אנו מודים לארס Dölken לייעוץ להקים 4sU תיוג עבור תאי T הראשי; אליזבת גראף, תומאס Schwarzmayr לעזרה קריטי ב ספריית דורות ורצף; דירק Eick, אנדרו פלטלי על מתן נוגדנים RNAPII ו תא T; (ש ע) הנרייטה Uhlenhaut, פרנציסקה Greulich לעזרה כהכנה ספריית שבב-seq; קרוליין ג פרידל נתמכה על ידי מענקים FR2938/7-1 ו- CRC 1123 (Z2) מ דויטשה פתוח (DFG); אלקה Glasmacher נתמכה על ידי המענק GL 870/1-1 פתוח דויטשה (DFG) וממרכז גרמנית עבור סוכרת מחקר (DZD), מינכן זנטרום הלמהולץ.

<ol><li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li>
<li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li>
<li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126(2015).</li>
<li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing%3A+advances%2C+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li>
<li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
<li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+extensive%2C+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li>
<li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li>
<li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li>
<li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription%2C+Splicing%2C+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li>
<li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302(2013).</li>
<li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+reveals+the+what%2C+when%2C+where+and+how+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis%2C+processing+and+decay+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ContextMap+2%3A+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122(2015).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638(2012).</li>
<li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTeam%2C+RDC+%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , the R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).</li>
<li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li>
<li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+housekeeping+genes%2C+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li>
<li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA%3A+implications+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li>
<li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li>
<li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li>
<li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533(2016).</li>
<li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006(2017).</li>
<li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li>
<li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li>
<li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ניתוח התהליך כולו של הכונה יש צורך להבין עיבודים הסלולר בתגובה גירוי ספציפי או טיפול. שילוב של RNA הכולל-seq, 4sU-seq ריבוזום פרופיל, צ'יפ-seq בנקודות זמן שונות מוביל ניתוח מקיף של התהליכים העיקריים של הכונה לאורך זמן. הבנה עמוקה של תהליכים ביולוגיים נדרש להגדיר את הגדרת הניסוי, כמו גם נקודות זמן אופטימלי.
מאז שיטות ללמוד הכונה לשפר במהירות, פרוטוקולים אלה ניתן להתאים לשינויים מהירים. למרות זאת, הם מספקים את השיטות הכי חשוב ללמוד ג'ין בסיסי מנגנוני רגולציה בכל סוג של תא. כאן, אנו נדון כמה מלכודות ו עובדות צריך לשקול בעת שימוש בשיטות אלה.
תאים: התאים חייבים להיות מאוד מעשית, אם משתמש ראשי תאים מבודדים, הטוהר של אוכלוסיות תאים יש להבטיח (למשל, FACS ןועברל העיקרי T תאים). התאים ואפילו מעט לחוץ יכול להשפיע על התוצאות של שיטות אלה רצף רגיש מאוד להפחית את כמות לאחרונה משועתקים או מתורגמת RNA ו להוביל המפרט לא רצויים של תגובת המתח בתוצאות רצף. מהירות צנטריפוגה המוזכרים בפרוטוקול זה כדי הצניפה תאים ממוטב העיקרי בתאי T. לפיכך, להתאים את המהירות בהתאם לסוג התא.
4 סו השפעות על פיזיולוגיה של התא: בנוסף האפשרויות הנ עבור אימות של ההפרעות מינימלי כדי פיסיולוגיה תאית על תוספת 4sU, ניתוח נוסף ו/או נוספים ניתן לבצע, במיוחד כאשר מספרי הטלפון הנייד מוגבלים. השפעות על התפשטות תאים יכולים להיבדק על-ידי אימות זמן הכפלה של תאים על-ידי רק לספור תאים עם תוויות ללא תווית. אינדוקציה nucleolar מתח יכול להיבדק גם על ידי ניתוח תא מורפולוגיה ויה immunofluorescence מכתים של nucleolin ואת הגרעינים. כדי להמשיך ולאמת את ההשפעה של 4sU, ביטוי גנים הכללית שינו ניתן למדוד על-ידי התאמת לקרוא ספירות שכותרתו RNA הכולל ל RNA הכולל ללא תווית.
תא מספרים: עבור במבחנה שנוצר בתאי T, אנו ממליצים החל לפחות את כמות התאים המצוין בטבלה 2. לבחור נאותה מספרים לפי שיטת בהתאם לסוג של תאים. מאז תאי T יש פחות הציטופלסמה ו- RNA לעומת תאים אחרים, ככל הנראה כמויות נמוכות של תאים אחרים יהיה הולם. עבור שבב-seq, מספרי הטלפון הנייד תלויים מאד הנוגדן בשימוש ואת רמת ביטוי של החלבון עניין בתוך התאים. היסטון או שבב RNAPII, תאים fewe יכול לשמש, ואילו מספרי הטלפון הנייד צריך להיות מוגברת כאשר משתמשים גורמי שעתוק, במיוחד אם הם באים לידי ביטוי ברמות נמוכות.
4 סו-תיוג ו RNA biotinylation: בעת שימוש תאים חסיד, תיוג 4sU ויכולה להיות מכוונת כפי שתואר על ידי Rädle et al. 19 מאז תאים 4sU לשלב במהירות רבה, זה ניתן להוסיף ישירות אל המדיום של השעיה, מחסידי או תאים חסיד למחצה.
מומלץ להתחיל את biotinylation עם 60-80 µg של RNA. ובכל זאת, כמויות נמוכות של RNA יכול לשמש, למרות שאנחנו לא האם בדק עבור פחות מ-30 µg. מוסיפים את coprecipitant של (למשל, GlycoBlue) כאשר מאיצים RNA אם בגדר קשה לראות. דאפי. et al. הראו גם את ביוטין מופעל methylthiosulfonate (MTS-ביוטין) בצורה יעילה יותר מגיב עם התווית על-ידי 4sU RNA מאשר HPDP-ביוטין31. לפיכך, ייתכן שווה לשקול מעבר MTS-ביוטין, במיוחד, עבור ההתאוששות של RNAs קטן, אשר נוטים להיות פחות משקעים uridine (עיין פרוטוקול biotinylation שהוזכרו על ידי דאפי ואח; ראה טיהור של התווית על-ידי 4sU RNA, נהלים ניסויית).
עבור ההתאוששות של RNA לאחרונה משועתקים, זה אפשרי להשתמש פאראמגנטיים חרוזים או RNA ניקוי חרוזים על פי בחירתך. תמיד לקחת בחשבון ערכות אלה עשויה או לא עשויה לטהר עבור RNAs ספציפיים. לדוגמה, אם אתה מעוניין miRNAs, שקול להשתמש ערכות ספציפי עבור לכידת miRNA ורצף.
כימות של RNA משועתקים החדש: לכמת במדויק RNA לאחרונה משועתקים, מדידה צריכה להתבצע על ידי fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים). בתוך h 1 של חשיפה 4sU, שזה עתה משועתקים RNA מייצג כ- 1-4% של RNA הכולל. RNA משועתקים החדש של h 1 שכותרתו, תאי T מופעל מורכב ~ 90-94% של rRNA11.
ריבוזום פרופיל: בעת יצירת השיטה, קבענו כי באמצעות 1.5 x כמות נוקלאז מאשר הציע בפרוטוקול המקורי מבטיח ולעיכול תקין. כמו כן, ללא תופעות לוואי שדווחו עבור כמויות מוגברות של נוקלאז. מאז. זה די קשה כדי overdigest את RPFs בזמן שהם חלק הרנ א מחוייב ribosomal חלבונים, באפשרותך להגדיל עדיין מעט את הסכום titrate עיכול נוקלאז אופטימלית.
אם פחות מ-500 ng של RPF RNA התגלו ב שלב 4.4.2, חזור על דלדול rRNA ובריכת מטוהר RPFs עם עמודות ה-RNA נקיים & רכז-5. לחילופין, טען שני מדגמים זהים אחד לשני על הג'ל (שלב 4.5.3), פרוסות ג'ל בריכת במהלך RNA • תנאי של הג'ל (שלב 4.5.6).
מומלץ לחתוך את RPFs על ג'ל חזק ככל האפשר לחברי הלהקות nt 28, 30. פעולה זו מסייעת בהפחתת שברי לא רצויים rRNAs ו tRNAs, אשר מאוחר יותר להיות חלק מהספריה, להפחית את רצף קריאות עבור RPFs שלך.
מומלץ גם להימנע אור במהלך ג'ל טיהור UV. דבר זה יכול ליצור ניקס מקטעי רנ א, כמו גם הדימרים פירימידין, כי בסופו של דבר יכול להשפיע באופן חמור את ספריית והכנה רצף תוצאות.
ספריית הכנה ורצף של נתונים: ריבוזום פרופיל הפרוטוקול מאפשר ליצור ספריית cDNA מתאים רצף. דגימות שנוצרו על-ידי תיוג 4sU ניתן להשתמש ישירות להכנה ספריה עם כל ערכת רצפי RNA המתאים. מאז RNA לאחרונה משועתקים, במיוחד בעת שימוש קצר תיוג פעמים, עשויים שלא להיות polyadenylated, אין בחירה poly-A יש לבצעו. במקום זאת, אנו ממליצים rRNA דלדול למניעת הפחתת עומק רצף עבור המדגם בפועל. שימוש בתאי T, התחיל עם 400 ננוגרם של RNA לאחרונה משועתקים, סה כ (בהתאם הערכה, ראה חומרים), שבוצעה rRNA דלדול ואנו מופחתת מחזורי עבור הגברה PCR למזער את הטיית ה-PCR. הכנת ספריה יכולה להתבצע עם פחות חומר המוצא. עבור ספריית המורכבות מספר מחזורים PCR צריך להיות מוטבת.
עבור שבב-seq יש גם הרבה ערכות זמינים עבור ספריית הכנה. בספריה הידיים הכנה עבד טוב מתחיל עם 2 ng של ChIP הדנ א (ראה חומרים עבור הצעה לערכה לשימוש). הקפד לבדוק את מדדים איזון צבע במהלך רצף. אנו ממליצים לעומק רצף של ≥40 x 10 קריאות6 , כל עבור 4sU-seq, הכולל RNA-seq, ודוגמאות שבב-seq ולאחר ≥80 x 106 קריאות עבור ריבוזום פרופיל הדגימות. העומק רצף תלוי המדגם וניתוח ביואינפורמטיקה במורד הזרם, ויש להתייחס בזהירות. כדי לנתח את קריאות intronic עבור החדרת cotranscriptional, 100 bp לזווג-קצה רצף צריך להיבחר.
רצף הטיה: רצף הפך תקן זהב בקביעת שינויים כלליים תמלול, תרגום או איגוד פקטור שעתוק. בתוך בשנים האחרונות שיטות קיימות דחפו לגבולות שלהם או טכניקות חדשות פותחו עבור קביעת רצף כמויות קטנות יותר ויותר ההתחלתי של RNA. זה דורש הגברה של cDNA, אשר מציג רעש או הטיה. לאחרונה, מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) פותחו השפעול לזהות כפילויות לראשונה על ידי ה-PCR. . לאחרונה, זה הוצגה UMIs רק במתינות לשפר כוח רצף ושיעור גילוי שווא על ביטוי גנים דיפרנציאלית32. למרות זאת, שקול להשתמש מזהים ייחודיים מולקולרית (UMIs) עבור כל ספריות רצף לפקד עבור ספריית המורכבות, במיוחד כאשר החל כמויות נמוכות של RNA וכאשר מחזורים PCR רבים נדרשים.
מאגר ופתרונות מניות: חייבים להיות מוכנים כל מאגרים עבור 4sU-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בתנאים מחמירים נטולת RNase בעזרת נוקלאז ללא מים. מומלץ לקנות מראש ללא נוקלאז NaCl, טריס-HCl, EDTA, ציטראט נתרן ומים. כדי להבטיח נוקלאז ללא תנאים, ניתן פתרון decontaminating RNase לנקות מדי סוכר או משטחים. כל מאגרים עבור שבב-seq צריך להיות לפחות ללא DNase וניתן לאחסן בטמפרטורת החדר. תמיד להוסיף מעכבי פרוטאז, וכן מעכבי פוספטאז לפני השימוש ולשמור על קרח.
ביואינפורמטיקה: ניתוח של כל הנתונים רצף (קרי, צ'יפ-seq, RNA-seq ו ribsosome פרופיל) כולל בקרת איכות (למשל, באמצעות FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), מתאם זמירה (למשלעם cutadapt20) ולאחר מכן על-ידי מיפוי הגנום הפניה לתאים שנבחנה. עבור נתונים RNA-seq (סה כ והן 4sU-seq), כמו גם ריבוזום פרופיל נתונים, ממפה נקודות spliced RNA-seq נדרש, כגון ContextMap 221. עבור שבב-seq במערכים הנתונים unspliced, באמצעות BWA-מ22 מספיקה. ניתן לחשב ביטוי גנים באמצעות מודל (קורא לכל Kilobase של אקסון לכל למפות קטעים מיליון) ' RPKM '1, לאחר קביעת לקרוא ספירות לכל הגן באמצעות של התוכנית, למשל featureCounts23. שהתקשרת שיא מנתונים שבב-seq, מספר תוכניות זמינות, למשל, מקינטוש24 או פנינה25. בהמשך ניתן לבצע ניתוחים במורד הזרם R26, בפרט באמצעות כלים שסופקו על-ידי project Bioconductor27.
כאן אתגר גדול בשילוב רמות ה-RNA 4sU - וסה ' כ ופעילות translational מן הריבוזום פרופיל זה נורמליזציה. בגישה קלאסית כדי לטפל בבעיה זו היא לנרמל את רמות של משק בית גנים. כדי להפחית את הרעש עקב תנודות אקראיות עבור גנים בודדים משק בית, מומלץ לא רק להשתמש כמה גנים משק בית אבל רמות החציוני עבור קבוצה גדולה, למשל > גנים משק בית 3,000 שגיבש אייזנברג, לבנון28 . עבור חישוב של RNA שיעורי מחזור של יחסי של 4sU-ל ש-RNA הכולל, נורמליזציה מבוסס על מחזור החציוני שיעורי (למשל, בהנחה של RNA half-life של 5 שעות)29. עם זאת, שכן ההנחה היא אין שינויים כוללים בהתאם לדרישה עבור גנים משק בית, אנו ממליצים להשתמש גישות ניתוח עצמאי של נורמליזציה, למשל, המתאם מבוסס-קיבוץ באשכולות של הזמן-סדרת סוגי הנתונים השונים כדי לזהות קבוצות של גנים עם התנהגות ברורים תמלול ותרגום במהלך ההפעלה. לקבלת תיאור מפורט על bioinformatical שילוב של סוגי הנתונים השונים, אנו מכנים הפרסום המקורי11.
ניתוח של אינטגרציה המחירים והנתונים מחזור: מאמר שפורסם לאחרונה33 השוואת מחצית החיים נקבע על-ידי פקד מרובבת ג'ין (MGC) שיטות גלובליות יכול להראות כי מחצית החיים בקורלציה הטוב ביותר עם אלו מתקבל על ידי שיטות תיוג מטבולית, לעומת שיטות אחרות (למשל, כללי עיכוב של תעתוק סמים). עם זאת, יש לציין כי ההבדלים בין מחצית חיים חישובים יכול להיווצר, היה מתואר 15,34. אנחנו מהווים רוב בעיות ההבדלים אשר הציג מאת תגובת המתח עקב חשיפה ממושכת 4sU. לכן, זה הכרחי כדי לא לכלול את תגובת המתח שהוצגו על ידי תיוג 4sU. כדי לתת תוקף נוסף מחזור המחירים, אנו ממליצים על השימוש MGCs.
בנוסף, ערכת נתונים כפי שנוצר כאן יכול לשמש גם עבור אינטגרטיבית יותר נתונים ניתוח (למשל, ויסות זמן אי קידוד RNAs)35,36.

בשנים האחרונות, RNA-רצף (RNA-seq) הפכה להיות הכלי סטנדרטי כדי לנתח כל ביטוי RNAs בתוך תא או של האורגניזם1. עם זאת, כדי להבין את כל התהליך של תאים בהתאמת בתגובה לגירוי/תרופה ספציפית, יש צורך לקבוע באופן מלא כל התהליכים שבבסיס, החל mRNA שעתוק עיבוד, תחלופה של תרגום. שינויים לטווח קצר שעתוק RNA בקושי נמדד על ידי הכולל RNAseq, מאז שינויים של RNA הכולל תלויים גורמים למשל RNA מחצית החיים ופעילות תעתיק, אשר הם תבנית המסכן עבור המשקף את העיבוד של תאים השפעות סביבתיות2,3. ואכן, מגוון רחב של טכניקות רצף חדשות פותחו לאפשר ניתוח של שלבים שונים בתהליך ג'ין תקנה4 בשילוב בצורה נכונה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשלב כמה טכניקות רצף די בקלות החלים המאפשרים מעקב אחר ברגולציה של שכבות חיוני של mRNA באופן השוואתי. ניתוח פעילות גנים ברמת השעתוק, מגוון שיטות תוארו, כגון כובע-אנליזה של ג'ין ביטוי (קייג ')5, התארכות יליד התעתיק רצף (NET-seq)6ו ברמת הגנום הגרעיני שלא נגמרות (GRO-seq)7 , 8, bromouridine-רצף (ברו-seq) וכן 4-thiouridine-רצף (4sU-seq), אשר השתמש מטבוליטים זה משולבים החדש עיבד RNA9,10, רק כדי להזכיר כמה. בעוד כלוב מזהה האתר התחלה שעתוק מדויק, נטו-seq, GRO-seq לספק מידע מדויק יותר על קריאת ההוראות ו- 4sU-seq (שהיא השיטה המתוארת כאן) מזהה רק לאחרונה עיבד RNA. עם זאת, 4sU-seq היא רגישה מאוד, יכול להיות מיושם במסגרות זמן שונות כדי למדוד כמותית פעילות גנים ברמת השעתוק שינוי אקטיבי תאים, כמו גם שינויים כמותיים עיבוד mRNA (וזה קורה בתוך דקות)9, 11,12. יתר על כן, 4sU-seq אידיאלי לשלב עם ה-RNA-seq לחישוב RNA מחזור המחירים עבור גנים9. שעתוק של ה-mRNA מתבצעת על ידי RNA פולימראז II (RNAPII), אשר בתורו מושפע על ידי מספר רב של גורמים, כגון גורמי שעתוק, שינויים היסטון, מפעילים/repressors כללי זה יכול גם להיות חלק תעתיק מורכבות. כדי לבדוק כמה גנים/יזם/משפר אזורים מאוגדים על ידי גורם אחד, צ'יפ-seq פותחה, אשר נקרא כיום השיטה הרגילה למטרה זו, עקב נוגדנים זמינים מסחרית רבים13. עם זאת, למרות ChIPseq נותן מידע ברור על איפה ויסות גורמים bind, זה לא משקף אם זה אכן מוביל לשינויים שעתוק14. לכן, ביצוע שבב-seq עם 4sU-seq הוא השילוב האידיאלי לשאלות כאלה ביולוגי. בקרת גנים יכול להתרחש גם בשלב מאוחר יותר, מאז ה-mRNA ורמות החלבון לא בהכרח מתאימות15,16, המציין תקנה משמעותי פוטנציאלי translational או post-translational רמת, בהתאם להקשר. בשנת 2011, ריבוזום פרופיל היו כבר קודם בשילוב עם ה-RNA-seq והוא עכשיו השיטה של בחירה כדי לכמת את השינויים המתרחשים במהירות חלבון, שכן עדיין יש כמה מגבלות רגישות עם ספקטרומטר מסה17. אכן, תעריפי התרגום המתקבל שיטות כאלה הוכחו לספק הערכה טובה יחסית של שינויים ברמות החלבון (נמדד לפחות ליצירת שינוי ארוך טווח) ולאפשר מבט מפורט אפילו יותר על התהליך של תרגום, למשל הנחישות של תרגום בצד התחלה ואלטרנטיבית מסגרות17. השימוש קומבינטורית בכל ארבעת השיטות ניתן להשתמש במצב יציב, בין סוגי תאים שונים, או בסדרתי זמן הניסוי התא המשתנה במהירות11. שימוש זה מספק סקירה ברמת הגנום של שינויים באיגוד פקטור שעתוק המשפיעים על שעתוק RNA, עיבוד, תרגום.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;4sU-labeling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &amp;ndash;20&amp;deg;C in aliquots of 50-500 &amp;micro;l; do not refreeze.</td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Optional</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>WARNING &amp;ndash; HAZARDOUS TO HEALTH</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; always prepare fresh</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&amp;deg;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Use in step 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polypropylene 15&amp;nbsp;ml centrifuge tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &amp;times; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &amp;ndash; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Optional; includes Buffer RLT</td></tr><tr><td>Sodium citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Store at 4&amp;deg;C, includes &amp;micro;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell viability and stress assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>Optional</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Optional</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Washing Buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td><td>store at 4 &amp;deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA precipitation buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Optional</td></tr><tr><td>UV/VIS spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptors for 15 ml tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>One stand holds 8 &amp;micro;Macs columns.</td></tr><tr><td>Ultra-fine scale</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Optional</td></tr><tr><td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome Profiling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (Yeast)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (Mammalian)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-25 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 or MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(High Sensitivity DNA Kit)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Already needed for 4sU-seq</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;All other consumables and equipment are listed in the User guide&lt;/strong&gt;</td><td>!!!</td><td></td><td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ChIP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Add to a final concentration of 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Always prepare fresh</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ChIP library preparation kit</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Or use the kit of your choice</td></tr><tr><td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Prepare a 2M stock solution</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td></tr><tr><td>Rnase, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (ChIP grade if possible)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>or antibody of interest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&amp;nbsp;mM EDTA; 16.7&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td>Store at RT up to 6 months</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>Nuclei-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td></tr><tr><td>Wash buffer I</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer II</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&amp;nbsp;mM EDTA; 20&amp;nbsp;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.25&amp;nbsp;M LiCl; 1% NP-40; 1&amp;nbsp;mM EDTA; 10&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>use this instrument for electrophoretical analysis</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>or tubes special for your sonication device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td><td></td><td></td><td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &amp;micro;l each tube)</td></tr><tr><td>Magnetic stand for tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td></tr></tbody></table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

בעת ההפעלה, תאים לשנות במהירות את התוכניות הפונקציונלית שלהם, וכך, פרופיל ביטוי גנטי. מסיבית שינויים בביטוי הגנים להתרחש, לדוגמה, במהלך התמיינות מורפוגנזה, גירוי פונקציונלי (כגון הפעלה של תאים חיסוניים), או לאחר חשיפה תרופות וגורמים אחרים מן הסביבה המקומית. בהתאם לסוג הגירוי ותא, שינויים אלו מתרחשים במהירות, בכל רמה אפשרית של הכונה. הצגת כל התהליכים מולקולרית של תא מגיבה לסוג מסוים של גירוי/סמים היא אחת המשימות הקשה ביותר בביולוגיה מולקולרית. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול המאפשר ניתוח בו זמנית של שכבות מרובות של הכונה. אנו משווים, בפרט, גורם שעתוק מחייב (כרומטין-immunoprecipitation-רצף (צ'יפ-seq)), דה נובו שעתוק (4-thiouridine-רצף (4sU-seq)), עיבוד mRNA, ו מחזור, וכן תרגום (ריבוזום יצירת פרופיל). על ידי שילוב שיטות אלה, זה אפשרי להציג קורס מפורט של הגנום כולו של פעולה.
קביעת רצף הרנ א לאחרונה משועתקים מומלצת במיוחד בעת ניתוח במהירות התאמה או שינוי מערכות, מאז זה מתאר את הפעילות תעתיק של כל הגנים בזמן החשיפה 4sU (ללא קשר אם הם למעלה - או downregulated). השימוש קומבינטורית RNA הכולל-seq והגדרת פרופיל ריבוזום בנוסף מאפשר חישוב המחירים מחזור ותרגום RNA. ניתוח Bioinformatic של תפוקה גבוהה רצף תוצאות מאפשר אמצעים רבים עבור ניתוח ופרשנות של הנתונים. הנתונים המופקים גם מאפשר מעקב אחר co-transcriptional ואלטרנטיבית שחבור, רק כדי להזכיר כמה תוצאות אפשריות.
הגישה המשולבת המתוארים כאן יכול להיות מיושם עבור אורגניזמים מודל שונה או סוגי תאים, כולל ראשי תאים. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורט עבור כל שיטת שימוש, כולל פקדים איכות, ולדון בבעיות פוטנציאליות ואת החסרונות.

4 סו תיוג: ודא אופטימלית 4 סו-תיוג תנאים (אפופטוזיס, גרעיני מתח, מתח cytoplasmic), זמן, ריכוז: רמות גבוהות של 4sU ניתן לעכב את ייצור ועיבוד של rRNA, לגרום מתח cytoplasmic וכן גרעיני30. לכן, תאים עניין צריך להיבדק 4sU-induced הלחץ, כמו גם אפופטוזיס. תספיג חלבון ניתוח מומלץ להמחשת הצטברות p53, אשר מציין מתח גרעינית, הגדלת רמות פוספו-EIF2a המציגים cytoplasmic מתח, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח של אפופטוזיס. רמות גבוהות של חשיפה ממושכת 4sU או תרופות כמו thapsigargin או arsenite יכול לשמש כדי לגרום מתח סלולארית. כדי לגרום אפופטוזיס או לתא המוות, תאים שטופלו BH3I-1 (500 ng/µL) או הדגירה למשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס (חום הלם). Annexin V/7-מ מכתים שימש לקביעת מוות (Annexin V) ותאים מתים (7-מ). תיוג של במבחנה שנוצר העיקרי תאי Th1 עבור h 0.5 עם 500 4sU מיקרומטר (ריכוז סופי) או h 1 עם 200 מיקרומטר 4sU גם מעוררת סימני מצוקה סלולרי ולא אפופטוזיס (איור 1) אבל להוביל ההתאגדות 4sU מספיק.
RNA תיוג זמן גם יכול להתקצר (≤5 דקות) אשר מוביל לעלייה קצרת ימים intronic רצף בהשוואה עוד פעמים תיוג. כדי להמחיש co-transcriptional המחירים splicing, תיוג 4sU פעמים לא יעלה על 30 דקות. לקבלת פרטים נוספים על 4sUlabeling, נא עיין Rädle et al. 19
בקרת איכות: שלמות RNA הוא בעל חשיבות רבה בעת עיבוד ה-RNA. זה הכי נוח לבדוק את איכות ה-RNA של RNA התווית על-ידי 4sU לאחר biotinylation ניתוח electrophoretical (ראה טבלה של חומרים). שקול אימות RNA מבודד מהשלב 2.2.2, במיוחד כאשר משתמשים בו על רצף של RNA הכולל. RNA תקינות מספר (RIN) צריך להיות ≥8 כדי להבטיח שלמות RNA לעיבוד נוסף (איור 3).
ניתוח electrophoretical יכול לשמש גם כדי לוודא שזה עתה משועתקים RNA. שימו לב כי לאחרונה משועתקים RNA מכיל rRNAs באופן משמעותי פחות בוגר לעומת סך RNA עם הלהקות rRNA טיפוסי להיות הרבה פחות בולטים.
ריבוזום פרופיל: PCR הגברה של ספריית cDNA: cDNA הגברה (שלב 4.9.1) הוא שלב קריטי כדי להבטיח תוצאות רצף טוב. לנתח את ספריות מוגבר על-ידי ניתוח electrophoretical. דגימה טובה של ספריות מוגבר מראה לשיא סביב 140-160 bp (איור 4A). עודפות של מתאם הדימרים צריך להיות נמנע (איור 4B) ויש את הדגימות נוסף לטהרו באמצעות ההליך טיהור דף לפי הפרוטוקול של היצרן (דף טיהור של מוצרי ה-PCR). תבנית יותר מדי או מחזורים PCR מדי עלולה להביא הגברה יתר מאופיין על ידי הופעת להקות משקל מולקולרי גבוה מהצפוי, מוצרי ה-PCR מרוח ומוצרים דיימר מתאם (איור 4C). עבור רוב דגימות 1-5 µL של circularized cDNA ומחזורי PCR 9 עבור הגברה בדרך כלל תניב כמויות מספיקות של המוצר הנכון של ה-PCR.
שבב: כרומטין הטיה: חיתוך אופטימאליים צריך להיות מותאם לכל סוג של תא. לקבוע תנאים ההטיה (למשל, מספר מחזורי, כוח גבוה או נמוך) מראש. להשתמש באותו המספר של תאים באותו אמצעי אחסון למטרות, בדיקה מאז צפיפות התאים נמוך מגביר את יעילות ההטיה. נסה להימנע נגמר - או תחת-הטיה כרומטין. שברי כרומטין גדול יכול להשפיע באופן דרמטי על תוצאות שבב על ידי סתימת, הטיית יתר יכול להרוס את epitopes על החלבון של עניין, שמוביל ליעילות נמוכה הכריכה על ידי הנוגדן. בניסוי זה, הושגו התוצאות הטובות ביותר כאשר השבר הראשי של כרומטין הוטו היה בסביבות 1,000 bp או מעט נמוך (איור 5A).
אימות שבב על ידי qPCR: לפני שמתחילים את השבב, מומלץ לבדוק אם הנוגדן בשימוש מתאים שבב (במידת האפשר, השתמש שבב כיתה נוגדנים) על ידי שבב-qPCR. לאמת את השבב עבור רצף על ידי qPCR לפני תחילת הכנת ספריה (ראה שלב 5.6.5). עיצוב תחל זה לאגד אתר יעד ידוע של החלבון עניין. אם אתר היעד המדויק בתוך הגן אינו ידוע, כמה זוגות פריימר יכול לשמש כדי לסרוק את ג'ין ואלמנטים רגולטוריות המשויך. עבור שבב RNAPII של Th1 תאים Ifng, אשר transcriptionally upregulated על גירוי, תחל אקטין יכול לשמש פקד חיובי. Sox9 , אינסולין לשמש פקד שלילי, מאחר הגנים האלה אינם מבוטאים בתאים Th1 (איור 5B). תזכרו לא להשתמש פורש אקסון תחל, אשר משמשים בדרך כלל עבור qPCR של mRNA. פקד IgG יכול לשמש גם כדי להוכיח יחודיות של הנוגדן בשימוש. Immunoprecipitated DNA ניתן למדוד עם fluorometer מתאימים (ראה טבלה של חומרים). כמויות של DNA nonspecifically המאוגד על-ידי הפקד IgG צריכה להיות משמעותית נמוכה לעומת הסכום DNA הנוגדן עניין כבול.
משכפל: הוכחה חשיבות ביולוגית: מומלץ בחום לבצע את הניסוי קינטי עבור כל השיטות החל מאותו מאגר של תאים כדי להבטיח תאים יש זהות זהה עבור כל לא מטופל ומטופל דוגמאות (איור 2). עם זאת, מומלץ לקחת aliquots קטן של נקודות זמן הראשי עבור כל שיטת להשוות בין דגימות שכפול ביולוגי (למשל, על ידי qPCR, ניתוח FACS). דבר זה מאפשר הערכה גסה, אם הטיפול עבור שניהם משכפל לשחזור, אתה יכול להמשיך עם רצף. אימות של משכפל צריכה להתבצע על-ידי ניתוח bioinformatical. הפארמצבטית של תוצאות יכול להידרש מבחינת מתאם בין ערכים FPKM בין משכפל, visualized באמצעות פיזור החלקות (איור 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> איור 1: אימות של תנאים אופטימליים תיוג 4sU ללא perturbing פיזיולוגיה של התא (איור מ Davari et al. 11) (א) גילוי של אפופטוזיס תא על-ידי ניתוח FACS: במבחנה שנוצר Th0 תאים שטופלו ריכוזים שונים של 4sU (מסומן בסוגריים) עבור 0.5 h, 1 h 2 h, בהתאמה. טיפול BH3I-1 שימש כדי לגרום אפופטוזיס נקבע על ידי Annexin V, ואילו הלם חום (5 דקות ב 95 ° C) נעשה שימוש כדי לגרום מוות תאי נקבע על ידי 7-מ. (B) תספיג ןועברל p53 של 4sU התייחסו ומופעל תאי T: דגימות הודבקו תוויות עם 200 מיקרומטר 4sU במשך הזמן המצוין של ההפעלה, למעט נקודת זמן 0.5 h זה סומן עם 500 4sU מיקרומטר. (ג) ניתוח תספיג פוספו-EIF2a ו- EIF2a הכולל תאי Th1 מופעל עם תיוג באותם התנאים כמו (B). Thapsigargin שימש פקד חיובי. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> איור 2: סקירה סכמטי של מלכודת קינטי לעקוב אחר שינויים ברמת הגנום ערכה זו ממחישה את הכיוונון לשילוב 4sU-seq הכולל RNA-seq, פרופיל ריבוזום, צ'יפ-seq ללמוד שינויים ברמת הגנום על טיפול תאי. בריכה תאים, להפריש את המספר הנדרש של תאים עבור פקד ללא טיפול. לטפל בתאי שנותרה ולהתחלק עבור כל נקודה בשיטה וזמן. תווית לא מטופל/מטופלים תאים עבור 4sU-seq עם 4sU כמתואר. נקודות זמן ודוגמאות עבור כל שיטת תלויה השאלה ביולוגי מסוים נבדק. לקחת דגימות עבור כל נקודת זמן ושיטת ופעל החלק הייעודי של הפרוטוקול. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> איור 3: בקרת איכות של RNA התווית על-ידי 4sU סה כ RNA ו biotinylated RNA המתקבל ע י תאי Th1 מופעל נותחו על Bioanalyzer. 18S rRNA 28S rRNA מוצגים, RNA תקינות מספר (RIN) ניתנת על ידי המכשיר כדי לקבוע בשלמות הרנ א. רין צריך להיות ≥8 כדי להבטיח שלמות RNA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> איור 4: פרופילים Bioanalyzer של ריבוזום פרופיל ספריות ספריה טובה (א) A: המדגם מציגה לשיא במטווח הגודל הצפוי (140-160 bp) וכן אין טיהור נוספת נדרשת. (B) דוגמה זו מציגה מוצר מוגבר של דיימר מתאם מוגזמת (120 bp) ביחס המוצר הרצוי (140-160 bp). ספריה זו מחייבת עוד יותר טיהור. (ג) דוגמה יתר מוגבר: פסגות משקל מולקולרי גבוה מהצפוי, מרוח PCR amplicons גלויים (המסומנים על ידי חצים). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> איור 5: גודל אופטימלי כרומטין אחרי הטיית ואימות של שבב על ידי qPCR (א) Agarose ג'ל התמונה מראה גודל אופטימלי שבר כרומטין הוטו מדגימות שלושה היו לכסנתם מחזורים 25 ב sonicator, מטוהרים כמתואר לפני בפרוטוקול. (B) Q-PCR תוצאות שבב RNAPII הכולל (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) מיוצג כאחוז של קלט. Ifng ואני אקטין תחל שימשו חיובי ואילו Sox9 , אינסולין שלילי פקדים (שני הגנים אינם מבוטאים בתאים Th1 מופעל). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> איור 6: השוואה של הביולוגיה משכפל (איור מ. Davari et al. 11) פיזור נציג מגרש בהשוואת ערכים הביטוי (FPKM) בין משכפל של h RNA 4 משועתקים לאחרונה (4sU) לאחר גירוי תאי Th1 מופעל. הקו הירוק מציין ערכים FPKM שווים ומצוין המתאם דרגה כל מגרש.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>משך תיוג (דקות)</td>
			<td>ריכוז 4sU המומלצת (מיקרומטר)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מומלץ ריכוזי 4sU (מ- Rädle, et al. 19) הטווח של ריכוזי 4sU המומלץ הוא הצביע עבור זמנים שונים של תיוג.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>שיטה</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד</td>
			<td>כמות ה-RNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>תיוג-4sU</td>
			<td>≥2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ריבוזום פרופיל</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>שבב-seq</td>
			<td>≥2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: הכמות הנדרשת של תאי T ראשי הכמות המינימלית של תאי T העיקרי הנדרש עבור כל אחת מהשיטות. כמויות יכול להיות פחות בעת שימוש סוגי תאים אחרים.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

real-time-analysis-transcription-factor-binding-transcription

Research

JoVE Journal

Genetics

13.5K Views.  Helmholtz Zentrum München. פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה ב?...

Video: Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

כרומטין Immunoprecipitation שימוש בנוקלאוסים מיקרוקוקל בתאי מיונקים

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Immunology and Infection

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Cancer Research

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

בזמן אמת ביולומינסנציה הדמיה של מערכת איתות דינמיקה במהלך מורנין נוירוגנזה

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Developmental Biology

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biology

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

מדידת קינטיקה של שעתוק mRNA בתאים חיים יחיד

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

הדמית מולקולה הבודדה של רגולציה גנטית<em&gt; בחי</em&gt; שימוש הפעלת Cotranslational ידי מחשוף (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

הדמיה של תאים חיים של פעילות תמלול בהפסקות דו-סטרנד DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST