Damos las gracias a Lars Dölken Consejo establecer 4sU etiquetado para las células T primarias; Elisabeth Graf y Thomas Schwarzmayr ayuda crítica en las generaciones de la biblioteca y la secuencia; Dirk Eick y Andrew Flatley para proporcionar los anticuerpos RNAPII y la célula de T; N. Henriette Uhlenhaut y Franziska Greulich para ayuda en la preparación de la biblioteca de ChIP-seq; Caroline C. Friedel fue apoyado por becas de FR2938/7-1 y CRC 1123 (Z2) de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher fue apoyado por la beca GL 870/1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) y del centro alemán de investigación de Diabetes (DZD), Helmholtz Zentrum München.

<ol>
	<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation.">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li><li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection.">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126 (2015).</li><li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+advances,+challenges+and+opportunities.">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution.">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li><li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription,+Splicing,+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses.">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ContextMap+2:+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping.">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints.">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).</li><li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor.">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li><li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+housekeeping+genes,+revisited.">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li><li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533 (2016).</li><li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover.">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).</li><li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs.">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li><li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles.">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Analizar todo el proceso de regulación génica es necesario comprender las adaptaciones celulares en respuesta a un estímulo específico o tratamiento. La combinación total de RNA-seq, 4sU-seq, ribosome profiling y ChIP-seq en diferentes puntos temporales conduce a un análisis exhaustivo de los principales procesos de regulación génica en el tiempo. Un profundo entendimiento de los procesos biológicos es necesaria para definir la configuración experimental así como los puntos de tiempo óptimo.
Ya que los métodos para el estudio de regulación génica mejoran rápidamente, estos protocolos puede adaptarse a los cambios rápidos. Sin embargo, proporcionan los medios más importantes para el estudio de mecanismos de regulación genética básica en cualquier tipo de célula. Aquí, discutimos algunos de los escollos y hechos que uno tiene que considerar cuando se utilizan estos métodos.
Células: Las células deben ser altamente viables y, si usando las células aisladas primarias, pureza de poblaciones celulares debe garantizarse (por ejemplo, el análisis FACS para las células T primarias). Células un poco estresadas pueden influir en los resultados de estos métodos de secuenciación muy sensibles y disminuir la cantidad de RNA recién transcrito o traducido y conducir a lecturas no deseadas de la respuesta de estrés en los resultados de la secuencia. La velocidad de centrifugación mencionada en este protocolo para que sedimenten las células está optimizada para las células T primarias. Por lo tanto, ajustar la velocidad según el tipo de célula.
4 sU efectos sobre la fisiología de la célula: Además de las opciones mencionadas para verificar la mínima perturbación a la fisiología celular a 4sU además, pueden realizarse análisis más o adicional, especialmente cuando números de celda son limitados. Efectos sobre la proliferación celular pueden ser probados verificando el tiempo de duplicación de células simplemente contando las células etiquetadas y sin etiquetar. Inducción de estrés nucleolares podría probarse también mediante el análisis de la morfología celular mediante tinción de inmunofluorescencia de nucleolin y núcleos. Para verificar más lejos el impacto de 4sU, expresión génica global alterada se podía medir correlacionando leer cuentas de etiquetado ARN ARN total sin etiqueta.
Números de celular: En vitro generados por las células T, se recomienda a partir de por lo menos la cantidad de las células indicadas en la tabla 2. Elegir números apropiados por método según el tipo de células. Puesto que las células T tienen menos citoplasma y el ARN en comparación con otras células, probablemente menos cantidad de otras células será suficiente. Para ChIP-seq, número de células altamente depende el anticuerpo utilizado y el nivel de expresión de la proteína de interés dentro de las células. Para histonas o ChIP RNAPII, pueden utilizarse células particulariz, mientras que el número de células necesita incrementarse cuando se utilizan factores de transcripción, sobre todo si se expresan en niveles bajos.
4 sU etiquetado y RNA Biotinilación: Cuando se utilizan células adherentes, 4sU etiquetado puede dirigir según lo descrito por Rädle et al. 19 desde 4sU incorporan muy rápidamente de las células, puede ser agregado directamente al medio de suspensión, adherente o células semi-adherentes.
Se recomienda comenzar la Biotinilación con 60-80 μg de ARN. Sin embargo, se puede utilizar menos cantidad de RNA, aunque no probamos por menos de 30 μg. Añadir un coprecipitant (e.g., GlycoBlue) cuando precipitando RNA si el precipitado es difícil de ver. Duffy et al también han demostrado que biotina activa methylthiosulfonate (MTS-biotina) reacciona más eficientemente con ARN marcados con 4sU que HPDP-biotina31. Por lo tanto, cabe considerar cambiar a MTS-biotina, en particular, para la recuperación de ARNs pequeños, que tienden a tener menos residuos de uridina (véase el protocolo de Biotinilación mencionado por sede de Duffy et al.; purificación del ARN marcado con 4sU, Procedimientos experimentales).
Para la recuperación del ARN recién transcrito, es posible utilizar granos paramagnéticos o granos de ARN limpieza de su elección. Siempre tener en cuenta que estos kits pueden o no pueden purificar para RNAs específicos. Por ejemplo, si usted está interesado en miRNAs, considere el uso de kits específicos para la secuencia y la captura de miRNA.
Cuantificación de RNA recién transcrito: Para cuantificar con precisión el RNA recién transcrito, la medición debe ser realizada por un fluorómetro adecuado (véase Tabla de materiales). Dentro de 1 h de exposición 4sU, RNA recién transcrito representa alrededor del 1-4% del ARN total. RNA recién transcrito de 1 h con la etiqueta, las células T activadas consiste en ~ 90-94% de ARNr11.
Ribosome Profiling: Cuando se establezca el método, se determinó que utilizando 1.5 x la cantidad de nucleasa que sugerido en el protocolo original garantiza una digestión apropiada. También, efectos adversos no se han divulgado para cantidades elevadas de nucleasa. Ya que es muy difícil de overdigest la PRSA mientras que forman parte del RNA por proteínas ribosomales, todavía un poco puede aumentar la cantidad para valorar la digestión óptima nucleasa.
Si es inferior a 500 ng de RNA del FPR fueron recuperados en paso 4.4.2, repita el agotamiento de los rRNA y piscina purificaron PRSA con ARN Clean & concentrador de 5 columnas. Por otra parte, carga de dos muestras idénticas al lado uno al otro en gel (paso 4.5.3) y láminas de gel de piscina durante la elución de RNA del gel (paso 4.5.6).
Se recomienda cortar la PRSA sobre un gel tan ajustadamente como sea posible a las bandas de nt 28 y 30. Esto ayuda a eliminar fragmentos no deseados de rRNAs y tRNAs, que más tarde se convertirá en parte de su biblioteca y reducir lee la secuencia de la PRSA.
También es aconsejable evitar la luz durante la purificación del gel UV. Esto puede crear muescas en los fragmentos de ARN, como dímeros de pirimidina, que al final pueden afectar seriamente la preparación de la biblioteca y los resultados de secuenciación.
Preparación de la biblioteca y la secuencia de datos: Ribosoma perfiles de protocolo permite para generar una biblioteca de cDNA adecuada para secuenciación. Las muestras generadas por 4sU etiquetado pueden ser utilizadas directamente para la preparación de la biblioteca con cualquier kit de secuenciación apropiada de RNA. Desde el RNA recién transcrito, especialmente cuando uso corto etiquetado veces, puede no ser aún cofia, ninguna selección de poly-A debe ser realizada. En su lugar, recomendamos agotamiento del rRNA para evitar reducir la profundidad de la secuencia de la muestra real. Usando las células de T, comenzamos con 400 ng de ARN recién transcrito y total (según el kit, ver materiales), realiza rRNA agotamiento y reduce los ciclos para la amplificación de la polimerización en cadena minimizar el sesgo de la polimerización en cadena. Preparación de la biblioteca puede realizarse con menos material de partida. Para tener en cuenta números de complejidad biblioteca de ciclos PCR debe ser optimizado.
Para ChIP-seq también hay muchos kits disponibles para la preparación de la biblioteca. En nuestra biblioteca de manos preparación trabajó bien a partir de 2 ng de DNA ChIP (ver materiales para una sugerencia sobre que kit a utilizar). Asegúrese de comprobar los índices de balance de color durante la secuencia. Se recomienda la secuencia de profundidad ≥ 40 x 106 Lee cada 4sU-seq, total RNA-seq, y muestras de ChIP-seq y ≥ 80 x 106 lecturas para perfiles muestras del ribosoma. La profundidad de la secuencia depende de la muestra y el análisis de aguas abajo de la Bioinformática y se debe considerar cuidadosamente. Analizar lecturas intronic de empalme cotranscriptional, 100 secuenciación del extremo apareado bp debe ser elegido.
Sesgo de secuencia: La secuencia se ha convertido en el estándar de oro para determinar cambios globales en la transcripción, traducción o atascamiento del factor de transcripción. Dentro de estos últimos años, los métodos existentes fueron empujados hasta sus límites o fueron desarrollando nuevas técnicas para secuenciar cada vez más pequeñas cantidades a partir de ARN. Esto requiere la amplificación del cDNA, que introduce ruido o sesgo. Recientemente, identificadores únicos moleculares (UMIs) fueron desarrollados para identificar experimentalmente duplicados introducidos por PCR. Recientemente, fue demostrado que UMIs sólo levemente mejoran el poder de la secuenciación y tarifa falsa del descubrimiento de expresión génica diferencial32. Sin embargo, considerar el uso de identificadores únicos de moleculares (UMIs) para todas las bibliotecas de la secuencia de control para la complejidad de la biblioteca, especialmente cuando a partir de pequeñas cantidades de ARN y se necesitan muchos ciclos PCR.
De buffer y soluciones: Todos los búferes para 4sU-seq y perfiles de ribosoma deben ser preparados bajo estrictas condiciones libre de ARNasa, con agua libre de nucleasa. Se recomienda comprar prefabricada NaCl libre de nucleasa, Tris-HCl, EDTA, citrato de sodio y agua. Para asegurar condiciones libres de nucleasas, una solución descontaminante de Rnasa se puede utilizar para limpiar pipetas o superficies. Todos los búferes para ChIP-seq deben ser menos libres de DNasa y puede almacenarse a temperatura ambiente. Siempre añadir inhibidores de la proteasa y, opcionalmente, los inhibidores de la fosfatasa justo antes de usar y mantener en hielo.
Bioinformática: Análisis de los datos de la secuencia (es decir, ChIP-seq, RNA-seq y ribsosome perfiles) implica el control de calidad (p. ej., con FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), ajuste del adaptador (por ejemplo, con cutadapt20) seguido de asignación para el genoma de referencia de las células bajo estudio. Para datos de RNA-seq (total y 4sU-seq), así como perfiles de datos del ribosoma, un asignador de RNA-seq empalmado se requiere, como ContextMap 221. Para alineaciones de datos unspliced ChIP-seq, usando BWA-MEM22 es suficiente. Expresión génica puede ser calculada usando el RPKM modelo (lecturas por Kilobase de exón por millón fragmentos asignados)1, después de determinar leer cuentas por gene usando un programa, por ejemplo, featureCounts23. Para llamar de pico desde datos de ChIP-seq, un número de programas está disponible, por ejemplo, Mac24 o GEM25. Más análisis descendentes pueden realizarse en R26, en particular mediante herramientas proporcionadas por el proyecto de Bioconductor27.
Aquí, un reto importante en la integración de niveles de ARN 4sU y total y actividad traslacional de ribosome profiling es normalización. Un enfoque clásico para resolver este problema es normalizar niveles de genes de mantenimiento de la casa. Para reducir el ruido debido a las fluctuaciones al azar de los genes individuales de mantenimiento de la casa, se recomienda usar no sólo unos cuantos genes de mantenimiento de la casa pero niveles mediana para un conjunto más amplio, por ejemplo la > 3.000 genes de mantenimiento elaborados por Eisenberg y Levanon28 . Para el cálculo de las tasas de facturación RNA de ratios de 4sU-de que ARN total, normalización se basa en volumen de ventas promedio de precios (por ejemplo, suponiendo un período de RNA de 5 h)29. Sin embargo, puesto que esto no supone ningún cambio general para genes de mantenimiento de la casa, se recomienda utilizar enfoques de análisis independiente de la normalización, por ejemplo, la agrupación de una serie de tiempo de los diferentes tipos de datos para identificar grupos de genes basados en correlación con un comportamiento distinto en la transcripción y traducción durante la activación. Para una descripción detallada sobre la bioinformatical integración de los diferentes tipos de datos, nos referimos a la publicación original11.
Análisis de la integración de tarifas y datos de facturación: Un trabajo recientemente publicado33 determinado por un control de gene multiplexados (MGC) de vida media en comparación con métodos globales podría demostrar que vida media correlaciona mejor con los obtenidos por métodos de etiquetado metabólicos en comparación con otros métodos (p. ej., inhibición general de la transcripción por las drogas). Sin embargo, cabe mencionar que las diferencias entre los cálculos de Half-Life pueden surgir y han descrito 15,34. Responsables de la mayoría de los problemas y diferencias que son introducidas por la respuesta de estrés debido a la exposición prolongada 4sU. Por lo tanto, es indispensable excluir la respuesta de estrés presentada por etiquetado 4sU. Para validar aún más tasas de rotación, se recomienda el uso de MGCs.
Además, un conjunto de datos generado aquí podría emplearse para un análisis (p. ej., Reglamento de ARN largo no codificante) datos más integrante35,36.

En los últimos años, la secuenciación del RNA (RNA-seq) se ha convertido en la herramienta estándar para analizar todo expresado ARN dentro de una célula o un organismo1. Sin embargo, para entender todo el proceso de las células en respuesta a una estímulo específica y las drogas, es necesario determinar completamente todos los procesos subyacentes, desde la transcripción de mRNA a procesamiento, rotación y traducción. Cambios a corto plazo en la transcripción del RNA no pueden medirse por RNAseq total, ya que cambios de ARN total dependen de factores por ejemplo RNA vida media y actividad transcripcional, que son una plantilla pobre para reflejar la adaptación de las células efectos ambientales2,3. De hecho, han desarrollado una variedad de nuevas técnicas de secuenciación que permiten un análisis de los diferentes pasos en el proceso de gene Reglamento4 cuando se combinan en la forma correcta. Este protocolo describe cómo combinar algunas técnicas de secuenciación más fácilmente aplicables que permitan el seguimiento de la regulación de las capas esenciales de mRNA de manera comparativa. Para el análisis de actividad transcripcional, se han descrito una variedad de métodos, como el análisis de la tapa de gene expresión (jaula)5, alargamiento natural transcripción secuencia (NET-seq)6y genoma nuclear precisado (GRO-seq)7 , 8, así como secuenciación del bromouridine (Bru-seq) y 4-thiouridine-secuenciación (4sU-seq), que utilizan metabolitos que se incorporan en recién transcripción RNA9,10, sólo por mencionar algunos. Mientras jaula identifica el sitio de inicio de transcripción exacta, red-seq y GRO-seq entregan información más precisa acerca de las direcciones de lectura y 4sU-seq (que es el método descrito aquí) detecta sólo recién transcrito RNA. Sin embargo, 4sU seq es muy sensible y puede ser aplicado en diferentes marcos de tiempo para medir la actividad transcripcional cuantitativa en activamente cambiando las células, así como cambios cuantitativos en el procesamiento del mRNA (que ocurre dentro de minutos)9, 11,12. Además, es ideal para combinar con RNA-seq para calcular tasas de rotación de RNA genes94sU-seq. La transcripción del mRNA se lleva a cabo por ARN polimerasa II (RNAPII), que a su vez está influenciada por una multitud de factores, tales como factores de transcripción, modificaciones de las histonas y general activadores/represores que puede incluso ser parte del transcripcional complejo. Para comprobar cuántas regiones de potenciador de promotor de genes están vinculadas por un factor, se ha desarrollado ChIP-seq, que ahora es el método estándar para este propósito, debido a muchos anticuerpos comercialmente disponibles13. Sin embargo, aunque ChIPseq da información clara sobre donde regula factores de atar, no refleja si en efecto conduce a cambios en la transcripción14. Por lo tanto, realizar ChIP-seq con 4sU seq es la combinación ideal para este tipo de preguntas biológica. Regulación de la expresión génica puede también ocurrir en una etapa posterior, ya que los niveles de mRNA y proteína no necesariamente se correlacionan15,16, indicando potencialmente significativo regulación traduccional o poste-de translación nivel, dependiendo del contexto. En el año 2011, ribosome profiling había sido primero combinado con RNA-seq y ahora es el método de elección para cuantificar los cambios que se producen rápidamente en la proteína, puesto que todavía hay algunos límites de sensibilidad con espectrometría de masa17. De hecho, las tasas de traducción obtenidas de tales métodos han demostrado entregar una relativamente buena estimación de cambios en los niveles de proteína (menos medidos para cambios a largo plazo) y permite una visión más detallada sobre el proceso de traducción, por ejemplo, la determinación de traducción alternativa y el inicio Marcos17. El uso de la combinatorio de los cuatro métodos puede utilizarse en estado estacionario, entre los diversos tipos de células, o en una serie de tiempo el experimento de un cambiante celda11. Este uso proporciona un resumen de todo el genoma de los cambios en el atascamiento del factor de transcripción que influyen en la transcripción de ARN, procesamiento y traducción.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;4sU-labeling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &amp;ndash;20&amp;deg;C in aliquots of 50-500 &amp;micro;l; do not refreeze.</td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Optional</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>WARNING &amp;ndash; HAZARDOUS TO HEALTH</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; always prepare fresh</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&amp;deg;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Use in step 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polypropylene 15&amp;nbsp;ml centrifuge tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &amp;times; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &amp;ndash; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Optional; includes Buffer RLT</td></tr><tr><td>Sodium citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Store at 4&amp;deg;C, includes &amp;micro;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell viability and stress assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>Optional</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Optional</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Washing Buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td><td>store at 4 &amp;deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA precipitation buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Optional</td></tr><tr><td>UV/VIS spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptors for 15 ml tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>One stand holds 8 &amp;micro;Macs columns.</td></tr><tr><td>Ultra-fine scale</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Optional</td></tr><tr><td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome Profiling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (Yeast)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (Mammalian)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-25 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 or MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(High Sensitivity DNA Kit)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Already needed for 4sU-seq</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;All other consumables and equipment are listed in the User guide&lt;/strong&gt;</td><td>!!!</td><td></td><td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ChIP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Add to a final concentration of 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Always prepare fresh</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ChIP library preparation kit</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Or use the kit of your choice</td></tr><tr><td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Prepare a 2M stock solution</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td></tr><tr><td>Rnase, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (ChIP grade if possible)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>or antibody of interest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&amp;nbsp;mM EDTA; 16.7&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td>Store at RT up to 6 months</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>Nuclei-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td></tr><tr><td>Wash buffer I</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer II</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&amp;nbsp;mM EDTA; 20&amp;nbsp;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.25&amp;nbsp;M LiCl; 1% NP-40; 1&amp;nbsp;mM EDTA; 10&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>use this instrument for electrophoretical analysis</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>or tubes special for your sonication device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td><td></td><td></td><td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &amp;micro;l each tube)</td></tr><tr><td>Magnetic stand for tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td></tr></tbody></table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

Después de la activación, las células cambian rápidamente sus programas funcionales y, por tanto, su perfil de expresión génica. Ocurren grandes cambios en la expresión génica, por ejemplo, durante la diferenciación celular, morfogénesis y estimulación funcional (por ejemplo, la activación de células inmunes), o después de la exposición a las drogas y otros factores del entorno local. Dependiendo del tipo de estímulo y de la célula, estos cambios ocurren rápidamente y en cualquier nivel de regulación génica. Mostrando todos los procesos moleculares de una célula responde a un determinado tipo de estímulo y las drogas es una de las tareas más difíciles en biología molecular. Aquí, describimos un protocolo que permite el análisis simultáneo de múltiples capas de regulación génica. Comparar, en particular, factor de transcripción vinculante (cromatina-inmunoprecipitación-secuenciación (ChIP-seq)), transcripción de novo (4-thiouridine-secuenciación (4sU-seq)), procesamiento de mRNA y facturación, así como traducción (ribosoma profiling). Mediante la combinación de estos métodos, es posible visualizar un plan de acción detallado y genoma.
Secuencia de RNA recién transcrito es especialmente recomendada cuando se analizan rápidamente adaptar o cambiar sistemas, ya que esto representa la actividad transcripcional de los genes durante el tiempo de exposición 4sU (independientemente de si son para arriba - u o). La combinatoria total RNA-seq y perfiles de ribosoma además permite el cálculo de las tasas de rotación y traducción de RNA. Análisis Bioinformático de los resultados de secuenciación de alto rendimiento permite muchos medios para el análisis e interpretación de los datos. Los datos generados también permite seguimiento co-transcriptional y alternativa de empalme, por citar algunos resultados posibles.
El enfoque combinado descrito aquí puede ser aplicado para organismos diferentes modelos o tipos de células, incluyendo células primarias. Además, ofrecemos protocolos detallados para cada método utilizado, incluyendo controles de calidad y discutir posibles problemas y dificultades.

4 sU etiquetado: verificar óptimo 4 las condiciones de sU etiquetado (apoptosis, tensión nuclear, citoplasmático estrés), el tiempo y la concentración: 4sU elevada puede inhibir la producción y procesamiento del rRNA e inducen citoplásmicos como nucleares estrés30. Por lo tanto, las células de interés deben analizarse para 4sU inducida por estrés, así como apoptosis. Se recomiendan análisis de Western blot para la visualización de la acumulación de p53, que indica la tensión nuclear, aumentando los niveles de EIF2a fosfo que muestran tensión citoplasmática y celular activado por fluorescencia clasificación análisis (FACS) de apoptosis. Altos niveles y la larga exposición a 4sU o drogas como thapsigargin o arsenito se pueden utilizar para inducir estrés celular. Para inducir la apoptosis, muerte celular, las células fueron tratadas con BH3I-1 (500 ng/μL) o incubados por 5 min a 95 ° C (choque térmico). Anexina V/7-AAD tinción se utilizó para determinar apoptosis (anexina V) y las células muertos (7-AAD). Etiquetado de in vitro generados por las células Th1 primarias durante 0,5 h con 500 μm 4sU (concentración final) apoptosis (figura 1) sino provocar suficiente 4sU Constitución ni 1 h con 200 μm 4sU ni induce señales de estrés celular.
RNA etiquetado tiempo también puede ser acortado (≤5 min) que conduce a un aumento de breve duración intronic secuencias veces Etiquetadoras comparados más de largo. Para visualizar las tasas co-transcriptional de empalmes, etiquetado 4sU veces no deben exceder de 30 minutos. Para más detalles sobre 4sUlabeling, consulte Rädle et al. 19
Control de calidad: Integridad del RNA es de gran importancia cuando se procesa el RNA. Es más conveniente para comprobar la calidad del RNA del RNA marcado con 4sU después de Biotinilación análisis electroforéticos (véase Tabla de materiales). Considerar la verificación de RNA aislado de paso 2.2.2, especialmente cuando se usa para la secuencia de ARN total. Número de integridad del RNA (RIN) debe ser ≥8 para asegurar la integridad del RNA para tratamiento posterior (figura 3).
Análisis electroforéticos pueden utilizarse también para verificar el RNA recién transcrito. Tenga en cuenta que el RNA recién transcrito contiene significativamente menos maduras rRNAs comparado con ARN total con las típicas bandas de rRNA es mucho menos prominente.
Ribosome profiling: amplificación por PCR de la biblioteca de cDNA: amplificación de cDNA (paso 4.9.1) es un paso crítico para asegurar buena secuencia resultados. Analizar las bibliotecas amplificadas por análisis electroforéticos. Una buena muestra de bibliotecas amplificadas muestra un pico alrededor de 140-160 bp (Figura 4A). Cantidades excesivas de adaptador dímeros deben ser evitado (Figura 4B) y las muestras deben ser purificadas más mediante el procedimiento de purificación de página según protocolo del fabricante (purificación de la página de productos de la polimerización en cadena). Pueden ocasionar demasiada plantilla o demasiados ciclos PCR amplificación excesiva caracterizada por la aparición de bandas de peso molecular mayor de lo esperado, untadas de PCR de productos y productos de dímero de adaptador (figura 4). Para la mayoría de las muestras 1-5 μl de cDNA circular y 9 ciclos PCR para la amplificación típicamente producirá cantidades suficientes del correcta del producto de PCR.
ChIP: cromatina de corte: Condiciones de corte óptimas deben ajustarse para cada tipo de célula. Determinar de antemano las condiciones de corte (por ejemplo, el número de ciclos de potencia alta o baja). Utilice el mismo número de células y el mismo volumen para probarlos, ya que una menor densidad celular aumenta la eficacia del corte. Trate de evitar la sobre - o bajo-corte la cromatina. Fragmentos de cromatina grande pueden afectar dramáticamente resultados ChIP por obstrucción y exceso de corte puede destruir epítopes de la proteína de interés, llevando a una menor eficacia vinculante por el anticuerpo. En este experimento, los mejores resultados se obtienen cuando la principal fracción de la cromatina esquilada fue alrededor de 1.000 bp o ligeramente inferior (figura 5A).
Verificación de ChIP por qPCR: Antes de empezar el ChIP, es recomendable comprobar si el anticuerpo utilizado es adecuado para el ChIP (si es posible, utilizar anticuerpos grado de ChIP) de ChIP-qPCR. Verificar el ChIP para la secuenciación por qPCR antes de iniciar la preparación de biblioteca (ver paso 5.6.5). Diseño de cebadores que se unen a un sitio de destino conocido de la proteína de interés. Si el sitio de destino exacto dentro de un gen es desconocido, varios pares de cartilla pueden utilizarse para analizar el gene y elementos reguladores asociados. Para RNAPII ChIP de Th1 células interferón, que es transcripcionalmente alza sobre el estímulo, y cartillas de actina pueden ser utilizados como control positivo. Sox9 e insulina sirven como un control negativo, dado que estos genes no se expresan en células Th1 (figura 5B). Recuerde no utilizar imprimaciones que abarca el exón, que normalmente se utilizan para qPCR de mRNA. También se puede usar un control de IgG para probar la especificidad del anticuerpo usado. Immunoprecipitated ADN puede medirse con un fluorómetro adecuado (véase Tabla de materiales). Cantidades de ADN hibridada por el control de IgG deben ser significativamente inferior comparados con la cantidad de ADN que el anticuerpo de interés.
Replica: prueba de importancia biológica: Es muy recomendable para realizar el experimento cinético para todos los métodos a partir de la misma agrupación de células para las células tengan la misma identidad de las muestras sin tratar y tratadas (figura 2). Sin embargo, se recomienda tomar pequeñas alícuotas de momentos principales de cada método comparar muestras biológica reproduce (por ejemplo, por qPCR, análisis FACS). Esto permite evaluar si el tratamiento para ambas repeticiones fue reproducible y podría continuar con la secuencia. Validación de las repeticiones debe realizarse mediante análisis de bioinformatical. Reproducibilidad de los resultados puede ser evaluada en términos de correlación entre los valores FPKM entre repeticiones y visualizados usando diagramas de dispersión (figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Figura 1: Verificación de las condiciones óptimas de etiquetado 4sU sin perturbar la fisiología de la célula (figura de Davari, et al. 11) (A) detección de apoptosis de las células por el análisis FACS: In vitro genera Th0 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de 4sU (indicado entre paréntesis) de 0.5 h, 1 h y 2 h, respectivamente. Tratamiento de BH3I-1 fue utilizado para inducir apoptosis determinada por anexina V, mientras que el choque del calor (a 5 min a 95 ° C) fue utilizado para inducir la muerte celular determinada por 7-AAD. (B) análisis de Western blot para p53 de 4sU tratados y las células T activadas: las muestras fueron etiquetadas con 200 μm 4sU para el tiempo indicado de la activación, excepto el punto de tiempo de 0.5 h que fue etiquetado con 500 μm 4sU. (C) análisis de Western blot de fosfo-EIF2a y total EIF2a en células Th1 activadas con las mismas condiciones de etiquetado como en (B). Thapsigargin fue utilizado como control positivo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Figura 2: Resumen esquemático de una instalación cinética para seguimiento de los cambios del genoma Este esquema muestra la configuración para combinar 4sU-seq, total RNA-seq, Ribosome Profiling y ChIP-seq para estudiar cambios de genoma sobre el tratamiento de la célula. Las células de la piscina y apartar el número de células de control no tratados. Tratar células restantes y para cada punto de método y tiempo. Células de etiqueta sin tratamiento/tratada para 4sU-seq con 4sU como se describe. Puntos del tiempo y las muestras de cada método dependen de la pregunta biológica específica examinada. Tomar muestras para cada punto del tiempo y método y seguir el dedicado parte del protocolo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Figura 3: control de calidad de ARN marcado con 4sU Total RNA y biotinilado RNA de las células Th1 activadas se analizaron en un equipo Bioanalyzer. 18S rRNA y 28S rRNA se muestran y número de integridad del RNA (RIN) está dada por el instrumento para determinar la integridad del ARN. RIN debe ser ≥8 para asegurar la integridad del RNA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Figura 4: Perfiles de equipo Bioanalyzer de ribosoma perfiles de bibliotecas (A) A buena biblioteca: muestra un pico en el rango de tamaño esperado (140-160 PB) y purificación adicional no es necesario. (B) este ejemplo muestra excesiva adaptador dimer producto amplificado (120 bp) en relación con el producto deseado (bp 140-160). Esta biblioteca requiere más purificación. (C) una muestra demasiado amplificada: picos de peso molecular mayor de lo esperado y borrosos los amplicones PCR son accesibles (indicado por las flechas). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Figura 5: Tamaño de cromatina óptimo después de la esquila y la verificación de ChIP por qPCR (A) Agarose gel imagen muestra el tamaño óptimo del fragmento de la cromatina esquilado de tres muestras que fueron esquiladas para 25 ciclos en un sonicador y purificado como se describe antes en el protocolo. (B) resultados de la Q-PCR de un ChIP de RNAPII total (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) se representa como un porcentaje de entrada. IFNg y actina cartillas fueron utilizados como un positivo mientras que Sox9 y la insulina son controles negativos (ambos genes no se expresan en las células Th1 activadas). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Figura 6: Comparación de biológico Replica (figura de Davari et al. 11) Diagrama de dispersión representante comparando valores de expresión (FPKM) entre réplicas de recién transcrito (4sU) RNA 4 h después de la estimulación de las células Th1 activadas. La línea verde indica valores iguales de FPKM y correlación de rango se indica en cada parcela.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Duración de etiquetado (min)</td>
			<td>4sU recomendada concentración (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Se recomienda concentraciones de 4sU (de Rädle, et al. 19) El rango de concentraciones recomendadas 4sU está indicado para diferentes tiempos de etiquetado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Método</td>
			<td>Número de células</td>
			<td>Cantidad de RNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>etiquetado 4sU</td>
			<td>≥ 2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribosome profiling</td>
			<td>≥ 2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥ 2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Cantidad necesaria de las células T primarias Cantidad mínima requeridas primarias de células de T para cada método. Cantidades pueden ser menos tratándose de otros tipos de células.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

real-time-analysis-transcription-factor-binding-transcription

Research

JoVE Journal

Genetics

13.4K vistas.  Helmholtz Zentrum München. Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Video: Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Investigación

Genética

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

En tiempo real de imágenes en vivo de las células T de señalización Formación de complejos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Inmunología e Infección

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Mapeo de las relaciones estructura-función de los factores de transcripción oncogénicos desordenados utilizando el análisis transcriptómico

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Investigación sobre el cáncer

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Biología del Desarrollo

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biología

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

La cromatina Análisis de Interacción con la etiqueta de secuenciación pareadas final (Chia-PET) para el mapeo de la cromatina y la comprensión de las interacciones Reglamento Transcripción

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imágenes de células vivas de la actividad transcripcional en roturas de doble cadena de ADN

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Resumen

Explorar más videos

PLAYLIST