Si ringrazia Lars Dölken per consigli per stabilire 4sU etichettatura per cellule di T primarie; Elisabeth Graf e Thomas Schwarzmayr per aiuto critico nelle generazioni di biblioteca e sequenziamento; Dirk Eick e Andrew Flatley per fornire gli anticorpi delle cellule T e RNAPII; N. Henriette Uhlenhaut e Franziska Greulich per aiuto nella preparazione di libreria per ChIP-seq; Caroline C. Friedel è stata sostenuta da sovvenzioni FR2938/7-1 e CRC 1123 (Z2) dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher è stata sostenuta dalla concessione GL 870/1-1 dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e il centro tedesco per ricerca di diabete (DZD), Helmholtz Zentrum München.

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Analizzando l'intero processo di regolazione genica è necessario comprendere appieno gli adattamenti cellulari in risposta a uno stimolo specifico o trattamento. Combinare totale RNA-seq, 4sU-seq, ribosoma profilatura e ChIP-seq in diversi momenti porta un'analisi completa dei principali processi di regolazione genica nel corso del tempo. Per definire la messa a punto sperimentale, nonché i punti di tempo ottimale è necessaria una profonda comprensione dei processi biologici.
Poiché i metodi per studiare la regolazione genica migliorano rapidamente, questi protocolli possono essere adattati ai rapidi cambiamenti. Tuttavia, essi forniscono i metodi più importanti per lo studio di meccanismi di regolazione genica base in qualsiasi tipo di cellula. Qui, discutiamo alcune delle insidie e fatti si deve considerare quando si utilizzano questi metodi.
Cellule: Cellule devono essere altamente valide e, se utilizza primarie cellule isolate, purezza delle popolazioni delle cellule deve essere garantita (ad es., analisi di FACS per cellule di T primarie). Anche un po ' stressate cellule possono influenzare i risultati di questi metodi di sequenziamento molto sensibile e abbassare la quantità di RNA appena trascritta o tradotta e portare a letture indesiderate della risposta dello stress nei risultati del sequenziamento. La velocità di centrifugazione citata in questo protocollo per agglomerare le cellule è ottimizzata per le cellule T primarie. Quindi, regolare la velocità in funzione del tipo di cella.
4 sU effetti sulla fisiologia cellulare: Oltre alle opzioni di cui sopra per la verifica minima perturbazione di fisiologia cellulare con l'aggiunta di 4sU, ulteriore e/o ulteriori analisi possono essere eseguita, soprattutto quando i numeri di cellulare sono limitati. Effetti sulla proliferazione delle cellule possono essere verificati controllando il tempo di raddoppiamento delle cellule semplicemente contando le cellule marcate e non marcate. Induzione di stress nucleolar poteva essere testati anche analizzando la morfologia delle cellule tramite colorazione di immunofluorescenza di nucleolina e nuclei. Per verificare ulteriormente l'impatto di 4sU, espressione genica globale alterata potrebbe essere misurata correlando leggere conteggi da RNA totale con etichetta a RNA totale senza etichetta.
Numeri di cell: Per in vitro generato le cellule di T, si consiglia di iniziare con almeno la quantità di cellule indicate nella tabella 2. Scegliere un numero adeguato con il metodo in base al tipo di cellule. Poiché le cellule di T hanno meno citoplasma e RNA rispetto ad altre celle, è possibile che gli importi più bassi più probabili di altre cellule sarà adeguati. Per ChIP-seq, numeri di cellulare dipendono altamente l'anticorpo utilizzato e il livello di espressione della proteina di interesse all'interno delle cellule. Per istone o RNAPII ChIP, ambra cellule possono essere utilizzate, mentre i numeri di cellulare devono essere aumentate quando vengono utilizzati fattori di trascrizione, soprattutto se essi sono espressi a livelli bassi.
4 sU-etichettatura e RNA biotinylation: Quando si utilizza cellule aderenti, 4sU etichettatura può essere diretto come descritto da Rädle et al. 19 dal cellule 4sU incorporano molto rapidamente, può essere aggiunto direttamente al mezzo di sospensione, aderente o celle semi-aderente.
Si raccomanda di iniziare la biotinilazione con 60-80 µ g di RNA. Tuttavia, gli importi più bassi di RNA possono essere utilizzati, anche se non abbiamo provato per meno di 30 µ g. aggiungere un coprecipitant (per esempio, GlycoBlue) quando precipitazione RNA se il pellet è difficile da vedere. Duffy et al hanno anche dimostrato che la biotina methylthiosulfonate-attivato (MTS-biotina) reagisce in modo più efficiente con 4sU-identificato RNA oltre HPDP-biotina31. Quindi, potrebbe essere utile in considerazione il passaggio a MTS-biotina, in particolare, per il recupero di piccoli RNA, che tendono ad avere meno residui di uridina (riferisca al protocollo biotinylation menzionato dalla sede di Duffy et al; purificazione di RNA 4sU-etichettati, Procedure sperimentali).
Per il recupero di RNA appena trascritto, è possibile utilizzare perline paramagnetici o RNA pulitura della vostra scelta. Sempre tener conto che questi kit possono o non possono purificare per RNA specifici. Se siete interessati a Mirna, consideri, ad esempio, utilizzando i kit specifici per l'acquisizione di miRNA e sequenziamento.
Quantificazione del RNA trascritto recentemente: Per quantificare con precisione appena trascritto RNA, misurazione deve essere eseguita da un fluorometro adatto (Vedi Tabella materiali). Entro 1 h di esposizione 4sU, recentemente trascritto RNA rappresenta circa 1-4% di RNA totale. Recentemente trascritto RNA di 1 h con l'etichetta, le cellule di T attivate è costituito di ~ 90-94% di rRNA11.
Ribosoma profilatura: Quando si stabilisce il metodo, abbiamo determinato che utilizzando 1,5 x la quantità di nucleasi rispetto a quanto suggerito nel protocollo originale garantisce una corretta digestione. Inoltre, gli effetti contrari non sono stati segnalati per importi elevati di nucleasi. Poiché è molto difficile overdigest la RPFs mentre fanno parte del RNA vincolato dalle proteine ribosomiali, è possibile aumentare ancora leggermente la quantità per titolo la digestione ottimale nucleasi.
Se meno di 500 ng di RNA RPF sono stati recuperati nel passaggio 4.4.2, ripetere lo svuotamento del rRNA e piscina depurata RPFs con RNA Clean & concentratore-5 colonne. In alternativa, è possibile caricare campioni identici due vicino a vicenda sul gel (punto 4.5.3) e fette del gel piscina durante l'eluizione di RNA dal gel (passo 4.5.6).
Si consiglia di tagliare il RPFs su un gel più strettamente possibile alle bande nt 28 e 30. Questo aiuta a eliminare frammenti indesiderati da rRNA e tRNA, che più tardi diventerà parte della tua libreria e ridurre letture di sequenziamento per il tuo RPFs.
Si consiglia inoltre di evitare luce durante la purificazione del gel UV. Questo può creare Nick in frammenti di RNA, come pure i dimeri di pirimidina, che alla fine possono compromettere seriamente la libreria preparazione e risultati di sequenziamento.
Preparazione di biblioteca e l'ordinamento dei dati: Ribosoma protocollo di profilatura consente di generare una libreria di cDNA adatta per il sequenziamento. Campioni generati da 4sU-etichettatura possono essere direttamente utilizzati per la preparazione di libreria con qualsiasi kit di sequenziamento di RNA appropriato. Dal RNA appena trascritto, soprattutto quando si usa bruscamente etichettatura volte, potrebbe non essere ancora poliadenilazione, nessuna selezione di poly-A deve essere eseguita. Invece, è consigliabile lo svuotamento di rRNA per prevenire la riduzione della profondità sequenziamento per il campione reale. Utilizzando cellule di T, abbiamo iniziato con 400 ng di RNA totale e recentemente trascritto (a seconda del kit, vedi materiali), eseguita rRNA svuotamento e ridotti cicli di amplificazione di PCR di minimizzare bias della PCR. Preparazione di libreria può essere effettuato con meno materiale di partenza. Per tenere conto di numeri di complessità di libreria di cicli PCR deve essere ottimizzato.
Per ChIP-seq ci sono anche molti kit disponibili per la preparazione di biblioteca. Nella nostra biblioteca di mani preparazione lavorato bene a partire con 2 ng di DNA ChIP (Vedi materiali per un suggerimento su quale kit da utilizzare). Assicuratevi di controllare gli indici per il bilanciamento del colore durante la sequenziazione. Si consiglia una profondità di sequenziamento di ≥ 40 x 106 letture ogni per 4sU-seq, totale RNA-seq e campioni di ChIP-seq e ≥ 80 x 106 letture per ribosoma campione di profilo. La profondità di sequenziamento dipende il campione e l'analisi bioinformatica a valle e dovrebbe essere considerata attentamente. Per analizzare introniche letture per l'impionbatura cotranscriptional, 100 sequenziamento accoppiato-fine bp deve essere scelto.
Sequencing bias: Sequenziamento è diventata il gold standard nel determinare cambiamenti globali nella trascrizione, traduzione o associazione di fattore di trascrizione. In anni recenti, i metodi esistenti sono stati spinti al limite o nuove tecniche sono state sviluppate per la sequenziazione di partenza sempre più piccole quantità di RNA. Ciò richiede amplificazione del cDNA, che introduce rumore o pregiudizi. Recentemente, identificatori univoci molecolari (UNMIS) sono stati sviluppati per sperimentalmente identificare duplicati introdotti dalla PCR. Recentemente, è stato indicato che l'UNMIS solo leggermente migliorare potenza sequenziamento e tasso di falsi scoperta per di espressione genica differenziale32. Tuttavia, considerare l'utilizzo di identificatori univoci molecolari (UNMIS) per tutte le librerie di sequenziamento al controllo per complessità di biblioteca, soprattutto quando si inizia con basse quantità di RNA e quando sono necessari molti cicli di PCR.
Buffer e soluzioni di riserva: Tutti i buffer per 4sU-seq e profilatura ribosoma devono essere preparati a condizioni rigorose di RNAsi-libera utilizzando acqua priva di nucleasi. È consigliabile acquistare pre-fatte senza nucleasi NaCl, Tris-HCl, EDTA, citrato di sodio e acqua. Per garantire condizioni di nucleasi-free, una soluzione decontaminante RNasi utilizzabile per pulire pipette o superfici. Tutti i buffer per ChIP-seq devono essere almeno dnasi-libero e può essere conservato a temperatura ambiente. Sempre aggiungere gli inibitori della proteasi e, facoltativamente, inibitori delle fosfatasi bene prima dell'uso e conservare il ghiaccio.
Bioinformatica: Analisi di tutti i dati di sequenziamento (cioè, ChIP-seq, RNA-seq e profilatura ribsosome) comporta il controllo di qualità (ad esempio, utilizzando FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), rimozione di adattatore (ad es., con cutadapt20) seguita da mappatura del genoma di riferimento per le cellule in fase di studio. Per dati di RNA-seq (sia totale e 4sU-seq), come pure ribosoma profiling dei dati, un impiombato mapper di RNA-seq è richiesto, come ContextMap 221. Per gli allineamenti di dati unspliced ChIP-seq, è sufficiente utilizzare BWA-MEM22 . Espressione genica può essere calcolato utilizzando il modello (letture per Kilobase dell'essone per milione frammenti mappato) RPKM1, dopo la determinazione leggere conteggi per gene usando un programma, ad esempio featureCounts23. Per la chiamata di picco da ChIP-seq dati, una serie di programmi è disponibile, ad esempio, Mac24 o GEM25. Ulteriori analisi a valle possono essere eseguite in R26, in particolare utilizzando gli strumenti forniti dal progetto Bioconductor27.
Qui, una sfida importante nell'integrazione dei livelli di RNA 4sU - e totale e attività traduzionale dal ribosoma profilatura è normalizzazione. Un classico approccio per affrontare questo problema è quello di normalizzare a livelli di geni. Per ridurre il rumore dovuto le fluttuazioni casuali per singoli geni, si raccomanda di utilizzare non solo poche geni ma livelli mediani per un insieme più ampio, ad esempio il > 3.000 geni compilati da Eisenberg e Levanon28 . Per il calcolo dei tassi di fatturato di RNA da rapporti di 4sU-al che RNA totale, normalizzazione è basata sul fatturato mediano di prezzo (ad es., supponendo un'emivita RNA 5 h)29. Tuttavia, poiché questo non si assume nessun cambiamenti complessivi per geni, si consiglia di utilizzare approcci di analisi indipendente di normalizzazione, ad esempio, di una serie temporale dei tipi di dati diversi per identificare gruppi di geni di clustering basato su correlazione con comportamento distinto nella trascrizione e nella traduzione durante l'attivazione. Per una descrizione dettagliata sull'integrazione di bioinformatical dei tipi di dati diversi, ci riferiamo al originale pubblicazione11.
Analisi di integrazione di dati e tariffe di fatturato: Un libro recentemente pubblicato33 confrontando emivite determinate da un controllo di gene multiplex (MGC) ai metodi globali potrebbe mostrare che emivite correlato meglio con quelli ottenuti mediante metodi di etichettatura metaboliche rispetto ad altri metodi (ad esempio, generale inibizione della trascrizione di farmaci). Tuttavia, va ricordato che le differenze tra calcoli di Half-Life possono sorgere e sono stati descritti 15,34. Ci conto per la maggior parte dei problemi e le differenze introdotte dalla risposta allo stress dovuto all'esposizione prolungata 4sU. Pertanto, è indispensabile escludere la risposta allo stress introdotta da 4sU-etichettatura. Per convalidare ulteriormente i tassi di fatturato, si consiglia l'uso di MGCs.
Inoltre, un set di dati come generato qui potrebbe essere utilizzato anche per un più integrante dati analisi (ad es., regolamento di RNA lunghi non codificanti)35,36.

Negli ultimi anni, la sequenza di RNA (RNA-seq) è diventato lo strumento standard per analizzare tutto espresso RNA all'interno di una cella o a un organismo1. Tuttavia, per comprendere l'intero processo di adattamento in risposta ad una stimolo/droga specifica di cellule, è necessario determinare completamente tutti i processi sottostanti, che vanno dalla trascrizione del mRNA per l'elaborazione, fatturato e traduzione. Cambiamenti a breve termine nella trascrizione del RNA difficilmente possono essere misurate con RNAseq totale, poiché le modifiche di RNA totale dipendono da fattori ad esempio RNA mezza-vita e attività trascrizionale, che sono un povero modello per riflettere l'adattamento delle cellule a effetti ambientali2,3. Infatti, una varietà di nuove tecniche di sequenziamento sono stati sviluppati che permettono un'analisi delle diverse fasi nel processo di gene regolamento4 quando combinati nel modo giusto. Questo protocollo viene descritto come combinare alcune tecniche di sequenziamento piuttosto facilmente applicabile che permettono la regolazione dei livelli essenziali del mRNA di rilevamento in modo comparativo. Per analizzare l'attività trascrizionale, sono state descritte una varietà di metodi, quali Cap-analisi di gene expression (gabbia)5, nativo di allungamento trascrizione sequenziamento (NET-seq)6e genoma nucleare eseguire-sulle (GRO-seq)7 , 8, così come bromouridine-sequenziamento (Bru-seq) e 4-thiouridine-sequenziamento (4sU-seq), che utilizzano metaboliti che sono incorporati in appena trascritto RNA9,10, solo per citarne alcuni. Mentre CAGE identifica il sito di inizio della trascrizione esatta, NET-seq e GRO-seq fornire informazioni più accurate indicazioni di lettura e 4sU-seq (che è il metodo qui descritto) rileva solo recentemente trascritto RNA. Tuttavia, 4sU-seq è altamente sensibile e può essere applicato in tempi diversi per misurare l'attività trascrizionale quantitativa in attivamente cambiando le cellule, così come cambiamenti quantitativi nella trasformazione di mRNA (che avviene all'interno di minuti)9, 11,12. È inoltre ideale per combinare con RNA-seq per calcolare i tassi di fatturato di RNA per geni94sU-seq. La trascrizione di mRNA viene effettuata dalla RNA polimerasi II (RNAPII), che a sua volta è influenzata da una moltitudine di fattori, come fattori di trascrizione, modificazioni istoniche e attivatori/repressori generale che può anche essere parte del trascrizionale complesso. Per verificare quanti gene/promoter/enhancer regioni sono vincolate da un fattore, ChIP-seq è stato sviluppato, che ora è il metodo standard per questo scopo, a causa di molti anticorpi commerciali13. Tuttavia, anche se ChIPseq fornisce informazioni chiare su dove che regolano fattori bind, non riflette se infatti porta a cambiamenti nella trascrizione14. Di conseguenza, l'esecuzione di ChIP-seq con 4sU-seq è la combinazione ideale per tali domande biologiche. Regolazione dell'espressione genica può verificarsi anche in una fase successiva, dal momento che i livelli di mRNA e proteina necessariamente non correlano15,16, che indica il regolamento potenzialmente significativo sul traslazionale o post-traduzionale livello, a seconda del contesto. Durante l'anno 2011, ribosoma profiling erano Stati Uniti in primo luogo con RNA-seq e ora è il metodo di scelta di quantificare i cambiamenti che si verificano rapidamente in proteina, dato che ci sono ancora alcuni limiti di sensibilità con spettrometria di massa17. Infatti, i tassi di conversione ottenuti da tali metodi sono stati indicati per consegnare una relativamente buona stima dei cambiamenti nei livelli della proteina (misurati almeno per cambiamenti a lungo termine) e consente una visuale ancora più dettagliata sul processo di traduzione, ad esempio il determinazione della traduzione alternativa e inizio lato cornici17. L'uso di combinatoria di tutti e quattro i metodi possono essere utilizzati in regime stazionario, tra vari tipi di cellule, o in un tempo-seriale esperimento di un rapido cambiamento di cella11. Questo uso fornisce una panoramica di tutto il genoma dei cambiamenti nell'associazione di fattore di trascrizione che influenzano la trascrizione RNA, elaborazione e traduzione.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;4sU-labeling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &amp;ndash;20&amp;deg;C in aliquots of 50-500 &amp;micro;l; do not refreeze.</td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Optional</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>WARNING &amp;ndash; HAZARDOUS TO HEALTH</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; always prepare fresh</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&amp;deg;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Use in step 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polypropylene 15&amp;nbsp;ml centrifuge tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &amp;times; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &amp;ndash; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Optional; includes Buffer RLT</td></tr><tr><td>Sodium citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Store at 4&amp;deg;C, includes &amp;micro;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell viability and stress assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>Optional</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Optional</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Washing Buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td><td>store at 4 &amp;deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA precipitation buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Optional</td></tr><tr><td>UV/VIS spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptors for 15 ml tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>One stand holds 8 &amp;micro;Macs columns.</td></tr><tr><td>Ultra-fine scale</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Optional</td></tr><tr><td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome Profiling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (Yeast)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (Mammalian)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-25 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 or MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(High Sensitivity DNA Kit)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Already needed for 4sU-seq</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;All other consumables and equipment are listed in the User guide&lt;/strong&gt;</td><td>!!!</td><td></td><td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ChIP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Add to a final concentration of 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Always prepare fresh</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ChIP library preparation kit</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Or use the kit of your choice</td></tr><tr><td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Prepare a 2M stock solution</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td></tr><tr><td>Rnase, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (ChIP grade if possible)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>or antibody of interest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&amp;nbsp;mM EDTA; 16.7&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td>Store at RT up to 6 months</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>Nuclei-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td></tr><tr><td>Wash buffer I</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer II</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&amp;nbsp;mM EDTA; 20&amp;nbsp;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.25&amp;nbsp;M LiCl; 1% NP-40; 1&amp;nbsp;mM EDTA; 10&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>use this instrument for electrophoretical analysis</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>or tubes special for your sonication device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td><td></td><td></td><td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &amp;micro;l each tube)</td></tr><tr><td>Magnetic stand for tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td></tr></tbody></table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

Al momento dell'attivazione, le cellule rapidamente cambiano loro programmi funzionali e, quindi, loro profilo di espressione genica. Enormi cambiamenti nell'espressione genica si verificano, ad esempio, durante la differenziazione cellulare, la morfogenesi e stimolazione funzionale (quali l'attivazione di cellule immunitarie), o dopo l'esposizione a farmaci e altri fattori dell'ambiente locale. A seconda del tipo di stimolo e cellula, questi cambiamenti si verificano rapidamente e a qualsiasi livello possibile di regolazione genica. Visualizzazione di tutti i processi molecolari di una cella risponda ad un certo tipo di stimolo/droga è uno dei compiti più difficili nella biologia molecolare. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'analisi simultanea di più livelli di regolazione genica. Mettiamo a confronto, in particolare, obbligatoria (cromatina-immunoprecipitazione-sequenziamento (ChIP-seq)) di fattore di trascrizione, trascrizione de novo (4-thiouridine-sequenziamento (4sU-seq)), elaborazione di mRNA e fatturato, nonché traduzione (ribosoma profilatura). Combinando questi metodi, è possibile visualizzare un dettagliata e genoma corso d'azione.
Sequenziamento di RNA recentemente trascritto è particolarmente indicato quando si analizza rapidamente adattare o cambiando sistemi, poiché questo rappresenta l'attività trascrizionale di geni tutti durante il tempo di esposizione 4sU (indipendentemente dal fatto che siano - up o downregulated). L'uso di combinatoria di totale RNA-seq e profilatura ribosoma permette inoltre il calcolo dei tassi di turnover e la traduzione di RNA. Analisi bioinformatica di risultati di sequenziamento ad alte prestazioni permette molti mezzi per l'analisi e interpretazione dei dati. I dati generati consentono inoltre il monitoraggio co-transcriptional e alternative splicing, solo per citare alcuni possibili esiti.
L'approccio combinato qui descritto può essere applicato per organismi di modello diverso o di tipi di cellule, compreso le cellule primarie. Inoltre, forniamo protocolli dettagliati per ogni metodo utilizzato, inclusi i controlli di qualità e discutere i potenziali problemi e insidie.

4 sU etichettatura: verificare ottimale 4 condizioni di etichettatura sU (apoptosi, nucleare stress, lo stress citoplasmatico), tempo e concentrazione: Alti livelli di 4sU possono inibire la produzione e lavorazione di rRNA e indurre stress citoplasmico, nonché nucleare30. Pertanto, le cellule di interesse devono essere testate per lo stress indotto da 4sU così come apoptosi. L'analisi Western blot è consigliato per la visualizzazione di accumulazione di p53, che indica lo sforzo nucleare, aumentando i livelli di phospho-EIF2a che visualizzano stress citoplasmici e fluorescenza-attivato delle cellule ordinamento analisi (FACS) per apoptosi. Alti livelli e l'esposizione prolungata a 4sU o droghe come thapsigargin o arsenito può essere utilizzati per indurre lo stress cellulare. Per indurre apoptosi o delle cellule morte, le cellule sono state trattate con BH3I-1 (500 ng / µ l) o incubate per 5 min a 95 ° C (shock termico). Annessina V/7-AAD macchiatura è stato utilizzato per determinare apoptotica (Annessina V) e cellule morte (7-AAD). Etichettatura di in vitro generato cellule Th1 primarie per 0,5 h con 500 µM 4sU (concentrazione finale) o 1 h con 200 µM 4sU induce né segni di stress cellulare né apoptosi (Figura 1) ma portano a sufficiente 4sU incorporazione.
RNA etichettatura tempo può anche essere ridotto (≤ 5 min) che conduce ad un aumento di breve durata intronic sequenze d'etichettatura rispetto al più volte. Per visualizzare co-transcriptional tariffe d'impionbatura, etichettatura 4sU volte non devono superare 30 min. Per maggiori dettagli riguardo 4sUlabeling, fare riferimento a Rädle et al. 19
Controllo di qualità: Integrità di RNA è di grande importanza durante l'elaborazione del RNA. È più conveniente controllare la qualità di RNA di RNA con etichetta 4sU dopo biotinylation dall'analisi elettroforetici (Vedi Tabella materiali). Considera verifica RNA isolato dal punto 2.2.2, soprattutto quando lo si utilizza per la sequenza di RNA totale. Numero di RNA integrità (RIN) deve essere ≥ 8 per garantire l'integrità di RNA per un'ulteriore elaborazione (Figura 3).
Analisi elettroforetici possono anche essere utilizzato per verificare appena trascritti di RNA. Essere consapevoli del fatto che recentemente trascritto RNA contiene i rRNAs significativamente meno maturi rispetto a RNA totale con le tipiche bande di rRNA essendo molto meno prominente.
Ribosoma profilatura: amplificazione di PCR di cDNA library: amplificazione del cDNA (passo 4.9.1) è un passo fondamentale per garantire risultati di sequenziamento buona. Analizzare le librerie amplificate dall'analisi elettroforetici. Un buon campione di librerie amplificate Mostra un picco intorno a 140-160 bp (Figura 4A). Una quantità eccessiva di adattatore dimeri dovrebbero essere evitato (Figura 4B) e quei campioni dovrebbero essere ulteriormente purificati utilizzando la procedura di purificazione pagina secondo il protocollo del produttore (purificazione pagina dei prodotti di PCR). Troppo modello o troppi cicli di PCR possono causare eccessiva amplificazione caratterizzata dalla comparsa di bande di peso molecolare più elevato del previsto, i prodotti di PCR spalmati e adattatore dimero prodotti (Figura 4). Per la maggior parte dei campioni 1-5 µ l di cDNA circolare e 9 cicli PCR per l'amplificazione in genere produrrà una quantità sufficiente di prodotto della PCR corretta.
ChIP: cromatina tosatura: Condizioni ottimali di taglio devono essere regolato per ogni tipo di cellula. Determinare in anticipo le condizioni di taglio (ad es., numero di cicli, alta o bassa potenza). Utilizzare lo stesso numero di cellule e lo stesso volume per scopi di test, dal momento che una minore densità di cella aumenta l'efficienza di taglio. Cercate di evitare di sopra - o sotto-tosatura della cromatina. Frammenti di cromatina grande drammaticamente possono influire sui risultati di ChIP di intasamento, e sovra-tosatura può distruggere gli epitopi sulla proteina di interesse, che conduce ad una minore efficienza di associazione dall'anticorpo. In questo esperimento, i migliori risultati sono stati raggiunti quando la frazione principale della cromatina tosata era circa 1.000 bp o leggermente inferiore (Figura 5A).
Verifica ChIP di qPCR: Prima di iniziare il ChIP, si consiglia di verificare se l'anticorpo utilizzato è adatto per ChIP (se possibile, utilizzare gli anticorpi di grado di ChIP) di ChIP-qPCR. Verificare il ChIP per il sequenziamento di qPCR prima di iniziare la preparazione di biblioteca (vedi passo 5.6.5). Disegnare primers che si legano a un sito di destinazione noto della proteina di interesse. Se il luogo di destinazione esatta all'interno di un gene è sconosciuto, diverse coppie di primer consente di eseguire la scansione del gene e associati elementi regolatori. Per RNAPII ChIP di Th1 cellule Ifng, che è transcriptionally upregulated stimolazione e actina primer può essere utilizzato come controllo positivo. SOX9 e insulina servono come controllo negativo, dato che questi geni non sono espressi in cellule Th1 (figura 5B). Ricordate di non usare iniettori essone-spanning, che sono normalmente utilizzati per qPCR di mRNA. Un controllo di IgG è utilizzabile anche per dimostrare la specificità dell'anticorpo utilizzato. DNA immunoprecipitato può essere misurata con un fluorometro adatto (Vedi Tabella materiali). Quantità di DNA non specifico associato dal controllo IgG dovrebbe essere significativamente più basso rispetto alla quantità di DNA associato dall'anticorpo di interesse.
Replica: prova del significato biologico: Si consiglia vivamente di eseguire l'esperimento di cinetica per tutti i metodi a partire dallo stesso pool di cellule affinché le cellule hanno la stessa identità per tutti i campioni non trattati e trattati (Figura 2). Tuttavia, si consiglia di prendere piccole aliquote di intervalli di tempo principale per ogni metodo confrontare i campioni da un replicare biologico (ad es., di qPCR, analisi al FACS). Questo permette una stima approssimativa se il trattamento per entrambi repliche era riproducibile e si potrebbe procedere con sequenziamento. Convalida dei replicati deve essere eseguita mediante analisi bioinformatical. Riproducibilità dei risultati possono essere valutati in termini di correlazione tra valori FPKM tra repliche e visualizzati utilizzando grafici a dispersione (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Figura 1: Verifica delle condizioni ottimali d'etichettatura 4sU senza perturbare la fisiologia cellulare (figura da Dini et al. 11) (A) rilevazione di apoptosi mediante analisi Citofluorimetrica: In vitro generato Th0 cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di 4sU (indicati tra parentesi) per 0,5 h, h 1 e h 2, rispettivamente. Trattamento BH3I-1 è stato usato per indurre apoptosi determinata da Annexin V, mentre shock termico (5 min a 95 ° C) è stata usata per indurre la morte cellulare determinata dal 7-AAD. (B) analisi di Western blot per p53 di 4sU trattati e cellule T attivate: i campioni sono stati etichettati con 200 µM 4sU per il tempo indicato di attivazione, ad eccezione del punto di tempo di 0,5 h che è stato etichettato con 500 µM 4sU. (C) l'analisi Western blot di fosfo-EIF2a ed EIF2a totale nelle cellule Th1 attivate con le stesse condizioni di etichettatura come in (B). Thapsigargin è stato utilizzato come controllo positivo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Figura 2: Panoramica schematica di un'installazione cinetica per tenere traccia delle modifiche del genoma Questo schema illustra il programma di installazione di combinando 4sU-seq, totale RNA-seq, ribosoma Profiling e ChIP-seq per studiare i cambiamenti di genoma sopra il trattamento delle cellule. Pool di cellule e mettere da parte il numero di cellule per controllo non trattato. Curare le cellule rimanenti e dividere per ciascun punto di metodo e di tempo. Marcare le cellule non trattate/trattati per 4sU-seq con 4sU come descritto. Punti temporali e campioni per ogni metodo dipendono la questione biologica specifica all'esame. Prelevare campioni per ogni punto nel tempo e metodo e seguire la parte dedicata del protocollo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Figura 3: controllo di qualità di RNA 4sU-etichetta RNA totale e biotinilati RNA ottenuto dalle cellule Th1 attivate sono stati analizzati su un Bioanalyzer. RRNA 18S e 28S rRNA sono mostrati e RNA integrità numero (RIN) è dato dallo strumento per determinare l'integrità del RNA. RIN dovrebbe essere ≥ 8 per garantire l'integrità del RNA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Figura 4: Bioanalyzer profili del ribosoma profilatura librerie (A), A buona biblioteca: l'esempio mostra un picco nell'intervallo di dimensioni previste (140-160 bp) e nessun ulteriore purificazione è necessaria. (B), in questo esempio viene illustrato eccessivo adattatore dimero prodotto amplificato (120 bp) rispetto il prodotto desiderato (140-160 bp). Questa libreria richiede ulteriore purificazione. (C), un campione di over-amplificato: picchi di peso molecolare più elevato del previsto e spalmato ampliconi PCR sono visibili (indicati dalle frecce). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Figura 5: Dimensioni di cromatina ottimale dopo la verifica del ChIP di qPCR e tosatura (A) dell'agarosi gel foto mostra la dimensione del frammento ottimale della cromatina tranciata da tre campioni che erano tranciati per 25 cicli su un sonicatore e purificata come descritto prima nel protocollo. (B) risultati di Q-PCR di un ChIP RNAPII totale (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) è rappresentato come una percentuale di input. Primer IFNg e actina sono stati utilizzati come un positivo mentre Sox9 e l'insulina sono controlli negativi (entrambi i geni non sono espressi in cellule Th1 attivate). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Figura 6: Confronto del biologico replica (figura da Dini et al. 11) Rappresentante a dispersione confrontando i valori dell'espressione (FPKM) tra replica di appena trascritto (4sU) RNA 4 h dopo la stimolazione delle cellule Th1 attivate. La linea verde indica valori uguali FPKM e correlazione rigogliosa è indicato in ogni trama.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Durata di etichettatura (min)</td>
			<td>Concentrazione consigliata 4sU (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Consigliato 4sU concentrazioni (da Rädle, et al. 19) L'intervallo di concentrazioni consigliate 4sU è indicato per diverse volte di etichettatura.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Metodo.</td>
			<td>Numero di cellulare</td>
			<td>Quantità di RNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU-etichettatura</td>
			<td>≥ 2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Profilatura del ribosoma</td>
			<td>≥ 2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥ 2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Quantità richiesta primarie delle cellule di T Quantità minima di cellule T primarie richieste per ciascun metodo. Gli importi possono essere meno quando si utilizzano altri tipi di cella.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

13.5K Views.  Helmholtz Zentrum München. Questo protocollo descrive l'uso combinatoria di ChIP-seq, 4sU-seq, totale RNA-seq e profilatura per linee cellulari e cellule primarie del ribosoma. Esso consente di tenere traccia delle modifiche in fattore di trascrizione binding, trascrizione de novo , elaborazione di RNA, fatturato e traduzione nel corso del tempo e la visualizzazione il corso generale degli eventi in cellule attivate e/o cambiare rapidamente.

Video: Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Cromatina Immunoprecipitazioni Analisi Utilizzando Nucleasi Micrococal nelle cellule di Mammaliana

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Ricerca

Genetica

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Tempo reale Imaging in diretta di cellule T Signaling formazione del complesso

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Immunologia e infezioni

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Mappatura delle relazioni struttura-funzione dei fattori di trascrizione oncogenica disordinati utilizzando l'analisi trascrittomica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Ricerca sul cancro

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Biologia dello sviluppo

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell&#39;espressione genica attivata nelle cellule umane

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Singola molecola di imaging del regolamento Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzo di attivazione Cotranslational da Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imaging a cellule vive dell'attività trascrizionale a rotture a doppio filamento di DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

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