD)22実験時、ペプチドが特徴的な分裂を生成することが分かった。この記事では、標準的な化学実験室でのオリゴ ペプチドの合成方法、トリプル四重極の質量分析計を用いた CID 実験を実行する方法およびスペクトル データを分析する方法を示しています。合成して特徴付けられる peptoid は、N 末端アセチル化、C 末端アミド化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と nonamer です。Peptoid の構造を図 1に示します。

<table><tbody><tr><td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>The software is a part of the Varian 320L package</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pressure caps for reaction vessels</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.45 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styrofoam cup, 12 Oz</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rink amide resin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>N, N&amp;rsquo;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Bromoacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-ethylenediamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>N, N-diisopropylethylamine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>For generating HPLC grade water</td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td></td><td></td><td>Produced from Millipore MILLI-Q&amp;reg; Academic Water Purification System</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr></tbody></table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

ペプチドは、N-アルキル グリシン ユニットで構成されるシーケンス制御ペプチド模倣オリゴマーです。多くの潜在的なアプリケーション間で、ペプチドは、分子情報ストレージの種類としての考えられてきました。質量分析は、配列ペプチドの選択の方法を考えられています。ペプチドは、繰り返し 2 段階反応サイクルを用いた固相化学経由で合成できます。タンデム質量分析 (MS/MS) 技術を用いたペプチドの順序を分析する手動でオリゴ ペプチドを合成する方法をご紹介します。サンプル peptoid は、n-(2-アミノエチル) グリシン (ナエ) N 末端と同様に n-(2-methyloxyethyl) グリシン (Nme) と n-(2-フェニルエチル) グリシン (Npe) を交互に構成される nonamer です。Peptoid のシーケンス式は Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2Ac がアセチル基であります。合成は、市販の固相反応容器で行われます。スケート リンクのアミド樹脂は C 末端にアミド基をもつ peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。結果の peptoid 製品は、エレクトロ スプレー イオン化ソースに結合トリプル四重極質量分析計を用いたシーケンス解析を受けます。MS/MS 測定は、充電 peptoid の解離から生じるフラグメント イオンのスペクトルを生成します。フラグメント イオン質量電荷比 (m/z) の値を基に並べ替えられます。フラグメント イオンの m/z 値は peptoid 断片化のスキームに従って理論的に予測されたフラグメント イオンの名目の固まりと比較されます。分析は、充電 peptoid のフラグメント パターンを生成します。断片化パターン中立的な peptoid のモノマー シーケンスに相関しています。この点で、質量分析は、ペプチドのシーケンス情報を読み出します。

N 末端アセチル化、Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2と 9 mer の peptoid の構造を図 1に示します。Peptoid は、固相によるガラスフリットのポリプロピレン製反応容器に手動で合成されました。スケート リンク アミド樹脂 (0.047 ミリ モル、0.56 ミリ モル/g の読み込みに 84 mg) は、化の C 末端と peptoid を生成する固体のサポートとして使用されます。Pept...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

プロトコルは質量分析法によるオリゴ ペプチドの配列解析に続いての手動合成についてください。

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K ビュー.  University of the Pacific. プロトコルは質量分析法によるオリゴ ペプチドの配列解析に続いての手動合成についてください。

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Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

化学

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

生化学

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

生物学

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

合成とオリゴペプチドの質量分析

要約

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この動画の章

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

要約

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質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

合成と異なる二硫化接続と μ-コノトキシン PIIIA 異性体の構造決定

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

情報を持つペプトイドの合成と、その配列指向動的共有自己集合

ペプチド学研究におけるアミンの還元メチル化を用いたサンプル調製と相対定量

膜関連高分子ダイナミクスを特徴付けるための質量感受性粒子追跡

細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

合成とオリゴペプチドの質量分析