Este trabajo fue financiado por una beca de Hypatia de la Radboud University Medical Center, un premio de desarrollo de carrera del programa de Ciencias humanas de frontera, la gravitación programa 2013 de la organización de países bajos para la investigación científica (NWO; ICI-024.002.009), un VIDI conceder de nuevo orden mundial (ALW VIDI 864.14.001) y una beca Starting Grant del Consejo Europeo de investigación (ERC) de la Unión Europea en el séptimo programa marco (contrato de concesión número 336479).

1. preparación de las muestras del microscopio
<ol>
	<li>Expresión de Qa-SNARE sintaxina 4 fundido a mCitrine (sintaxina 4-mCitrine; fluoróforo donador) y el VAMP3 R-caja fundida a mCherry (VAMP3 mCherry) Nota: Otras trampas con proteínas fluorescentes fusionados con sus hélices transmembranales c-terminal pueden también utilizarse. En lugar de mCitrine-mCherry, otros pares donador aceptor de fluoróforos espectralmente separado también pueden ser utilizado (e.g., CFP-YFP).<ol>
		<li>Crecen las células HeLa y dividir células HeLa 900.000 sobre platos de fondo de cristal tres 35 mm de diámetro adecuados para microscopía. Nota: En principio, este protocolo puede ser adaptado para otros tipos de células eucariotas y platos de microscopía.<ol>
			<li>Mantener cultivos de células HeLa en T75 frascos con 10 mL de glucosa alta de Dulbecco suplementado modificado Eagle (DMEM), con 10% de suero fetal de ternero (FCS) y 1% antibiótico-antimicótico (conteniendo anfotericina B, penicilina y estreptomicina) a 37 ° C y 5% CO 2 en una incubadora de cultivo celular.</li>
			<li>Reponer el medio dos veces una semana y dividir las células 1:10 una vez por semana o cuando las células alcanzan a 85-90% confluency a los nuevos frascos T75 (500.000 células/frasco, en promedio).</li>
			<li>Quitar el DMEM y lavar las monocapas de HeLa dos veces con 8 mL de tampón fosfato salina (PBS) durante 3 minutos.</li>
			<li>Retirar el PBS y añadir 2 mL de PBS con el ácido de 2 mM etilendiaminotetracético (EDTA).</li>
			<li>Incubar las células durante 5 minutos a 37 ° C y 5% de CO2 en incubadora de cultivo celular y posteriormente ligeramente agite el frasco para separar las células HeLa de la parte inferior del matraz.</li>
			<li>Eliminar las células con 10 mL de medio, transfiera la suspensión a un tubo de 15 mL y sacar una alícuota de 10 μL para contar.</li>
			<li>Diluir la alícuota 1:1 con tinción de azul de tripano 0.4% y contar las células con un hemocitómetro de Bürker9. Nota: Cuenta 4 x 4 de dos plazas y múltiples el número de células por 10.000 el número de células/mL.</li>
			<li>Después de que célula contando, tomar 900.000 células del tubo de 15 mL, dividirlos en los platos de fondo de 3 cristal (vea el paso 1.1.1) y prepararse para la transfección.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Transfectar las células por electroporación10 (véase Tabla de materiales) con la sintaxina 4 mCitrine construcción (donante, muestra #1), sintaxina 4-mCitrine junto con VAMP3-mCherry (muestra #2) y la sintaxina 3 fundido a (mCitrine y mCherry Muestra #3). Nota: Otros métodos de transfección celular también pueden ser usado11. La construcción de tándem en la muestra #3 es un control positivo para la estimación del más corto tiempo de vida esperable (es decir, máxima esperable traste).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cultura de que las células durante la noche en alta glucosa DMEM suministrado con 10% FCS y 1% antibiótico-antimicótico a 37 ° C con 5% CO2 en una incubadora de cultivo celular.</li>
	<li>DMEM de aspirar y lavar las células una vez con el celular en medio de la proyección de imagen (140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH = 7.4, mOsm = 300; véase Tabla de materiales) por 2 min y posteriormente colocar las células en la proyección de imagen fresca medio.</li>
</ol>
2. registro de los datos FLIM
<ol>
	<li>Lugar muestra #2 debajo de un microscopio confocal de dominio de tiempo FLIM con una fuente de excitación pulsada para el fluoróforo donador (es decir, mCitrine) y adquisición de datos de tiempo resuelto. Mantener las células a 37 ° C con una platina calefactada. Nota: El microscopio confocal utilizado este protocolo está equipado con un objetivo de inmersión agua de 63 X 1.20 NA, un láser pulsado de luz blanco (80 MHz pulso, &#60; duración de pulso de 100 ps), un tubo multiplicador de fotón (PMT) y un Time-Correlated único fotón contando (TCSPC ) sistema (véase Tabla de materiales para la configuración específica utilizada). Otros microscopios FLIM también pueden ser utilizado (por ejemplo, diodos de avalancha del solo-fotón (SPAD) en lugar de PMT, sola longitud de onda láser pulsada en lugar de un láser pulsado de luz blanca).</li>
	<li>Seleccione una celda con la expresión visible de la mCitrine y proteínas SNARE mCherry etiquetados y grabar una imagen confocal de 256 × 256 píxeles con excitación simultánea de ambos fluoróforos antes de cada medición del FLIM. Un paso de píxel de aproximadamente 2 más pequeño que la difracción limita la resolución espacial del microscopio (~ 200 nm) debe ser utilizado. Para mCitrine, excitar en 516 nm y cobrar emisión de 521-565 nm; para mCherry, excitar a 610 nm y recoger la emisión de 613-668 nm. Nota: No no la posición del plano imagen demasiado cerca de la parte inferior del plato (dentro de ~ 2 μm de distancia), ya que esto resultará en un pico de reflexión en el histograma de toda la vida de la fluorescencia. Excitación simultánea de los fluoróforos donador y aceptor se prefiere, como esto permite superar el problema del movimiento de la muestra. Sin embargo, excitación secuencial puede ser utilizada así.</li>
	<li>Disco una imagen FLIM haciendo clic en Ejecutar el FLIM con la imagen FLIM se registran con las mismas dimensiones y resolución espacial como la imagen confocal grabada en el paso 2.2. Registrar los fotones de la imagen por lo menos 50.000 para el análisis FLIM de celulares, o por lo menos 400 fotones/pixel. Sólo excitar el fluoróforo donador de mCitrine y no mCherry aceptador fluoróforo y excitar así en 516 nm y recoger la emisión de 521-565 nm.</li>
	<li>Repita los pasos 2.1-2.3 para varias celdas y para los demás muestra #1 (sólo donante) y la muestra #3 (la construcción del tándem de mCitrine mCherry).</li>
	<li>Registrar una función de la respuesta del instrumento (IRF). Sintonice el monocromador del detector de emisión de la longitud de onda de excitación (p. ej., emisión récord de 510-550 nm) y luego grabar una imagen FLIM con la dispersión hacia atrás de un cubreobjetos de vidrio limpio haciendo clic en el botón Ejecutar FLIM. Usar la misma longitud de onda de excitación (516 nm) y energía utilizada para registrar los datos del celular a pasos 2.1-2.4. Nota: Si varios picos son visibles en el IRF o si no pueden ajustarse la emisión monocromadores, la Fig también se puede medir con una solución de colorante fluorescente con ultrarrápida de vida, por ejemplo de amortiguamiento de la fluorescencia de un colorante orgánico en una saturada acuoso solución de yoduro de potasio. Por otra parte, no es estrictamente necesaria para registrar un IRF, porque la pendiente de decaimiento de los histogramas de fluorescencia se puede también caber sin deconvolución de la IRF. Sin embargo, un IRF permite para corregir las características de la temporización del detector del fotón utilizadas y lo hace más exacto los ajustes de los histogramas de por vida.</li>
</ol>
3.Conversión de las grabaciones del fotón a las imágenes FLIM
<ol>
	<li>Descargar e instalar el PT32ICS conversión software5. Nota: Los datos de toda la vida también pueden ser analizados por otro software, incluyendo software de varios proveedores de microscopio.</li>
	<li>Configurar el software de PT32ICS.<ol>
		<li>Establecer el tamaño de 256 × 256 píxeles de tamaño de imagen via configuración | Tamaño.</li>
		<li>La posición del canal 2 través de la configuración de | Tamaño. Nota: El canal de la emisión de mCitrine es exclusivamente dependiente de la configuración del microscopio. Un canal mal dará como resultado una imagen FLIM con no fotones (es decir, negro la imagen) y como consecuencia un vacío 'LifetimeTable.txt'-archivo. El canal correcto puede ser identificado por ensayo y error.</li>
		<li>Ajustar salida en ImageJ (xyz) (o TRI2 (xyt)) para generar imágenes FLIM (paso 3.4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Presiona convertir y cargar uno o más rastros del fotón (archivos .pt3). Para seleccionar múltiples rastros de fotón, mantenga pulsada la tecla Ctrl . Nota: El formato de .ptu de 64 bits más reciente también se puede convertir.</li>
	<li>Asegurar que el software de PT32ICS genera los siguientes archivos en la misma carpeta donde se guardan los archivos de pt3: un montón de fotones por .pt3 rastro de fotón en formato estándar de citometría de imagen (.ics), un mapa de bits archivo por .pt3 rastro de fotón (.bmp), un archivo de texto por conversión (_Report.txt) que contiene información sobre las estadísticas del fotón (es decir, el número total de fotones en cada rastro de .pt3 del fotón, el tiempo de resolución del detector) y un segundo archivo de texto por conversión (_LifetimeTable.txt) que contiene el total histogramas de por vida de la fluorescencia en formato delimitado por tabulaciones para cada rastro del fotón de .pt3. Nota: El archivo .ics puede utilizarse para píxel apropiado para generar imágenes FLIM, por ejemplo con TRI2 software12,13 o la curva delgada montaje biblioteca en ImageJ FIJI14,15. Este archivo puede también usarse para análisis de fasores16, por ejemplo con el plugin de momento cerrada fasor de FIJI de Spechron. El archivo de mapa de bits no contiene ninguna información de toda la vida. El segundo archivo de texto se utiliza para el análisis FLIM de celulares en el paso 4.</li>
</ol>
4. instalación de histogramas de por vida de la fluorescencia para el análisis de células completas FLIM
Nota: Este paso (instalación de deconvoluted de la fig) requiere software capaz de conexión deconvoluted. Montaje de las pistas de los histogramas de fluorescencia sin deconvolución de la Fig se puede hacer con otros programas así.
<ol>
	<li>Abrir el programa de software de análisis de datos capaz de caber con deconvolución (Tabla de materiales) e importar el archivo de texto que contiene el histograma de cada huella de fotones (_LifetimeTable.txt) via archivo | Importación | Solo ASCII.</li>
	<li>Reorganizar la tabla que el IRF es en la segunda columna de la tabla (mediante copiar y pegar). Lugar de la Fig en la segunda columna B junto a los valores de tiempo en la primera columna A.</li>
	<li>Determinar la calidad de las huellas registradas del fotón por seleccionar todas las columnas pulsando Ctrl + A y seleccionando parcela | Varios paneles | panel de 9. No analizar rastros de fotón con un pico de alta reflexión (figura 4F).</li>
	<li>Seleccione todas las columnas que contienen los histogramas de control de calidad de vida que se instalarán así como de la Fig en la columna B usando Ctrl clave y la conexión no lineal a través de análisis de la carga | Montaje | Ajuste no lineal de la curva | Abrir cuadro de diálogo.</li>
	<li>La función de ajuste deconvoluted (disponible en la archivo adicional 1) la carga añadiendo esta función en el software de análisis (a través de categoría | Definidos por el usuario | Función | Añadir). Seleccione el archivo de ajuste de la función 'FLIM_convoluted_IRF.fdf'. Esta función se adapta los histogramas de toda la vida de la fluorescencia con una función del decaimiento exponencial mono deconvoluted con la IRF (es decir, la segunda columna B en la tabla) (ecuación 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Ecuación 1) con t el tiempo, τ la fluorescencia evidente toda la vida, A la amplitud y y0 el desplazamiento. Nota: Otra opción es para ajustar los histogramas de por vida con una función de forma bi-exponencial (ecuación 2): 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Ecuación 2) Mediante la fijación de la duración del componente lento (τ1) a la condición de donante único (paso 1.1.2: ejemplo #1) y que el componente rápido (τ2) para la construcción del tándem (muestra #3), esto permite la estimación de la fracción de Proteínas SNARE en complejo (F) de las amplitudes de los componentes rápidos (A2; ver discusión; y lento (A1) La ecuación 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Ecuación 3) El archivo de función de ajuste para el ajuste exponencial bi deconvoluted 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' está disponible en el archivo adicional 2.</li>
	<li>Seleccione equipado curvas | X tipo de datos como mismo como datos de entrada. Nota: Esto tendrá como resultado el adecuado x-eje escalado de las curvas de cabida.</li>
	<li>Ajuste las curvas pulsando el botón ajuste. Nota: Esto convertirá el ajuste y generar una 'hoja de informe' en el array con una tabla que contiene los cursos de la vida de la fluorescencia, compensaciones y amplitudes. También generará una hoja de datos con las curvas equipadas y los residuos del ajuste.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion.">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li><li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+and+traffic.">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li><li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion.">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li><li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking.">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), 1543-1559 (2009).</li><li>Verboogen, D. R. J., Gonz&#225;lez Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation.">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dance+of+the+SNAREs:+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses.">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+pixel+kinetic+data+analysis+for+FRET+detection+by+multi-photon+time-domain+FLIM.">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).</li><li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Biosensor F&#246;rster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li><li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane.">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li><li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift.">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li><li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits.">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li><li>Veale, K. J., Offenh&#228;user, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4/SNAP23+mediates+adhesion,+cell+spreading+and+persistent+migration.">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li><li>G&#243;mez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells.">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo muestra el uso del traste-FLIM para visualización de interacción SNARE sintaxina 4 VAMP3 en vivo células HeLa. Sintaxina 4 es una proteína de Qa-SNARE predominante localización en la membrana plasmática donde media exocitosis1,2,20,21. VAMP3 es una trampa de R que se describe principalmente para localizar en reciclaje compartimientos endosomal y media trata a otros endosomas, así como a la membrana plasmática1,2,20. Sin embargo, el ensayo de FLIM traste puede ser fácilmente adaptado para el estudio de otras proteínas SNARE. La única condición es que estas trampas contienen una hélice transmembrana c-terminal, que es el caso de la mayoría de las proteínas SNARE por lejos1,2. Además, el protocolo descrito aquí puede ser adaptado para la visualización de complejos SNARE en cualquier tipo de células eucariotas, incluyendo plantas y levaduras. En este protocolo, hemos utilizado el acortamiento de la vida de la fluorescencia del fluoróforo donador como una medida de traste. Como un enfoque complementario, la vida útil del fluoróforo aceptor podría ser examinada, debido a que la emisión sensibilizada provoca una fase de subida distinta que proporciona prueba inequívoca transferencia de energía de resonancia se produce.
Actualmente, la técnica FRET-FLIM no puede visualizar complejos SNARE en compartimientos lysosomal. Para la construcción de 3-mCitrine-mCherry tándem sintaxina, la fluorescencia mCherry puede normalmente encontrarse más acumulada en una zona de juxtanuclear, que probablemente corresponde a compartimentos lysosomal, mientras que la señal mCitrine es más abundante en el celular 5de la periferia. Se observó una acumulación similar de juxtanuclear de mCherry comparado con mCitrine, cuando el mismo proteínas SNARE Unidas a estas proteínas fluorescentes se expresa Co5. Lisosomas se caracterizan por un pH extremadamente bajo (&#60; 4) y una alta actividad de enzimas proteolíticas. La acumulación de juxtanuclear de mCherry probablemente es causada por una mayor resistencia del fluoróforo mCherry lysosomal degradación en comparación con el fluoróforo mCitrine. No es debido al amortiguamiento de pH de mCitrine, ya juxtanuclear acumulación de mCherry también ocurre en la fijación de las células5. Así, la técnica FRET-FLIM subestima la cantidad de trastes en las regiones de juxtanuclear (lisosomal) y esto va a requerir otras proteínas fluorescentes reportero que sobreviven a las duras condiciones dentro de los lúmenes de lisosomas.
El FLIM-FRET en principio permite para obtener una estimación cuantitativa de (semi-) de la fracción de trampas en el complejo5. Como explicamos en este protocolo, esto requiere la instalación de los histogramas de por vida de la fluorescencia con funciones del decaimiento exponencial doble (ecuación 2), donde la amplitud de la componente rápida es proporcional a la fracción de trampas en complejo ( La ecuación 3). Sin embargo, tal conexión con un modelo de dos componentes es un desafío técnico. Conexión con múltiples parámetros de ajuste libres (dos cursos de la vida de la fluorescencia y dos amplitudes) requiere un número muy grande de fotones, especialmente puesto que los parámetros influyen entre sí y pequeños errores en la vida afectarán las amplitudes y vice versa. Para superar estos problemas de conexión, la vida de la fluorescencia de la componente lenta puede ser fijada a la duración de la condición de donante único (es decir, sin traste; sólo mCitrine actual) y que el componente rápido de la vida útil del tándem construir) máxima esperable traste). Sin embargo, esto debe también interpretarse con cuidado, porque la vida de la fluorescencia puede no ser la misma que en estos Estados de control y puede desviarse debido a múltiples razones (apagando el auto, orientación del dipolo, las variaciones en el microambiente). Múltiples complejos de trampa en las inmediaciones (&#60; 10 nm) puede resultado en traste dependiente de la distancia, el mismo principio que permite el traste ser utilizado como una "regla molecular", pero en este caso, oscurece la cuantificación de complejos SNARE. Por otra parte, una estimación cuantitativa no siempre es significativa, porque las trampas etiquetadas compiten con trampas (sin etiqueta) endógenas. Como consecuencia, el nivel de expresión de etiquetado mCherry trampa es un determinante principal para el porcentaje del traste5. Debido a todas estas advertencias, se recomienda a los histogramas de vida fluorescente con una función del decaimiento exponencial mono (ecuación 1). Esto tiene la ventaja que no requiere ningún conocimiento a priori de la vida y la vida fluorescente media aparente resultante proporciona una medida sólida para trampa secuestrantes5.
Sin embargo, se espera que cuantitativa traste-FLIM la proyección de imagen de modelos apropiados de dos componentes tendrá potentes aplicaciones futuras. Codificación de caja genes dentro del cromosoma se pueden fusionar con proteínas fluorescentes reportero, por ejemplo por CRISPR/CAS9. Esto resulta en el etiquetado fluorescente de proteínas endógenas de la trampa, con niveles de proteína endógena y no fondo de trampas sin etiqueta y así permite una estimación cuantitativa significativa de la fracción de complejos SNARE por traste-FLIM. Mientras que los niveles de expresión de trampas endógenos podrían ser bastante bajo y dan relativamente bajo señales fluorescentes, se espera que se puede obtener un número suficiente de fotones, especialmente para las células enteras FLIM (que requiere sólo unos pocos 1,000s de fotones). Además, estas mediciones de FRET-FLIM se pueden realizar con más sensibles detectores de fotodiodo de avalancha que también resultará en mayores señales de fluorescencia y mejores estadísticas de fotón.

Trata de la membrana es una característica central de las células eucariotas, donde vesículas de membrana bud apagado de un orgánulo de donantes hacia y del fusible con un organelo blanco1,2. Excepción de las mitocondrias, todos estos pasos de la fusión de la membrana son catalizados por miembros de la proteína SNARE familia1,2. La familia de proteínas SNARE consiste en alrededor de 36 miembros en células de mamíferos y cerca de 20 miembros en levadura2. Proteínas SNARE contienen uno o dos ~ 52 residuos de largo, nativamente regiones, denominadas SNARE-motivos. Proteínas SNARE son atadas a menudo a las membranas por una hélice transmembrana c-terminal1,2. Trampas pueden ser categorizados basado en los residuos central contribuyen a la trampa compleja en arginina (R) y glutamina (Q) trampas1,2. Fusión de membrana está impulsada por la interacción de 3 o 4 trampas cognadas que juntos contribuyen 4 trampa-motivos y se distribuyen sobre el donante y aceptor de1,de membrana2. Un complejo de la trampa consiste en un adorno de lazo R y tres motivos Q-SNARE (llamados Qa, Qb y Qc). Formación de complejos se inicia en el termini N de los motivos de lazo, formando una llamada trans-trampa-complejo y continúa hacia C-termini, formando un apretado haz de en espiral-arrolle α-helicoidal llamado un cis-trampa-complejo. La formación de complejos de incluso una sola trampa compleja arrastra a las membranas del donante y del aceptador y supera la barrera de energía para la fusión de la membrana3.
A menudo técnicamente es difícil asignar distintos complejos SNARE a rutas de transporte específicas dentro de las células. Aunque trampas contribuyen claramente a la especificidad de tráfico de la membrana, son promiscuos, funcionalmente redundante, y sus funciones superponen1,2. Debido a esto, experimentos de perturbación a trampas, como por knockout de genes, RNA de interferencia, la introducción de anticuerpos de bloqueo o con fragmentos SNARE soluble actúa como negativos dominantes, con frecuencia no resultan en fenotipos claros como otro Trampas compensarán2,4. Por otra parte, es difícil de distinguir pasos de fusión de membrana específico de eventos de tráfico por aguas arriba, porque de trampas se pueden participar en varias rutas de transporte2. Estudios de localización de trampas por microscopia enfoques, mediante inmunomarcación o genética fusión a proteínas fluorescentes reportero, sufren de los problemas que: (i) trampas localizar varios orgánulos como ellos a menudo median varios pasos la trata de personas y (ii) sus localizaciones no significan automáticamente que funcionalmente se dedican a formación complejo SNARE. Finalmente, complejos SNARE pueden identificarse mediante experimentos de inmunoprecipitación utilizando una de las trampas como cebo y las otras trampas como blancos, pero esto no permite la asignación de estos complejos organelos específicos o las rutas de tráfico. Así, actualmente, no hay ninguna técnica alternativa para visualizar complejos SNARE con resolución organellar. Inmunofluorescencia no es capaz de demostrar las interacciones de la trampa pero puede mostrar sólo la presencia o ausencia de co-localización, mientras inmunoprecipitación sólo puede mostrar interacciones trampa en toda la población de la célula pero no asignan los organelos donde estas las interacciones ocurren.
Para superar estas limitaciones, un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de complejos SNARE dentro de células vivas con resolución organellar fue desarrollado recientemente por Verboogen et al. 5 este método se basa en la expresión de pares de trampas con proteínas fluorescentes espectralmente desplazadas fusionados con el C-terminal a sus hélices transmembranales. Después de la terminación de la fusión de la membrana y la formación de un cis-encadenar complejo, estos fluoróforos en el termini de C de las hélices transmembranales inmediatamente se yuxtaponen entre sí. Los fluoróforos son entonces dentro de la distancia de Förster (típicamente &#60; 5 nm), resultando en traste de fluoróforo donantes verde-cambiado de puesto al fluoróforo aceptor rojo-cambiado de puesto5,6. FRET resultados en Temple de fluoróforo donador y una mayor emisión del fluoróforo aceptor que puede ser medida de la proporción de la emisión del donador y aceptor (radiométrica traste). Sin embargo, radiométrica traste entre dos moléculas diferentes es un reto, debido a niveles de diafonía y diferente fluorescencia del donador y aceptor trampas en distintos orgánulos y células7,8. TRASTE se puede medir también de la vida de la fluorescencia, que es el tiempo entre la excitación y la emisión de un fotón. Si el fluoróforo donador puede liberar su energía por nerviosismo, esta competencia resultado de proceso en un aparente acortamiento de la vida de la fluorescencia. Esto se puede medir por el FLIM7,8. Vida traste es mucho más sólido que radiométrica traste para medir interacciones entre dos moléculas diferentes, como la vida de la fluorescencia es una propiedad intrínseca de un fluoróforo y es insensible a su concentración. Por otra parte, FRET es aproximación cuantitativa, porque la eficacia de traste es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donador y aceptor fluoróforos (esencialmente una función escalón). Por lo tanto, ajustando los histogramas de por vida de fluorescencia registrados por FLIM con un modelo de decaimiento de doble componente, FRET-FLIM permite la (semi-) estimación cuantitativa de la fracción de moléculas de trampa en trampa formación compleja5.
Recientemente, este método de FRET-FLIM fue utilizada por Verboogen et al. para visualizar la formación de complejos SNARE en primarias células dendríticas del sistema inmune5. Se ha demostrado que al encontrarse un estímulo patógeno, las células dendríticas redireccionar su tráfico de membrana acompañado por una mayor formación de complejos de la proteína de membrana asociada a vesículas R-SNARE (VAMP) 3 con el Qa-SNARE sintaxina 4 específicamente en el membrana del plasma. Este aumento de la formación complejo trampa es probablemente necesaria para satisfacer el aumento de la capacidad secretora de la secreción de citoquinas proinflamatorias como la interleucina-65. Este protocolo describe los pasos experimentales necesarios para la adquisición de datos de FRET-FLIM para la visualización y (semi-) para la medición cuantitativa de complejos SNARE.Se explica cómo ajustar los histogramas de toda la vida de la fluorescencia de células completas con mono y bi-exponencial decaimiento de funciones, dando por resultado la duración aparente de la fluorescencia como una estimación cuantitativa a las interacciones de la trampa. En este protocolo, se utiliza la línea celular HeLa ampliamente utilizado como un ejemplo, pero el método puede ampliarse fácilmente para estudiar complejos SNARE en otras células eucarióticas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 4-mCitrine&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92422</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;VAMP3-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92423</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 3-mCitrine-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92426</td>
			<td>Positive control for maximum achievable FRET.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>Willco Wells</td>
			<td>HBST-3522</td>
			<td>Other live cell imaging chambers will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Pen/Strep will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed white light laser</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other pulsed laser sources can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system</td>
			<td>PicoQuant</td>
			<td>PicoHarp 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT32ICS conversion software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software programme capable of deconvolution</td>
			<td>Originlabs</td>
			<td>OriginPro 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity</td>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;rker Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#160;CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>B Braun Melsungen&#160; AG</td>
			<td>362 3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 2 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108417</td>
			<td>CAS: 60-00-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td>CAS: 72-57-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEON cell electroporation device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy

Soluble N- etilmaleimida sensible proteína (NSF) accesorio proteína del receptor (trampa) proteínas de fusión son clave para el tráfico de la membrana, ya que catalizan la fusión de la membrana en las células eucariotas. La familia de proteínas SNARE consiste en alrededor de 36 miembros. Rutas de transporte intracelulares específicos son catalizadas por conjuntos específicos de 3 o 4 proteínas SNARE que contribuyan a la especificidad y fidelidad de la membrana trata. Sin embargo, estudiar la función precisa de proteínas SNARE es técnicamente difícil, porque trampas son muy abundantes y funcionalmente redundante, con más trampas que múltiples y superposición de funciones. En este protocolo, se describe un nuevo método para la visualización de la formación de complejos de trampa en células vivas. Este método se basa en la expresión de proteínas SNARE C-terminal Unidas a proteínas fluorescentes y medir su interacción por energía de resonancia Förster transferencia (traste) empleando vida de fluorescencia microscopía (FLIM) la proyección de imagen. Encajando los histogramas de por vida de fluorescencia con un modelo de decaimiento multicomponente, FRET-FLIM permite (semi-) estimación cuantitativa de la fracción de la formación del complejo SNARE en diferentes vesículas. Este protocolo se ha aplicado con éxito para visualizar la formación compleja de la trampa en la membrana plasmática y en compartimientos endosomal en células mamíferas y las células inmunes primarias y puede ser fácilmente extendido para estudiar funciones de trampa en otros organelos en animal, vegetal y células fúngicas.

El fundamento del ensayo para la medición de las interacciones de la trampa por traste-FLIM se muestra en la figura 1. El C-termini de las hélices transmembranales de cognado proteínas SNARE se fusionan a un par de proteínas fluorescentes espectralmente cambiada de puesto (p. ej., mCitrine y mCherry). La formación de un cis-encadenar complejo sobre resultados de fusión de la membrana en estas proteínas fluorescentes inmediatamente ser yuxtapuestas uno al otro y preocuparse. La figura 2 muestra imágenes representativas confocales de células HeLa expresando proteínas SNARE marcada con fluorescencia. Se muestra una célula expresan sintaxina 4-mCitrine (donante fluoróforo) con VAMP3-mCherry (fluoróforo aceptor), así como las condiciones de control de las células que expresan sólo la sintaxina 4 mCitrine construir (donante sólo, sin traste) y sintaxina 3 fusionado a ambos mCitrine y mCherry en tándem (máxima esperable traste). La figura 3 muestra las imágenes FLIM generadas colocando los histogramas de la vida de cada píxel con funciones del decaimiento exponencial mono (Figura 3A–B) y (de las funciones del decaimiento exponencial bi y acompaña toda la vida de la fluorescencia Figura 3 - D). la Figura 4A muestra la Fig de nuestra configuración medido por dispersión detrás de un vidrio de cubierta de microscopio. En la Figura 4B–E, histogramas de vida representativos de la fluorescencia de la célula todo análisis FLIM con acompañamiento de ajuste se muestran curvas para las funciones del decaimiento exponencial de mono. Figura 4F muestra un histograma de vida fluorescente de un experimento que se desliza demasiado cerca de la superficie del vidrio de cubierta de microscopio, lo que resulta en un pico prominente de la reflexión. Figura 4 muestra un histograma de toda la vida con representante de ajuste con una función del decaimiento exponencial bi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Figura 1: esquema de la lógica para la visualización de complejos SNARE por traste. (A) modelo estructural de la proteína neuronal de trampas (proteína base de datos 3HD717) membrana asociada a vesículas (VAMP) 2 (azul; R), sintaxina 1 (rojo; Qa-SNARE) y SNAP25 (verde; contiene tanto un adorno lazo Qb y Qc). El C-terminal de la hélice transmembrana de sintaxina-1 es conjugada con mCitrine (fluoróforo donador; proteína base de datos 3DQ118). El C-terminal de la hélice transmembrana de VAMP2 es conjugado a mCherry (fluoróforo aceptor; proteína base de datos 2H5Q19). (B) esquema de la trampa mediada por fusión de la membrana resultando en traste. Después de la fusión de la membrana por la formación de un cis-complejo de la trampa, las trampas inmediatamente se yuxtaponen entre sí resultando en traste. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Figura 2: expresión de proteínas SNARE fusionados a proteínas fluorescentes. Primera columna: donantes fluoróforo, emocionado al 516 nm. Segunda columna: fluoróforo aceptor, emocionado a 610 nm. (A) donante sólo la condición. Imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando sintaxina 4-mCitrine (fluoróforo donador; verde en combinación). El canal del aceptador (segunda columna) muestra la fluorescencia de la diafonía. (B) control negativo (sin trastes). Imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando ambos sintaxina 4-mCitrine con VAMP3 mCherry (fluoróforo aceptor; magenta en combinación). (C) control positivo (máxima esperable traste). La construcción de imagen confocal representativa de una célula HeLa expresando la sintaxina 3-mCitrine-mCherry tándem. Tenga en cuenta que la señal de fluorescencia de la mCitrine y mCherry señales hace no totalmente traslapo, probablemente debido a una menor resistencia de mCitrine a la degradación lisosomal comparada mCherry (véase la sección discusión). BF: campo brillante. Escala de barras, 20 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Figura 3: imágenes FLIM de formación compleja caja. (A) representante de la fluorescencia de por vida las imágenes de las celdas que se muestra en la figura 2. Las imágenes fueron generadas por la primera conversión de los rastros de fotones por un sistema TCSPC (.pt3) para el estándar de citometría de imagen (.ics) utilizando el software PT32ICS. Píxel dispone de toda la vida de la fluorescencia imágenes luego fueron generadas con el TRI2 software12,13 de umbralización de 15-100% de intensidad, 7 pixel binning circular y monoexponential algoritmo de ajuste (Marquardt). El color indica la vida fluorescente aparente promedio. (B) FLIM imágenes donde las imágenes de vida de fluorescencia (se muestra en panel A) fueron enrevesadas con las intensidades de fluorescencia de un fluoróforo donador mCitrine (se muestra en la figura 2). La convolución se realizó con ImageJ de FIJI con una macro por encargo (véase Tabla de materiales). (C) vida de fluorescencia e imágenes FLIM de la célula HeLa expresando sintaxina 4-mCitrine y VAMP3 mCherry de paneles A-B, pero ahora con ajuste con las curvas de decaimiento exponencial bi (con cursos de la vida fijados en las condiciones de control; ver paso en 4,4 Protocolo). Los colores de píxel indican las fracciones estimadas F de sintaxina 4 en complejo con VAMP3 (ecuación 3). (D) igual que el panel B, pero para el bi-exponencial ajuste. La convolución se realizó con ImageJ de FIJI con una macro por encargo (véase Tabla de materiales). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Figura 4: celda todo análisis FLIM. (A) la función de la respuesta del instrumento (IRF) de la instalación. La IRF se midió usando la dispersión hacia atrás en la interfaz de agua de cristal (con un plato de microscopio limpio de vidrio que contiene agua).(B–E) Toda célula histogramas de vida útil de las celdas que se muestra en la figura 2 y figura 3. Se agruparon todos los fotones presentes en las imágenes. Las curvas se deconvoluted con la IRF y equipadas con funciones del decaimiento exponencial mono (ecuación 1). Para estas células, los cursos de la vida de la fluorescencia se obtuvieron de 2.82 ns (células expresando sólo sintaxina 4-mCitrine; donante sólo panel B), 2.09 ns (las células que expresan Co sintaxina 4-mCitrine con VAMP3 mCherry, panel C) y 2.08 ns (las células que expresan la sintaxina 3 - tándem mCitrine-mCherry construir; máximo control de traste esperable; panel D). Las incrustaciones muestran los gráficos mismo, pero ahora con escala logarítmica del eje y. El panel E muestra una superposición de las curvas de decaimiento de paneles B-D. (F) ejemplo de un histograma de toda la vida fluorescente grabado demasiado cerca a la superficie de la hoja de cubierta de microscopio. Esto resulta en un pico de gran reflexión (representado por el área sombreada de amarillo). (G) mismo grupo C, pero ahora se ajuste con una curva de decaimiento exponencial bi con cursos de la vida fija las condiciones de control (ver paso 4.4 en protocolo). Las amplitudes de la rápida (A1) y lento (A2) componentes fueron 14.42 y 0,01, respectivamente, dando por resultado una fracción estimada de trampas en el complejo F de 0.99 (ecuación 3). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1. Archivo de función FLIM_convoluted_IRF <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2. Archivo de función FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Este protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Membrane Structure and Functions

SCIENTISTS IN ACTION

9.4K vistas.  Radboud University Medical Center. Este protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.

Video: Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

La visualización y cuantificación de interacciones intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos y α-actinina de imagen confocal

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

Investigación

Inmunología e Infección

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Asistida por microondas diagnóstico rápido de enfermedades de virus de plantas por microscopía electrónica de transmisión

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Sola célula Medidas de Ruptura Vacuolar causadas por patógenos intracelulares

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Medición de pH Fagosoma por Ratiometric microscopía de fluorescencia

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

No invasiva<em&gt; En Vivo</emHome Idiomas Ingresar a Epistemonikos Búsqueda avanzada Fluorescencia de imágenes ópticas de la actividad MMP inflamatoria utilizando un agente de imagen fluorescente activable

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualización de macrófagos trampas extracelular mediante Microscopía Confocal

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

Integrar imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfilado para evaluar trata de CD1d endocíticas alterada

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Resumen

Explorar más videos

Capítulos en este video