Name: synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids at JoVE.com

Die Autoren möchten Herr Michael Connolly und Dr. Ronald Zuckermann (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) für Technik-Support in Peptoid Synthese danken. Wir anerkennen die Unterstützung durch die National Science Foundation (CHE-1301505). In der Chemie Mass Spectrometry Einrichtung an der University of the Pacific wurden alle Massenspektrometrie Experimente durchgeführt.

(1) Synthese von Peptoid
Hinweis: Die Synthese beginnt mit Aktivierung der Harz durch Schwellung des Harzes und der Schutzgruppe entfernen. Danach wächst die Peptoid Kette an das Harz durch Monomer Zusatz Zyklen wiederholen. Die ersten Monomer, gekoppelt an das Harz ist der C-terminalen Rückstand. Die Peptoid ist aus dem C-Terminus an den N-Terminus länglich. Sobald die gewünschte Peptoid Sequenz erreicht ist, ist das Harz aus gespalten und das Peptoid Produkt gereinigt.
<ol><li>Vorbereitung der Reagenzien Hinweis: Die flüssige Reagenzien sind mit einer Mikropipette gemessen und die solide Reagenzien sind mit einer Analysenwaage gemessen.<ol>
<li>Mischen von 6,2 mL N, N'-Diisopropylcarbodiimide (DIC) und 43,8 mL N, N-Dimethylformamid (DMF), 0,8 M DIC/DMF Lösung vorzubereiten.</li>
		<li>Lösen Sie 5,56 g des BMA in 50,0 mL DMF, eine 0,8 M BMA/DMF-Lösung vorzubereiten.</li>
		<li>Mischen Sie 2 mL Piperidin (Pip) und 8 mL DMF, 20 % Pip/DMF Lösung zu erreichen.</li>
		<li>Auflösen von 1,9 mL der Npe in 13,1 mL DMF 1.0 zu erreichen M Npe/DMF.</li>
		<li>Auflösen von 1,3 mL Nme in 13,7 mL DMF 1.0 zu erreichen M Nme/DMF.</li>
		<li>Auflösen von 0,32 mL Nae in 2 mL DMF 1.0 erreichen M Nae/DMF. Achtung: Die meisten der in der Synthese verwendeten Chemikalien sind gefährlich. Trifluoroacetic Säure (TFA), DIC, Pip und BMA sind gefährlich für die Haut, Augen und Atemwege. DMF und Dichlormethan (DCM) sind Karzinogene verdächtigt. Alle Reaktionen in einem Abzug durchgeführt werden und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung sollte verwendet werden. Bitte überprüfen Sie das Sicherheitsdatenblatt (MSDS) alle Chemikalien, die bei der Synthese verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Harz-Aktivierung
	<ol>
<li>Messen Sie, 84 mg Rink Amid Harz (Harz, 0,047 Mmol laden 0.56 Mmol/g) und einem 10 mL Polypropylen Festphasen-Reaktionsgefäß hinzufügen. Legen Sie den Kolben in das Gefäß.</li>
		<li>Das Reaktionsgefäß 2 mL DMF hinzu und verschließen Sie das Gefäß mit einem Druckverschluss. Stellen Sie das Gefäß in einen Shaker geben und schütteln Sie das Schiff bei Raumtemperatur in einem Winkel von Bewegung von ca. 12 Grad und 385 Schwingungen/min für 30 min. abtropfen lassen die Lösung zu einem Abfallbehälter durch Entfernen der Kappe und schieben den Kolben der den Reaktionsbehälter.</li>
		<li>Das Schiff 2 mL 20 % Pip/DMF-Lösung hinzu und verschließen Sie das Gefäß. Auf den Shaker für 2 min schütteln, und die Lösung für den Abfallbehälter entleeren.</li>
		<li>Das Schiff 2 mL 20 % Pip/DMF-Lösung hinzu, Kappe des Schiffes, und schütteln es bei Raumtemperatur für 12 min. Entfernen der Kappe und die Lösung für den Abfallbehälter entleeren.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz durch Zugabe von 1 mL DMF, das Gefäß verschließen und rühren das Schiff für 1 min. die Kappe abnehmen und entwässern die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz mit DMF für 4 weitere Male.</li>
	</ol></li>
	<li>Monomer Addition und N-terminale Acetylierung Hinweis: Jedes Monomer-Zusatz-Zyklus beinhaltet zwei Reaktionsschritte, Bromoacetylation und Vertreibung.<ol>
<li>Führen Sie die ersten Monomer Zusatz Zyklus zu bilden Nme-Harz.</li>
		<li>Führen Sie eine Bromoacetylation Reaktion. Mischen Sie 1 mL von 0,8 M BMA/DMF-Lösung und 1 mL von 0,8 M DIC/DMF-Lösung in ein Becherglas. Übertragen Sie die Mischung in einem Reaktionsgefäß mit Harz und verschließen Sie das Gefäß. Stellen Sie das Gefäß auf den Shaker und schütteln Sie es bei Raumtemperatur für 20 min. Entfernen der Kappe und entleeren Sie die Lösung für den Abfallbehälter.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz, indem 1 mL DMF, Deckelung des Schiffes, für 1 min rühren, und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen von 1 mL der DCM, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung. Waschen Sie das Harz mit DCM noch einmal und dann waschen Sie es mit DMF zweimal.</li>
		<li>Führen Sie eine Verschiebung Reaktion. Fügen Sie 1 mL 1,0 M Nme/DMF-Lösung, verschließen Sie das Gefäß, schütteln Sie dem Schiff bei Raumtemperatur für 60 min. Entfernen der Kappe und abtropfen lassen Sie die Lösung durch Drücken des Kolbens.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen 1 mL DMF, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz von Zeichnung in 1 mL DCM, agitieren für 1 min, und entleeren die Lösung. Waschen Sie DCM nochmals, gefolgt vom Waschen mit DMF zweimal.</li>
		<li>Wiederholen Sie Monomer Zusatz Zyklen von Schritten 1.3.2, 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4zu bilden-Harz. Wenn Sie den Schritt der Verschiebung Reaktion (1.3.4) wiederholen, verwenden Sie eine spezifische Amin Lösung entsprechend der Reihenfolge der Peptoid. Hinweis: Die Peptoid-Kette ist aus dem C-Terminus an den N-Terminus mit der C-terminalen Rückstand an das Harz gebunden länglich.</li>
		<li>Führen Sie N-terminale Acetylierung zu Ac-Nae-(Npe-Nme)4-Harz.</li>
		<li>Mix 92 µL des Essigsäureanhydrid, 43,5 µL von N, N-Diisopropylethylamine (DIPEA) und 2 mL DMF in ein Becherglas, ca. 2 mL der Acetylierung cocktail machen.</li>
		<li>Das Gefäß mit Harz fügen Sie 2 mL der Acetylierung cocktail hinzu, verschließen Sie das Gefäß und bei Raumtemperatur agitieren Sie, für 60 min. die Kappe abnehmen und entwässern die Lösung durch Drücken des Kolbens.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen 1 mL DMF, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Waschen Sie das Harz durch Hinzufügen von 1 mL der DCM, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung. Wiederholen Sie waschen des Harzes mit DCM noch einmal, dann waschen mit DMF noch zweimal.</li>
		<li>Waschen Sie das Harz von 1 mL der DCM hinzufügen, das Schiff für 1 min rühren und entleeren die Lösung durch Drücken des Kolbens. Wiederholen Sie waschen mit DCM zweimal. Entfernen Sie den Deckel und lassen Sie das Harz in das Reaktionsgefäß für 10 Minuten an der Luft trocknen.</li>
	</ol></li>
	<li>Dekolleté und Reinigung
	<ol>
<li>Mischen Sie 3,8 mL TFA 100 µL Triisopropylsilane (Tipps) und 100 µL der HPLC-Klasse H2O in ein Becherglas zu 4 mL Spaltung cocktail.</li>
		<li>Fügen Sie 4 mL frisch Spaltung cocktail auf dem Gefäß mit Harz zubereitet, verschließen Sie das Gefäß und schütteln Sie es bei Raumtemperatur für 2 h.</li>
		<li>Entfernen Sie die Kappe und sammeln Sie die Filtrat Lösung in ein 50 mL Polypropylen Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 mL TFA auf das Schiff und cap sie agitieren für 1 min. sammeln das Filtrat-Lösung in der gleichen Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Verdunsten Sie TFA durch Einblasen in einem Strom von Stickstoffgas sanft bis etwa 1 mL Viskose Lösung übrig ist.</li>
		<li>Die restliche Lösung 15 mL Diethylether hinzu, die Zentrifuge Röhrchen, und in einem Gefrierschrank-20 ° C für 2 h über Nacht inkubieren. Die rohe Peptoid fällt als weißer Körper.</li>
		<li>Pellet-Volumenkörper mit einer Zentrifuge bei 4.427 x g für 10 min. Entfernen der Kappe die Zentrifugenröhrchen und dekantieren Diethylether in ein Becherglas sorgfältig ohne festen. Achtung: Diethylether ist eine brennbare organische Lösungsmittel. Bitte verwenden Sie eine sicheren Diethylether-Zentrifuge.</li>
		<li>Waschen der Volumenkörper durch Zugabe von 10 mL eiskaltes Diethylether in der Zentrifuge tube mit dem festen, Deckelung der Röhre, und platzieren es in der Zentrifuge. Durchführen Sie Zentrifugation bei 4.427 x g für 10 min. entfernen die Zentrifuge tube aus der Zentrifuge und dekantieren Diethylether in ein Becherglas sorgfältig ohne festen.</li>
		<li>Trocknen Sie das Solid durch sanft weht in einem Strom von Stickstoffgas.</li>
		<li>Fügen Sie 10 mL HPLC-Klasse H2O, getrockneten festen aufzulösen. Ein Nylon-Spritze-Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm die Lösung durchlaufen, und das Filtrat in ein Pre-gewichteten 50 mL Polypropylen Zentrifugenröhrchen sammeln.</li>
		<li>Schale fixieren die Lösung durch platzieren und drehen die Zentrifuge Rohr enthält, die die Peptoid-Lösung in einem 12-Unze-doppelt gestapelt erweiterte Polystyrol Espressotasse 1/3 mit flüssigem Stickstoff gefüllt. Lyophilize Sie die gefrorenen Lösung über Nacht um solide Peptoid zu erbringen.</li>
		<li>Durch Auflösen der soliden Peptoid in 10 mL HPLC-Klasse H2O Lyophilisierung noch einmal zu wiederholen, Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lyophilisation Übernachtung shell. Die daraus resultierende Peptoid ist ausreichend für Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie rein.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS-Messungen und Sequenzanalyse
Hinweis: MS/MS-Experiment wird in einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt an eine Electrospray Ionisierung (ESI) durchgeführt. Datenerhebung erfolgt mithilfe der Datenerfassungs-Software mit dem Instrument begleitet. Das allgemeine Verfahren beinhaltet 1) die Durchführung der vollständigen Scan-Massenspektrometrie-Experiment und Aufnahme Massenspektrum, experimentieren (2) Durchführung der CID-MS/MS und Aufnahme der MS/MS-Spektrum, und (3) Vergleich der MS/MS spektralen Daten mit theoretischen Fragmentierung Schema Vorhersagen basierend auf das Strukturmerkmal der Peptoid.
<ol><li>Vorbereitung der Probenlösung
	<ol>
<li>1,0-2,0 mg feste Peptoid in einer 3-5 mL-Glasflasche abwiegen. Fügen Sie 1 mL gemischt Lösungsmittel von Acetonitril und Wasser (ACN/H2O, 1:1, V/V), um die Peptoid zu lösen. Dadurch werden die Lager Probenlösung mit einer Konzentration von etwa 10-3 M.</li>
		<li>20 µL der Stammlösung in eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 1 mL gemischt Lösungsmittel von ACN/H2O zu eine verdünnten Probenlösung von ca. 10-5 M ergeben.</li>
		<li>Entfernen Sie alle mögliche unlösliche Partikel in der verdünnten Probenlösung durch Zentrifugation bei 4.427 x g ausführen, für 3 min. Transfer ca. 700 µL der obere Teil der Lösung in einem anderen 1,5 mL Zentrifuge Rohr zu Peptoid MS funktionierende Lösung mit Konzentration von etwa 10-5 M.</li>
		<li>Passen Sie die Konzentration der MS funktionierende Lösung basierend auf die beobachteten Signalintensität während Massenspektrometrie Messungen.</li>
		<li>Eine alternative Möglichkeit, alle möglichen unlösliche Partikel in der verdünnten Probenlösung zu entfernen ist ein 0,20 µm Spritze Filter die Beispiellösung durchlaufen und das Filtrat in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen Peptoid MS Arbeitslösung von etwa 10-5 zu sammeln M.</li>
	</ol></li>
	<li>Aufzeichnung von Massenspektren
	<ol>
<li>Der Elektrospray-Ionisation (ESI) Quelle durchlaufen Sie gemischte Lösungsmittel von ACN/H2O (1:1, V/V), und richten Sie das Instrument in einem standard positive Ionen, vollständiger Scan Massenspektrometrie Modus mit einer Masse-Ladungs-Verhältnis (m/Z) Reihe von 100-1500. Hinweis: Typische Betriebsparameter: ESI-Nadel-Spannung, 5 kV Kapillare Spannung, 40 V Gas (Stickstoff) Trocknungstemperatur, 200 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie ca. 300 µL Arbeitslösung Peptoid MS (ca. 10-5 M) in 500 µL oder eine 1 mL Spritze und schließen Sie die Spritze mit dem ESI-Einlass mit Kapillare Polyether Ether-Keton (PEEK)-Schläuche. Legen Sie die Spritze auf die Spritzenpumpe und die Durchflussmenge in 10 µL/min auf die Beispiellösung verleihen dem ESI-Einlass.</li>
		<li>Schalten Sie die ESI-Nadel-Spannung um den ESI zu aktivieren, und dann auf den Detektor. Stellen Sie die Anzeige im Profilmodus und m/Z-Bereich von 100-1500. Ein Massenspektrum Profil, im Fenster "Profil" angezeigt. Der Peak bei m/Z 1.265 (dargestellt von 1,264.6 m/Z) entspricht die Peptoid Ion oder protonierten Peptoid.</li>
		<li>Notieren Sie die MS-Spektrum für 2 min. Verwenden Sie in das Fenster"Methoden" 2 min als die "Laufzeit". Öffnen Sie das Aufnahmefenster und füllen in einem richtigen Dateinamen und das Spektrum Aufnahme starten. Hinweis: Die resultierende Massenspektrum ist in Abbildung 3dargestellt.</li>
		<li>Optimieren Sie die Intensität des Peaks bei m/Z von 1.265. 1.150-1.350 m/Z-Bereich gesetzt und passen Sie die Kapillare Spannung beim Betrachten der Peak-Intensität in mV im Fenster "Profil" angezeigt. Beispielsweise erhöhen die Kapillare Spannung bis 50 V oder höher und zeigen die Veränderung der Peak-Intensität. Die optimale Peak-Intensität ist um 150-200 mV. Hinweis: Die Kapillare Spannung einstellen kann die Fülle an bestimmte Ionen wesentlich ändern. Erhöhung der Kapillaren Spannung kann die Intensität des Peptoid Ions verbessern. Allerdings kann eine Kapillare Hochspannung auch Dissoziation des Peptoid Ions in der Ionenquelle zu induzieren und verringern Sie die beobachteten Intensität. Einstellung der Temperatur des Trocknens Gas kann die Intensität des Peaks bei m/Z 1.265 erhöhen, aber es ist weniger wirksam als die Kapillare Spannung einstellen. Wenn der Peak bei m/Z 1.265 nicht die optimale Intensität erreicht, passen Sie die Probe Konzentration (oder beispielsweise verdoppeln die Konzentration von MS funktionierende Lösung).</li>
		<li>Schalten Sie das Gerät in den MS/MS-Modus. Festlegen des Vorläufer-Ions bei m/Z 1.265 und MS/MS Masse Bereich bei m/Z 100-1400. Im Methode Fenster"," m/Z 1.265 als "Q1 Primiz" verwenden und "Q1 letzte Messe" leer lassen. Verwenden Sie m/Z 100 als "Q3 Primiz" und m/Z 1.400 als "Q3 letzten Messe." Hinweis: Im MS/MS-Modus die ersten Quadrupol Einheit (Q1) Funktionen wie einem Massenfilter, Peptoid Ion als der Vorläufer-Ion zu isolieren ist die zweite Quadrupol-Einheit (Q2) eine Kollision-Zelle und die dritte Quadrupol (Q3) arbeitet als eine Masse Analysator.</li>
		<li>Satz der Aufprallenergie bei 40 eV und der Kollision Gas (Argon, in diesem Fall) auf 1,5 mTorr Druck.</li>
		<li>Ein Massenspektrum Profil, im Fenster "Profil" angezeigt. Der Peak bei von 1.265 m/Z entspricht des Peptoid Ions, und die Spitzen mit niedrigeren m/Z-Werte repräsentieren die Fragmente aus der Peptoid Ion.</li>
		<li>Passen Sie die Aufprallenergie um die Anzeige des Spektrums Fragmentierung zu optimieren. Zum Beispiel erhöhen Sie die Aufprallenergie auf 45 eV und zeigen Sie die Änderung des Profils Spektrum an. Hinweis: erhöhen die Aufprallenergie im Allgemeinen verbessern die Fülle der Fragment-Ionen werden und reduziert die Fülle des Peptoid-Ions. Erhöhung des Kollision Gasdrucks erhöht auch die Fülle der Fragment-Ionen. Achtung: Nicht erhöhen Sie die Kollision Gasdruck über 2 mTorr.</li>
		<li>MS/MS-Spektrum für 2 min aufnehmen. Verwenden Sie 2 min in Methode Fenster"," als die "Laufzeit". Öffnen Sie das Aufnahmefenster und füllen in einem richtigen Dateinamen und das Spektrum Aufnahme starten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Aufnahme von 1 - 2 Mal.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptoid-Sequenzanalyse Hinweis: Unter der Bedingung der CID, würde das Peptoid Ion an die Amid-Bindungen entlang der Peptoid Rückgrat, eine Reihe von N-terminale Fragmente genannt B-Ionen und eine Reihe von C-terminale Fragmente genannt Y-Ionen zu produzieren fragment<ol>
<li>Die chemische Struktur der Schimmelpilzschäden Peptoid indem der N-Terminus auf der linken Seite und dem C-Terminus auf der rechten Seite zeichnen Sie, und zeichnen Sie eine gestrichelte Linie auf jede Amid-Bindung, eine Fragmentierung Schema zu generieren, wie in Abbildung 2agezeigt. Zeichnen Sie ein Proton mit einem gestrichelten Kreis an der Ladungsträger. Ausgehend von der linken Seite der Struktur, platzieren Sie Beschriftungen auf die gestrichelten Linien um die N-terminale Fragmente als B1, B2, B8anzugeben. Ausgehend von der rechten Seite, platzieren Sie Beschriftungen auf die gestrichelten Linien um die C-terminale Fragmente als Y1Y2, Y8anzugeben. Hinweis: Eine chemische Zeichnung Software kann genutzt werden, um die Peptoid-Struktur zu zeichnen.</li>
		<li>Stellen Sie Fragmentierung bei der 4th Amid-Bindung von der linken Seite vor, und zeichnen Sie die Strukturen der N-terminale Fragment und das C-terminale Fragment mit richtigen formalen Gebühren, wie in Abbildung 2 bdargestellt. Platzieren Sie die Beschriftung der B4 auf das N-terminale Fragment, und die Bezeichnung des Y5 auf das C-terminale Fragment. Berechnen Sie den m/Z-Wert von B4 durch Aufsummieren der nominalen Massen der Elemente in der Struktur zu einem Wert von 580 und das N-terminale Fragment setzen Sie m/Z 580 auf. Berechnen Sie den m/Z-Wert von Y5 und das C-terminale Fragment setzen Sie m/Z 685 auf.</li>
		<li>Berechnen Sie die m/Z-Werte für alle acht B-Ionen und alle acht Y-Ionen, und montieren sie in einer Tabelle, wie in Tabelle 1dargestellt. Hinweis: Die m/Z-Werte der Fragmente können mit Hilfe einer Chemikalie Zeichnung Software berechnet werden.</li>
		<li>Öffnen Sie das aufgezeichnete MS/MS-Spektrum der die Peptoid mit den Daten-Review-Software mit dem Instrument begleitet. Legen Sie die Beschriftung Einstellungen für "Show Ionen-Labels" und Label-Schwelle auf 3 %. Dies erzeugt ein MS/MS-Spektrum mit m/Z-Werten beschriftet auf den Gipfeln.</li>
		<li>Exportieren Sie die MS/MS spektrale Daten als Textdatei im CSV-format und das Spektrum mit Datenverarbeitungs-Software zu rekonstruieren. M/Z-Werte auf den Gipfeln zu platzieren. Das daraus resultierende MS/MS-Spektrum ist in Abbildung 4dargestellt. Hinweis: Einige Massenspektrometer Datenverarbeitungs-Software in der Lage, verfügen über für die Generierung der MS/MS-Spektrum. In diesem Fall ist es nicht notwendig, die MS/MS spektralen Daten exportieren.</li>
		<li>Ordnen Sie die m/Z-Werte gezeigt, auf dem MS/MS-Spektrum zur Ermittlung der entsprechende B und Y-Ionen in Tabelle 1 gezeigt. Beispielsweise wird der Peak bei m/Z 580 identifiziert als B-4-Ionen und m/Z 685 ist identifiziert als die Y-5-Ion. Beschriften Sie die Spitzen mit entsprechenden B und Y Symbole auf dem Spektrum, wie in Abbildung 4dargestellt.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein Nonamer Peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, hat unter Verwendung des Protokolls präsentiert synthetisiert. Die Synthese-Apparat beinhaltet eine Spritze wie Polypropylen Festphasen-Reaktionsgefäß und einem mechanischen Schüttler. Die Reaktionsgefäße sind kommerziell verfügbar und kostengünstig. Einem mechanischen Schüttler ist ein gemeinsamen Apparat in Chemie-Laboratorien. Mithilfe einer Spritze wie Reaktionsgefäß werden Lösungen hineingezogen und das Schiff durch manuelles Verschieben d...

Peptoids sind eine Klasse von Sequenz-gesteuerte Polymere mit Rückgrat Strukturen imitiert die Struktur von Peptiden. Peptoids können aus verschiedenen Aminen synthetisiert werden, ermöglicht Peptoids, höchst abstimmbaren Eigenschaften1,2auszustellen. Peptoids wurden als molekulare Modelle für biophysikalische Forschung, als Therapeutika und konzipiert als Liganden für Proteine3,4,5,6verwendet. Peptoids wurden in einer Vielzahl von biologisch aktiven Verbindungen, wie z. B. Anti-fouling und Antikörper-mimetischen Materialien, antimikrobielle Wirkstoffe und Enzym-Inhibitoren7,8,9entwickelt. Mit einer sehr geordnet und abstimmbaren Natur haben Peptoids auch als eine Art von molekularen Informationen Speicher10gedacht. Die Entdeckung dieser vielfältigen Anwendungen erfordert die Entwicklung von effizienten Analysemethoden zur Charakterisierung der Sequenzablaufs und Struktur des Peptoids. Tandem mass Spectrometry-basierte Techniken haben Versprechen als die Methode der Wahl für die Analyse der Sequenz Eigenschaften der Sequenz-gesteuerte Polymere, einschließlich Peptoids11,12,13gezeigt, 14,15. Jedoch systematische Studien korrelieren die Peptoid Ion Fragmentierung Muster aus mass Spectrometry Studien und die Strukturinformationen von Peptoids sind sehr begrenzt.
Peptoids können leicht mit einem festen Phase Verfahren synthetisiert werden. Die gut entwickelte Methode beinhaltet eine Iteration einer zweistufigen Monomer Zusatz Zyklus16,17. In jedem Zyklus zusätzlich ein Harz-gebundene Amin ist durch eine Halogenessigsäuren Säure (in der Regel Bromoacetic Säure, BMA) acetyliert, und dies ist gefolgt von einer Versetzung Reaktion mit ein primäres Amin. Obwohl automatisierte Synthese Protokolle für Peptoid Synthese routinemäßig angewendet wurden, können Peptoids manuell mit sehr guten Ausbeuten in einem standard Chemie Labor16,18,19, synthetisiert werden 20.
Unser Labor hat hat die Methode der manuellen Peptoid Synthese und vereinfacht das Gerät in die bestehenden Methoden verwendet. Wir haben vorher die Fragmentierung Muster aus einer Reihe von Peptoids mit MS/MS Techniken21,22,23studiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Peptoids charakteristische Fragmentierungen produzieren, wenn sie einer Kollision-induzierte Dissoziation (CID)21,23 unterliegen oder Elektroneneinfang Dissoziation (ECD)22 Experimente. In diesem Artikel zeigen wir wie Oligo-Peptoids in einem standard Chemielabor synthetisiert werden kann, wie mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer CID-Experimente durchführen und wie die spektralen Daten analysieren. Die Peptoid synthetisiert und charakterisiert ist ein Nonamer mit N-terminale Acetylierung und C-terminalen Amidierung, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. Die Struktur der Peptoid ist in Abbildung 1dargestellt.

<table><tbody><tr><td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>The software is a part of the Varian 320L package</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pressure caps for reaction vessels</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.45 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styrofoam cup, 12 Oz</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rink amide resin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>N, N&amp;rsquo;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Bromoacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-ethylenediamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>N, N-diisopropylethylamine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>For generating HPLC grade water</td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td></td><td></td><td>Produced from Millipore MILLI-Q&amp;reg; Academic Water Purification System</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr></tbody></table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoids sind Sequenz-gesteuerte Peptid imitiert Oligomere bestehend aus N-alkyliert Glycin Einheiten. Unter vielen möglichen Anwendungen haben Peptoids als eine Art molekulare Informationsspeicherung gedacht. Massenspektrometrie-Analyse ist die Methode der Wahl für die Sequenzierung Peptoids betrachtet worden. Peptoids können über feste Phase Chemie mit einer sich wiederholenden zweistufigen Reaktionszyklus synthetisiert werden. Hier präsentieren wir eine Methode, Oligo-Peptoids manuell zu synthetisieren und die Reihenfolge der Peptoids mit Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) Techniken zu analysieren. Die Probe Peptoid ist ein Nonamer bestehend aus abwechselnd N-(2-Methyloxyethyl) Glycin (Nme) und N-(2-Phenyl) Glycin (Npe) sowie eine N-(2-Aminoethyl) Glycin (Nae) am N-Terminus. Die Sequenz-Formel von der Peptoid ist Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, wo Ac die Acetyl-Gruppe. Die Synthese erfolgt in einem handelsüblichen Festphasen-Reaktionsgefäß. Die Eisbahn Amid Harz dient als solide Unterstützung um die Peptoid mit einem Amid-Gruppe am C-Terminus zu erzielen. Das resultierende Peptoid Produkt unterliegt Sequenzanalyse mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt an eine Electrospray Ionisierung Quelle. Die MS/MS-Messung erzeugt ein Spektrum der Fragment-Ionen aus der Dissoziation des geladenen Peptoid. Der Fragment-Ionen sind je nach den Werten ihrer Masse-Ladungs-Verhältnis (m/Z) sortiert. Die m/Z-Werte der Fragment-Ionen werden gegen die nominalen Massen der theoretisch vorhergesagten Fragment-Ionen, nach dem Schema der Peptoid Fragmentierung verglichen. Die Analyse erzeugt eine Fragmentierung Muster der geladenen Peptoid. Die Fragmentierung Muster ist der Monomer-Reihenfolge der neutralen Peptoid korreliert. In diesem Zusammenhang liest MS-Analyse die Sequenzinformation von der Peptoids.

Die Struktur von einem 9-Mer Peptoid mit N-terminale Acetylierung, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, ist in Abbildung 1dargestellt. Die Peptoid wurde manuell in einem fritted Polypropylen Reaktionsgefäß über Festphase Ansatz synthetisiert. Eisbahn Amid Harz (0,047 Mmol, 84 mg mit be-0.56 Mmol/g) dient als solide Unterstützung um die Peptoid mit einem niedrigmethylierte C-Terminus zu erzielen. Die Peptoid-Kette ist durch mehrere Zyklen von Monom...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Synthese- und Massenspektrometrie der Oligo-peptoids

Ein Protokoll wird für die manuelle Synthese von Oligo-Peptoids gefolgt von Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie beschrieben.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K Aufrufe.  University of the Pacific. Ein Protokoll wird für die manuelle Synthese von Oligo-Peptoids gefolgt von Sequenzanalyse durch Massenspektrometrie beschrieben.

Serie: Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Massenspektrometrische Ansätze zur Proteinstruktur und Wechselwirkungen zu untersuchen in lyophilisierte Pulver

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Forschung

Chemie

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Sequenzierung von Pflanzenwand Heteroxylane Mit Enzymatische, Chemical (Methylierungs) und Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Biochemie

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

Synthese von informationstragenden Peptoiden und deren sequenzgesteuerter dynamischer kovalenter Selbstmontage

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Massensensitive Partikelverfolgung zur Charakterisierung der membranassoziierten Makromoleküldynamik

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Messe Profiling (OLIMP) der extrazellulären Polysacchariden

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biologie

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.