Estos métodos integran la secuenciación de próxima generación y el análisis de imágenes de citometría de flujo. Puede ayudar a responder preguntas interesantes, como si algunas alteraciones fenotípicas están implicadas, en lugar del transcriptoma, especialmente en el ambiente de exposición a contaminantes. La principal ventaja de este sencillo método para nosotros es que podemos utilizarlo para medir la colocación de proteínas biológicamente importantes, para interpretar los resultados de la expresión génica diferencial clave a nivel funcional.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de resultados patológicos y toxicológicos. Como enfoque normal del imager, forsee tiene la capacidad de conectar la expresión génica con la función proteica. Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán debido a las altas demandas técnicas de la imagen y el análisis transcriptómico.
Para secuenciar la biblioteca de células dendríticas derivadas del monocitos humanos, primero cargue los reactivos de secuenciación e indexación en la biosíntesis de secuenciación y los bastidores de reactivos de indexación, respectivamente, y coloque los bastidores en un baño de agua de grado de laboratorio durante una hora, hasta que todo el hielo se haya derretido, y los reactivos se mezclen a fondo. Mientras los reactivos se descongelan, encienda el secuenciador, conecte el ordenador a una unidad de red cuando aparezca la unidad No expulsar e inicie el software de control del secuenciador. A continuación, agregue unos 100 mililitros de solución de lavado de mantenimiento a cada una de las botellas en el bastidor de reactivos de secuenciación de biosíntesis, y atornille una tapa de embudo en cada botella.
Agregue aproximadamente 12 mililitros de solución de lavado de mantenimiento a cada tubo cónico de 15 mililitros en el bastidor de reactivos de indexación y deseche las tapas. A continuación, cargue ambos bastidores en el secuenciador. Seleccione Maintenance Wash dentro del software de control del secuenciador y siga las instrucciones para limpiar el sistema de fluidos del secuenciador.
Utilice una linterna para inspeccionar visualmente la celda de flujo en busca de burbujas que pasen a través de los carriles, para asegurarse de que no haya fugas. Cuando finalice la secuencia de lavado, abra la pestaña Secuencia e inicie una nueva ejecución, dirigiendo los datos de salida a una unidad de red. Cargue una hoja de muestra para desmultiplexar e introduzca la información de reactivo adecuada.
Utilice una celda de flujo usada para preparar el sistema, con los reactivos de secuenciación. Una vez completada la generación del clúster, quite la celda de flujo. Y rocía ligeramente la celda con agua.
Limpie la celda de flujo seca con papel de lente, seguido de un spray ligero con 95% de etanol. Después de limpiar la celda de flujo de nuevo, compruebe la superficie de la célula de flujo contra la luz para asegurarse de que está limpia, sin residuos de sangre ni residuos de sal. Cuando finalice el paso principal, cargue la celda de flujo agrupada y comience la secuenciación.
El software del visor de análisis de secuencia se iniciará automáticamente. Aproximadamente 26 horas más tarde, supervise la calidad de los datos de secuenciación a través del software de control de secuencias altas y el software de vista de análisis de secuenciación para evaluar la calidad de los datos y para cualquier solución de problemas. A continuación, cuando finalice la secuencia, cambie la junta de celda de flujo y realice un lavado de mantenimiento antes de comenzar la siguiente ejecución.
Después de la toma de imágenes citométricas de flujo de las células dendríticas expuestas a contaminantes, abra ImageJ Fiji y combine las 100 imágenes celulares guardadas para los grupos de muestras de células dendríticas humanas no expuestas y expuestas a contaminantes en archivos individuales según el grupo de tratamiento. Para analizar la colocación de CD1d y Lamp1 dentro de las dos poblaciones, abra la imagen de celda combinada 100 expuesta a contaminantes y seleccione Imagen, Color y Canales divididos para dividir la imagen en dos imágenes individuales con un solo fluoróforo por canal. Para crear un gráfico de dispersión de los píxeles colocados, seleccione Analizar, Colocación y Umbral de colocación y pulse Imprimir pantalla para guardar el trazado de dispersión.
Para calcular el coeficiente de colocación de Mander para cada imagen unicelular, utilice la herramienta de selección de óvalo para seleccionar una imagen de una sola celda en el archivo de imagen con los canales divididos y vuelva a seleccionar Analizar, Colocación y Umbral de colocación. A continuación, seleccione Canal 1 en el cuadro de diálogo para la región de interés y haga clic en Aceptar. Cuando se haya calculado el coeficiente para las 100 imágenes de celda, importe los resultados en una hoja de cálculo adecuada y repita el análisis para la muestra de celda no expuesta de control. Mediante la secuenciación de ARN y los análisis de datos transcriptómicos, se identificaron varios grupos genéticos alterados importantes, incluido el metabolismo de los lípidos y las funciones endocíticas, en los DC expuestos a contaminantes.
A nivel de imagen de celda individual, las células dendríticas positivas CD11c HLADR se pueden cercar, de acuerdo con su coexpresión CD1d y Lamp1. Las células dendríticas no expuestas de control demuestran una colocación mínima de proteínas CD1d y Lamp1, lo que indica un nivel basal de tráfico endocrino CD1d y un alto nivel de expresión superficial en condiciones fisiológicas. Mientras que el CD1d se conserva en los compartimentos endocíticos tardíos de las células dendríticas expuestas a contaminantes, lo que confirma los perfiles genéticos endocrinos alterados en esta población celular experimental.
Después de combinar las imágenes celulares individuales en un único archivo de imagen, las imágenes individuales se pueden dividir según su expresión de fluoróforo, y la colocación de la intensidad de píxeles entre los dos canales se puede visualizar en una gráfica de dispersión. El grado de colocación entre las proteínas CD1d y Lamp1 en los dos grupos de tratamiento se puede cuantificar utilizando los coeficientes de Mander. Si la intensidad proteica es hetergénea entre las zonas colocadas y no colocadas, la intensidad colocalizada no será paralela a las áreas colocadas, por lo que también es importante evaluar aún más la colocación de las dos proteínas, en función de la intensidad del píxel.
Una vez masterída, el análisis de imagen se puede completar en dos horas, y la configuración de secuenciación de ARN se puede completar en tres horas, si cada técnica se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de que todos los reactivos están correctamente cargados en las posiciones correctas, y que no hay fugas en el secuenciador. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación de micro ARN, exoma o mast celular para responder preguntas adicionales sobre la expresión global de micro ARN, la mutación genética o la metilación del ADN, respectivamente.
Así que después de su desarrollo, esta técnica ayudará a los investigadores en el campo del análisis de imágenes celulares, y la secuenciación de próxima generación para explorar el efecto del contaminante ambiental en la expresión génica y la función de la proteína. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo configurar la secuenciación de próxima generación, y el análisis del imager de la colocación de proteínas. No olvide que trabajar con sustancias químicas contaminantes tóxicas en muestras de sangre humanas puede ser extremadamente peligroso.
Precauciones tales como el uso de una campana de humo químico, y equipo de protección personal, siempre deben tomarse al realizar estos procedimientos.
