Wir danken Lars Dölken für Beratung, 4sU Kennzeichnung für primäre T-Zellen zu etablieren; Elisabeth Graf und Thomas Schwarzmayr für kritische Hilfe bei Bibliothek Generationen und Sequenzierung; Dirk Eick und Andrew Flatley für die Bereitstellung von RNAPII und T-Zell-Antikörper; N. Henriette Uhlenhaut und Franziska Greulich für Hilfe bei der Vorbereitung der Bibliothek für ChIP-Seq; Caroline C. Friedel wurde durch Zuschüsse FR2938/7-1 und CRC 1123 (Z2) von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt. Elke Glasmacher wurde durch den Zuschuss GL 870/1-1 von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) und dem Deutschen Zentrum für Diabetes Research (DZD), Helmholtz Zentrum München unterstützt.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Analyse des gesamten Prozesses der Genregulation ist notwendig, zelluläre Anpassungen als Reaktion auf einen bestimmten Reiz oder Behandlung voll und ganz verstehen. Total RNA-Seq kombinierend führt 4sU-Seq, Ribosom, Profilierung und ChIP-Seq zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu einer umfassenden Analyse der wichtigsten Prozesse der Genregulation im Laufe der Zeit. Ein tiefes Verständnis der biologischen Prozessen ist erforderlich, um den Versuchsaufbau sowie optimale Zeitpunkte definieren.
Da Methoden zur Genregulation studieren rasch verbessern, können diese Protokolle zu raschen Veränderungen angepasst werden. Dennoch bieten sie die wichtigsten Methoden für grundlegende gen Regulationsmechanismen in jeder Art von Zelle zu studieren. Hier diskutieren wir einige der Fallstricke und Fakten muss man berücksichtigen, wenn Sie diese Methoden verwenden.
Zellen: Zellen müssen höchst lebensfähig sein und wenn primäre isolierte Zellen verwenden, Reinheit des Zell-Populationen gewährleistet sein muss (z. B.FACS Analyse für primäre T-Zellen). Sogar leicht gestresste Zellen können Einfluss auf die Ergebnisse von diesen sehr sensiblen Sequenziermethoden und senken die Menge von neu transkribierten oder übersetzten RNA und führen zu unerwünschten Auslesen der Stress-Reaktion in der Sequenzierung Ergebnisse. Die Zentrifugation Geschwindigkeit erwähnt in diesem Protokoll zu pellet-Zellen ist für primäre T-Zellen optimiert. So passen Sie die Geschwindigkeit je nach Zelltyp.
4 sU-Auswirkungen auf die Zellphysiologie: Zusätzlich zu den oben genannten Optionen für minimale Störung für Zellphysiologie auf 4sU Zugabe überprüfen kann weitere bzw. zusätzliche Analyse durchgeführt werden, vor allem wenn Zellzahlen begrenzt sind. Auswirkungen auf die Zellproliferation können durch die Überprüfung der Verdopplungszeit der Zellen durch einfach zählen beschriftete und unbeschriftete Zellen getestet werden. Nukleolus Stress Induktion könnte auch geprüft werden, durch die Analyse der Zellmorphologie über Immunfluoreszenz-Färbung des Nucleolin und Kerne. Um die Auswirkungen der 4sU weiter zu überprüfen, konnte veränderten globalen Genexpression gemessen werden, indem Sie korrelieren, Grafen von beschrifteten Gesamt-RNS nach unbeschriftete Gesamt-RNS gelesen.
Handy-Nummern: Für in-Vitro generierten T-Zellen empfiehlt es sich, beginnend mit mindestens die Höhe der Zellen in Tabelle 2angegeben. Wählen Sie angemessene zahlen pro Verfahren nach der Art der Zellen. Da T-Zellen weniger Zytoplasma und RNA im Vergleich zu anderen Zellen haben, werden am ehesten geringere Mengen an andere Zellen ausreichend sein. Für ChIP-Seq hängen Zellzahlen hoch der Antikörper verwendet und die Expression des Proteins des Interesses innerhalb der Zellen. Für Histon oder RNAPII ChIP können liegt Zellen verwendet werden, während Zellzahlen müssen erhöht werden, wenn Transkriptionsfaktoren verwendet werden, vor allem, wenn sie auf einem niedrigen Niveau zum Ausdruck kommen.
4 sU-labeling und RNA-Biotinylierungen: Bei der Verwendung von adhärenten Zellen kann 4sU Kennzeichnung geleitet werden, wie durch Rädle Et al.beschrieben. 19 seit Zellen sehr schnell integrieren 4sU, kann es direkt auf das Medium der Aussetzung, Anhänger oder semi-adhärente Zellen hinzugefügt werden.
Es wird empfohlen, die Biotinylierungen mit 60-80 µg RNA zu beginnen. Jedoch geringere Mengen an RNA können verwendet werden, obwohl wir nicht testen für weniger als 30 µg. Hinzufügen einer Coprecipitant (z.B.GlycoBlue) als RNA Ausfällen, wenn das Pellet schwer zu erkennen ist. Duffy Et Al. haben gezeigt, dass diese Methylthiosulfonate aktiviert Biotin (MTS-Biotin) effizienter mit 4sU beschriftet RNA als HPDP-Biotin31reagiert. Daher kann es sinnvoll unter Berücksichtigung der Umstellung auf MTS-Biotin, insbesondere für die Verwertung von kleinen RNAs, die neigen, weniger Uridin Rückstände haben (beziehen sich auf das Biotinylierungen-Protokoll von Duffy Et Al.; siehe Reinigung von 4sU beschriftet RNA genannt, sein Experimentelle Verfahren).
Für die Verwertung von neu transkribierten RNA ist es möglich, paramagnetischen Beads oder RNA Cleanup Perlen Ihrer Wahl verwenden. Berücksichtigen Sie immer, die diese Kits können oder können nicht für bestimmte RNAs reinigen. Wenn Sie MiRNAs interessiert sind, betrachten Sie z. B. mit speziellen Kits für MiRNA Abscheidung und Sequenzierung.
Quantifizierung der neu transkribierten RNA: Um neu transkribierten RNA genau zu quantifizieren, Messung durch eine geeignete Fluorometer durchgeführt werden (siehe Tabelle der Materialien). Innerhalb 1 h nach 4sU Exposition stellt neu transkribierten RNA ca. 1-4 % der Gesamt-RNS. Neu transkribierten RNA von 1 h gekennzeichnet, aktivierte T-Zellen besteht aus ca. 90-94 % der rRNA11.
Ribosom Profilerstellung: Bei der Festlegung der Methode wird herausgestellt, dass mit 1,5 Mal die Menge der Nuklease als das ursprüngliche Protokoll vorgeschlagen richtige Verdauung garantiert. Auch wurden keine negativen Auswirkungen für erhöhte Mengen an Nuklease berichtet. Denn es ziemlich schwierig ist, den RPFs overdigest während sie Bestandteil der RNA durch ribosomale Proteine gebunden sind, können Sie den Betrag ein, um optimale Nuklease Verdauung titrieren noch leicht erhöhen.
Wenn weniger als 500 ng RPF RNA wurden geborgen, in Schritt 4.4.2, wiederholen Sie die rRNA Erschöpfung und Pool gereinigt RPFs mit RNA Clean & Konzentrator-5 Spalten. Alternativ laden Sie zwei identische Proben nebeneinander auf das Gel (Schritt 4.5.3) und Pool Gel Scheiben während RNA Elution aus dem Gel (Schritt 4.5.6).
Es wird empfohlen, schneiden die RPFs auf einem Gel so dicht wie möglich an die 28 und 30 nt-Bands. Dies hilft bei der Beseitigung von unerwünschten Fragmente von rRNAs und tRNAs, die später Bestandteil Ihrer Bibliothek und Sequenzierung liest für Ihre RPFs reduzieren.
Es wird auch empfohlen, UV-Licht während Gel Reinigung zu vermeiden. Dies kann Nicks erstellen, in der RNA-Fragmente sowie Pyrimidine Dimere, die am Ende der Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung Ergebnisse erheblich beeinträchtigen können.
Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung von Daten: Ribosom Profilerstellung Protokoll ermöglicht eine cDNA-Bibliothek für Sequenzierung zu generieren. Proben von 4sU Beschriftung erzeugt können direkt für die Vorbereitung der Bibliothek mit einer entsprechenden RNA Sequenzierung Kit verwendet werden. Seit neu transkribierten RNA vor allem, wenn mit kurzen Zeiten, Kennzeichnung noch nicht Polyadenylated, ist sollte keine Poly-A-Auswahl durchgeführt werden. Stattdessen empfehlen wir rRNA Erschöpfung zu verhindern, dass Verringerung der Sequenzierung Tiefe für die eigentliche Probe. Mit T-Zellen, wir begannen mit 400 ng neu transkribiert und total RNA (abhängig von dem Kit, siehe Materialien), durchgeführt rRNA Erschöpfung und reduziert Zyklen für PCR-Amplifikation, PCR Verzerrungen zu minimieren. Vorbereiten der Bibliothek kann mit weniger Ausgangsmaterial durchgeführt werden. Um Bibliothek Komplexität vieler PCR-Zyklen berücksichtigen sollte optimiert werden.
Für ChIP-Seq gibt es auch viele Kits für Bibliothek Vorbereitung zur Verfügung. In unseren Händen-Bibliothek Vorbereitung arbeitete auch beginnend mit 2 ng DNA-ChIP (siehe Materialien für einen Vorschlag, welche Kit zu verwenden). Achten Sie darauf, die Indizes für Farb-Balance während der Sequenzierung zu überprüfen. Wir empfehlen eine Sequenzierung Tiefe von ≥40 x 106 liest jedes 4sU-Seq, total RNA-Seq und ChIP-Seq-Proben und ≥80 x 106 liest für Ribosom Profilerstellung Proben. Die Sequenzierung Tiefe richtet sich nach der Probe und der nachgeschalteten Bioinformatik-Analyse und sollte gut überlegt sein. Um zu analysieren, intronischen liest für cotranscriptional Spleißen, 100 muss bp gepaart-End Sequenzierung gewählt werden.
Bias-Sequenzierung: Sequenzierung ist der Goldstandard geworden, bei der Festlegung globale Veränderungen in Transkription, Übersetzung und Transkription Faktor Bindung. In den letzten Jahren bestehende Methoden waren an ihre Grenzen gestoßen oder neue Techniken wurden entwickelt, um immer kleinere Startbeträge RNA-Sequenzierung. Dies erfordert eine Verstärkung der cDNA, die Rauschen oder Verzerrungen führt. Vor kurzem wurden einzigartige molekulare Bezeichner (UMIs) entwickelt, um Duplikate von PCR eingeführt experimentell zu identifizieren. Vor kurzem zeigte sich, dass UMIs nur milde Sequenzierung macht und false Discovery Rate für differenzielle gen Ausdruck32verbessern. Dennoch erwägen Sie, einzigartige molekulare Bezeichner (UMIs) für alle Bibliotheken der Sequenzierung zu steuern für Bibliothek Komplexität, vor allem beim Starten mit geringen Mengen an RNA und wenn viele PCR-Zyklen benötigt werden.
Puffer und Stammlösungen: Alle Puffer für 4sU-Seq und Ribosom Profilerstellung müssen unter strengen RNase-freie mit Nuklease-freies Wasser vorbereitet werden. Es empfiehlt sich, vorgefertigte Nuklease-freie NaCl, Tris-HCl, EDTA, Natriumcitrat und Wasser kaufen. Um Nuklease-freien Bedingungen zu gewährleisten, kann eine RNase dekontaminierende Lösung verwendet werden, um Pipetten oder Oberflächen zu säubern. Alle Puffer für ChIP-Seq müssen mindestens DNase-frei und kann bei Zimmertemperatur gelagert werden. Immer fügen Sie Protease-Inhibitoren und optional Phosphatase-Hemmer direkt vor Gebrauch hinzu und auf Eis.
Bioinformatik: Analyse aller Sequencing-Daten (d. h., ChIP-Seq, RNA-Seq und Ribsosome profiling) beinhaltet Qualitätskontrolle (z.B.mit FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), Adapter trimmen (z. B.mit Cutadapt20) gefolgt von Mapping auf das Referenz-Genom für die Zellen untersucht. Für RNA-Seq-Daten (insgesamt und 4sU-Seq) sowie Ribosom Profilerstellungsdaten ist eine gespleißte RNA-Seq-Mapper erforderlich, z. B. ContextMap 221. Für ChIP-Seq Daten unspliced Achsen reicht mit BWA-MEM-22 . Genexpression kann berechnet werden, mit dem RPKM Modell (gelesen pro Kilobase Exon pro Million Fragmente abgebildet)1, nach der Bestimmung Zählungen pro gen mit einem Programm, z. B. FeatureCounts23zu lesen. Für den Gipfel Aufruf von ChIP-Seq-Daten, gibt es eine Reihe von Programmen, z.B., MACS24 oder GEM25. Weiter können nachgeschaltete Analysen in R26, insbesondere unter Verwendung von Bioconductor Projekt27bereitgestellten Tools durchgeführt werden.
Hier ist eine große Herausforderung bei der Integration von 4sU und Gesamt-RNA-Ebene und translationale Aktivität vom Ribosom Profilerstellung Normalisierung. Ein klassischer Ansatz zur Lösung dieses Problems ist, auf ein Niveau von Housekeeping Gene zu normalisieren. Durch zufällige Schwankungen für einzelne Housekeeping Gene reduzieren, es empfiehlt sich nicht nur ein paar Housekeeping Gene Median Ebenen für eine größere Gruppe, z. B. zu verwenden, aber die > 3.000 Housekeeping Gene zusammengestellt von Eisenberg und Levanon28 . Für die Berechnung der RNA Umsatzraten von Übersetzungen von 4sU-Gesamt-RNS, Normalisierung auf mittlere Umsatz basiert Preise (z.B., vorausgesetzt eine RNA-Halbwertszeit von 5 h)29. Da dies keine allgemeinen Änderungen für Housekeeping Gene wird davon ausgegangen, empfehlen wir jedoch mit Analyse-Ansätze unabhängig von Normalisierung, z.B.Korrelation basierende Cluster einer Zeitreihe der verschiedenen Datentypen um Gruppen von Genen identifizieren mit unterschiedlichen Verhalten in Transkription und Übersetzung während der Aktivierung. Für eine detaillierte Beschreibung über Laborprotokollen Integration der verschiedenen Datentypen verweisen wir auf die ursprüngliche Publikation11.
Analyse von Umsatz Preise und Datenintegration: Einer kürzlich veröffentlichten Papier33 Halbwertszeiten bestimmt durch eine gebündelte gen (MGC) im Vergleich zu globale Methoden konnten zeigen, dass die Halbwertszeiten korreliert am besten mit denen, die durch metabolische Kennzeichnung Methoden im Vergleich zu anderen Methoden (z.B., Allgemeine Hemmung der Transkription durch Medikamente). Allerdings sei darauf hingewiesen, dass Unterschiede zwischen Halbwertszeit Berechnungen entstehen können und beschriebenen 15,34gewesen. Wir machen den größten Teil der Probleme und Differenzen, die durch die Stress-Reaktion aufgrund der längeren 4sU Exposition eingeführt werden. Daher ist es unerlässlich, die Stress-Reaktion von 4sU-Kennzeichnung eingeführt auszuschließen. Um weitere Umsatzraten zu überprüfen, empfehlen wir die Verwendung von MGCs.
Darüber hinaus könnte ein Dataset als hier erzeugt auch ein integrativer Daten Analyse (z.B. Regelung der lange nicht-kodierende RNAs)35,36verwendet werden.

In den letzten Jahren geworden RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) das Standardwerkzeug, alle geäußerten RNAs innerhalb einer Zelle oder eines Organismus1zu analysieren. Um den gesamten Prozess der Zellen als Reaktion auf einen bestimmten Reiz/Medikament Anpassung zu verstehen, ist es jedoch notwendig, vollständig alle zugrunde liegenden Prozesse, Bearbeitung, Umsatz und Übersetzung von mRNA-Transkription bis fest. Kurzfristige Änderungen im RNA-Transkription können kaum von insgesamt RNAseq gemessen werden, da Änderungen von Gesamt-RNS abhängig von Faktoren wie z.B. RNA Halbwertszeiten und transkriptionelle Aktivität sind eine schlechte Vorlage zu reflektieren die Anpassung der Zellen zu Auswirkungen auf die Umwelt2,3. In der Tat eine Vielzahl von neuen Sequenzierung Techniken wurden entwickelt, die eine Analyse der verschiedenen Schritte im Prozess der gen Verordnung4 Kombination in der richtigen Weise zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt, wie einige ziemlich leicht anwendbare Sequenzierung Techniken kombinieren, die Verfolgung der Verordnung der wesentlichen Schichten der mRNA in vergleichender Weise zu ermöglichen. Für die Analyse von transkriptionelle Aktivität, eine Vielzahl von Methoden beschrieben worden, wie z.B. GAP-Analyse von gen Ausdruck (CAGE)5, native Dehnung Transkript Sequenzierung (NET-Seq)6und genomweite nuklearen Nachlauf (GRO-Seq)7 , 8, sowie Bromouridine-Sequenzierung (Bru-Seq) und 4-Thiouridine-Sequenzierung (4sU-FF), die Metaboliten zu verwenden, die in neu eingebaut sind transkribierte RNA9,10, um nur um einige wenige zu nennen. Während CAGE die genaue Transkription Startsite identifiziert, NET-Seq und GRO-Seq genauere Informationen liefern über das Lesen von Richtungen und 4sU-Seq (das ist die hier beschriebene Methode) nur neu erkennt transkribiert RNA. Jedoch 4sU-Seq ist sehr empfindlich und kann angewendet werden, in verschiedenen Zeitrahmen zu messen quantitative transkriptionelle Aktivität aktiv zu ändern, Zellen sowie quantitative Veränderungen in der mRNA-Verarbeitung (was innerhalb von Minuten)9, 11,12. Darüber hinaus ist 4sU-Seq ideal kombinieren mit RNA-Seq RNA Umsatzraten für Gene9zu berechnen. Die Transkription der mRNA durch RNA-Polymerase II (RNAPII) erfolgt, die wiederum durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst wird, wie z. B. Transkriptionsfaktoren, Histon-Modifikationen und allgemeine Aktivatoren/Repressoren, die können sogar die transkriptionelle gehören komplexe. Um zu testen wie viele gen/Veranstalter/Enhancer Regionen von einem Faktor gebunden sind, hat ChIP-Seq entwickelt, das ist jetzt die standard-Methode für diesen Zweck, aufgrund der vielen im Handel erhältlichen Antikörper13. Jedoch obwohl ChIPseq klaren Informationen gibt über wo Bind regulieren Faktoren, spiegelt es nicht wenn es in der Tat zu Veränderungen der Transkription14 führt. Durchführung von ChIP-Seq mit 4sU-Seq ist daher, die ideale Kombination für solche biologischen Fragen. Regulation der Genexpression kann auch zu einem späteren Zeitpunkt auftreten, da mRNA und Protein Ebenen nicht unbedingt15,16 korreliert, Angabe möglicherweise erhebliche Verordnung über die translational oder post-translationalen Ebene, je nach Kontext. Im Jahr 2011 Ribosom Profilierung hatte zunächst mit RNA-Seq kombiniert worden und ist jetzt die Methode der Wahl, um Änderungen zu quantifizieren, die schnell an Eiweiß, auftreten, da gibt es noch einige Sensitivitätslimite mit Massenspektrometrie17. In der Tat Umrechnungskurse von solchen Methoden erhalten haben gezeigt, dass bieten eine relativ gute Einschätzung der Änderungen im Protein-Ebene (zumindest für langfristige Veränderungen gemessen) und ermöglichen eine noch detailliertere Sicht auf den Prozess der Übersetzung, z. B. die Bestimmung der Start-Seite und alternative Übersetzung Rahmen17. Die kombinatorische Verwendung aller vier Methoden im Steady-State, zwischen verschiedenen Zelltypen, verwendet werden oder in die Zeit-Serie von einer sich rasch verändernden Zelle11zu experimentieren. Dieser Einsatz bietet eine genomweite Übersicht über Änderungen in Transkription Faktor Bindung RNA-Transkription, Bearbeitung und Übersetzung zu beeinflussen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;4sU-labeling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &amp;ndash;20&amp;deg;C in aliquots of 50-500 &amp;micro;l; do not refreeze.</td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Optional</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>WARNING &amp;ndash; HAZARDOUS TO HEALTH</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; always prepare fresh</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&amp;deg;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Use in step 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polypropylene 15&amp;nbsp;ml centrifuge tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &amp;times; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &amp;ndash; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Optional; includes Buffer RLT</td></tr><tr><td>Sodium citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Store at 4&amp;deg;C, includes &amp;micro;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell viability and stress assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>Optional</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Optional</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Washing Buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td><td>store at 4 &amp;deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA precipitation buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Optional</td></tr><tr><td>UV/VIS spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptors for 15 ml tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>One stand holds 8 &amp;micro;Macs columns.</td></tr><tr><td>Ultra-fine scale</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Optional</td></tr><tr><td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome Profiling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (Yeast)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (Mammalian)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-25 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 or MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(High Sensitivity DNA Kit)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Already needed for 4sU-seq</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;All other consumables and equipment are listed in the User guide&lt;/strong&gt;</td><td>!!!</td><td></td><td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ChIP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Add to a final concentration of 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Always prepare fresh</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ChIP library preparation kit</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Or use the kit of your choice</td></tr><tr><td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Prepare a 2M stock solution</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td></tr><tr><td>Rnase, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (ChIP grade if possible)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>or antibody of interest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&amp;nbsp;mM EDTA; 16.7&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td>Store at RT up to 6 months</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>Nuclei-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td></tr><tr><td>Wash buffer I</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer II</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&amp;nbsp;mM EDTA; 20&amp;nbsp;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.25&amp;nbsp;M LiCl; 1% NP-40; 1&amp;nbsp;mM EDTA; 10&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>use this instrument for electrophoretical analysis</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>or tubes special for your sonication device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td><td></td><td></td><td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &amp;micro;l each tube)</td></tr><tr><td>Magnetic stand for tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td></tr></tbody></table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

Nach der Aktivierung Zellen rasch ändern ihre funktionale Programme und damit ihre Genexpressionsprofil. Massive Veränderungen in der Genexpression auftreten, beispielsweise bei der Zelldifferenzierung, Morphogenese und funktionelle Stimulation (z. B. die Aktivierung von Immunzellen), oder nach der Exposition gegenüber Drogen und andere Faktoren aus der lokalen Umgebung. Je nach Reiz und Zelle treten diese Änderungen schnell und auf jeder Ebene der Genregulation. Anzeigen aller molekularen Prozesse einer Zelle reagiert auf eine bestimmte Art von Reiz/Medikamenten ist eine der schwierigsten Aufgaben im Bereich der Molekularbiologie. Hier beschreiben wir eine Protokoll, die die simultane Analyse von mehreren Schichten der Genregulation ermöglicht. Wir vergleichen, insbesondere Transkriptionsfaktor verbindlich (Chromatin Immunopräzipitation-Sequenzierung (ChIP-Seq)), de-Novo -Transkription (4-Thiouridine-Sequenzierung (4sU-Seq)), mRNA-Verarbeitung, sowie Umsatz und Übersetzung (Ribosom Profiling). Durch die Kombination dieser Methods, ist es möglich, eine detaillierte und genomweite Vorgehensweise angezeigt.
Neu transkribierten RNA Sequenzierung empfiehlt sich besonders bei der Analyse von schnell anzupassen oder Wechselsysteme, da dies die transkriptionelle Aktivität aller Gene während der Zeit der 4sU Exposition zeigt (unabhängig davon, ob sie up- oder herunterreguliert). Die kombinatorische Verwendung von total RNA-Seq und Ribosom Profilierung ermöglicht darüber hinaus die Berechnung der RNA Umsatz und Übersetzung raten. Bioinformatische Analyse von Hochdurchsatz-Sequenzierung Ergebnisse ermöglicht viele Mittel für die Analyse und Interpretation der Daten. Die generierten Daten können auch verfolgen, co-transcriptional und alternative Spleißen, um nur einige Möglichkeiten zu nennen.
Der hier beschriebene kombinierten Ansatz kann für verschiedenen Modellorganismen oder Zelltypen, einschließlich Primärzellen angewendet werden. Wir bieten detaillierte Protokolle für jede Methode verwendet, einschließlich Qualitätskontrollen, und besprechen Sie mögliche Probleme und Fallstricke.

4 sU Kennzeichnung: Überprüfen Sie optimale 4 sU-Kennzeichnung Bedingungen (zytoplasmatischen Stress, Apoptose, nukleare Stress), Zeit und Konzentration: Hohes Maß an 4sU können hemmen die Produktion und Verarbeitung von rRNA und zytoplasmatischen sowie nukleare Stress30zu induzieren. Daher sollte die Zellen von Interesse für 4sU-induzierten Stress sowie Apoptose getestet werden. Western-Blot Analyse empfiehlt sich zur Visualisierung von p53-Akkumulation, die nukleare Belastung angibt, Phospho-EIF2a Anhebung der zytoplasmatischen Stress und Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) Analyse für die Apoptose angezeigt. Hohe und lange Exposition gegenüber 4sU oder Medikamente wie Thapsigargin oder Arsenat können zur zellulären Stress auslösen. Um Apoptose oder Zelltod induzieren, Zellen mit BH3I-1 behandelt wurden (500 ng/µL) oder inkubierten für 5 min bei 95 ° C (Hitzeschock). Annexin V/7-AAD Färbung wurde zur Apoptose (Annexin V) und Toten (7-AAD) Zellen zu bestimmen. Kennzeichnung von in-Vitro erzeugte primäre Th1 Zellen für 0,5 h mit 500 µM 4sU (Endkonzentration) oder 1 h mit 200 µM 4sU weder Anzeichen von zellulären Stress induziert oder Apoptose (Abbildung 1) aber zu ausreichend 4sU Aufnahme führen.
RNA Kennzeichnung Zeit verkürzt werden (≤5 min) das führt zu einem Anstieg der kurzlebigen intronischen Sequenzen im Vergleich zu mehr Kennzeichnung Zeiten. Um co-transcriptional Spleißen Preise sichtbar zu machen, sollte 4sU Kennzeichnung mal 30 min nicht überschreiten. Weitere Einzelheiten zum 4sUlabeling finden Sie unter Rädle Et Al. 19
Qualitätskontrolle: Integrität der RNA ist von großer Bedeutung bei der Verarbeitung von RNA. Es ist am bequemsten, die RNA mit der Bezeichnung von 4sU RNA nach Biotinylierungen durch eine electrophoretical Analyse Qualitätsprüfung (siehe Tabelle der Materialien). Betrachten Sie isolierten RNA aus Schritt 2.2.2, zu überprüfen, vor allem, wenn es für die Sequenzierung von Gesamt-RNS. RNA-Integrität-Anzahl (RIN) sollte ≥8, Integrität der RNA zur Weiterverarbeitung (Abbildung 3).
Electrophoretical Analyse kann auch verwendet werden, um neu transkribierten RNA zu überprüfen. Beachten Sie, dass neu transkribierten RNA enthält deutlich weniger Reifen rRNAs im Vergleich zum Gesamt-RNS mit den typischen rRNA-Bands viel weniger prominenten.
Ribosom Profilerstellung: PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek: cDNA Amplification (Schritt 4.9.1) ist ein wichtiger Schritt um gute Sequenzierung Ergebnisse zu gewährleisten. Analysieren Sie verstärkte Bibliotheken durch eine electrophoretical Analyse. Ein gutes Beispiel für verstärkte Bibliotheken zeigt einen Höhepunkt etwa 140-160 bp (Abb. 4A). Übermäßige Mengen an Adapter, die Dimere sollten vermieden werden (Abbildung 4 b) und die Proben sollten weiter gereinigt werden, mit der Seite Reinigungsprozedur nach der Hersteller-Protokoll (Seite Reinigung der PCR-Produkte). Zuviel Vorlage oder zuviele PCR-Zyklen führen Überverstärkung gekennzeichnet durch das Auftreten von höher als erwartet Molekulargewicht Bands, verschmierten PCR-Produkte und Adapter Dimer Produkte (Abbildung 4). Für die meisten Proben ergibt 1 bis 5 µL circularized cDNA und 9 PCR-Zyklen für Verstärkung in der Regel ausreichende Mengen an das richtige PCR-Produkt.
ChIP: Chromatin Scheren: Schur optimale Bedingungen für jede Art von Zelle angepasst werden müssen. Bestimmen Sie Schere Bedingungen (z.B. Anzahl der Zyklen, hohe oder niedrige Leistung) im Voraus. Verwenden Sie die gleiche Anzahl von Zellen und das gleiche Volumen zu Testzwecken, da ein geringer Zelldichte die Schur Effizienzsteigerungen. Versuchen Sie, über - oder unter-Scheren das Chromatin zu vermeiden. Großen Chromatin Fragmente ChIP Ergebnisse durch verstopfen dramatisch beeinflussen können, und über Scheren Epitope auf das Protein des Interesses, was zu einen niedrigeren Wirkungsgrad der Bindung durch die Antikörper zerstören kann. In diesem Experiment wurden die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Hauptfraktion des Chromatins geschert rund 1.000 wurde bp oder etwas niedriger (Abb. 5A).
Überprüfung der ChIP von qPCR: Vor Beginn des Chips ist es ratsam zu testen, ob die verwendeten Antikörper für ChIP eignet (wenn möglich, verwenden Sie ChIP Grade Antikörper) durch ChIP-qPCR. Überprüfen den ChIP für die Sequenzierung von qPCR vor Beginn der Bibliothek-Vorbereitung (siehe Schritt 5.6.5). Design-Primer, die an eine bekannte Zielstandort des Proteins des Interesses zu binden. Wenn die genaue Zielsite innerhalb eines Gens unbekannt ist, können mehrere Primer-Paaren, die Gene und damit verbundenen regulatorischen Elemente scannen verwendet werden. Für RNAPII-ChIP von Th1 Ifng Zellen, die ist transcriptionally hochreguliert nach Stimulation und Aktin Primer können als Positivkontrolle verwendet werden. Sox9 und Insulin dienen als Negativkontrolle, da diese Gene nicht in Th1 Zellen (Abb. 5 b) zum Ausdruck kommen. Vergesst nicht, Exon-spanning Primer zu verwenden, die normalerweise für qPCR mRNA verwendet werden. Ein IgG-Steuerelement kann auch verwendet werden, Spezifität der verwendeten Antikörper nachzuweisen. Immunoprecipitated DNA kann mit einem geeigneten Fluorometer gemessen werden (siehe Tabelle der Materialien). Mengen an nonspecifically gebundenen DNA durch das IgG-Steuerelement sollte deutlich niedriger, die DNA-Menge durch die Antikörper von Interesse gebunden verglichen werden.
Repliziert: Nachweis der biologischen Bedeutung: Es wird dringend empfohlen, führen die kinetische Experiment für alle Methoden, die ausgehend von den gleichen Pool von Zellen um sicherzustellen, dass Zellen haben die gleiche Identität für alle unbehandelten und behandelten Proben (Abbildung 2). Dennoch empfiehlt es sich, nehmen kleine aliquoten Hauptzeit Punkte für jede Methode, Proben, um eine biologische Replikation (z. B.durch qPCR, FACS-Analyse) zu vergleichen. Dies ermöglicht für eine grobe Abschätzung, ob die Behandlung für beide Replikate reproduzierbar war und Sie konnte mit der Sequenzierung fortfahren. Validierung von den Wiederholungen sollten mittels Laborprotokollen Analyse durchgeführt werden. Reproduzierbarkeit der Ergebnisse in Bezug auf die Korrelation zwischen FPKM Werten auf Wiederholungen beurteilt werden kann und mit Streudiagrammen (Abbildung 6) visualisiert.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Abbildung 1: Überprüfung der optimalen 4sU Kennzeichnung Bedingungen ohne störend Zellphysiologie (Figur aus Davari Et Al. 11) (A) Erkennung der Zellapoptose durch FACS Analyse: In Vitro erzeugt bzw. Th0 Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von 4sU (in Klammern angegeben) für 0,5 h, 1 h und 2 h behandelt. BH3I-1 Behandlung diente induzieren Apoptose durch Annexin V bestimmt, während Hitzeschock (5 min bei 95 ° C) verwendet wurde, um Zelltod durch 7-AAD bestimmt zu induzieren. (B) Western-Blot Analyse für p53 4sU behandelt und T-Zellen aktiviert: Proben wurden mit 200 µM 4sU für die angegebene Zeit der Aktivierung, mit Ausnahme der 0,5 h-Zeit-Punkt, der mit 500 µM 4sU beschriftet wurde beschriftet. (C) Western-Blot Analyse des Phospho-EIF2a und insgesamt EIF2a im aktivierten Th1 Zellen mit der gleichen Kennzeichnung wie in (B). Thapsigargin wurde als Positivkontrolle verwendet. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Übersicht einer kinetischen Installation genomweite Änderungen nachverfolgen Dieses Schema zeigt das Setup für die Kombination von 4sU-Seq, total RNA-Seq Ribosom Profiling und ChIP-Seq, genomweite Veränderungen bei der Behandlung zu studieren. Zellen zu bündeln und die erforderliche Anzahl von Zellen für unbehandelten Kontrolle beiseite stellen. Verbleibende Zellen zu behandeln und für jede Methode und Zeit Punkt geteilt. Beschriften Sie unbehandelt/behandelten Zellen für 4sU-Seq mit 4sU wie beschrieben. Zeitpunkte und Proben für jede Methode hängt die spezifischen biologischen Frage geprüft wird. Proben für jeden Zeitpunkt und Methode, und folgen Sie den speziellen Teil des Protokolls. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Abbildung 3: Qualitätskontrolle mit der Bezeichnung von 4sU RNA Gesamt-RNA und biotinylierte RNA aus aktivierten Th1 Zellen gewonnen wurden auf einem Bioanalyzer analysiert. 18 s rRNA und 28 s rRNA gezeigt und RNA Integrität Anzahl (RIN) ergibt sich aus dem Instrument Integrität der RNA zu bestimmen. RIN sollte ≥8, RNA-Integrität zu gewährleisten. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Abbildung 4: Bioanalyzer Profile der Ribosom Profilerstellung Bibliotheken (A) A gute Bibliothek: das Beispiel zeigt einen Spitzenwert bei den erwarteten Größenbereich (140-160 bp) und keine weitere Reinigung erforderlich ist. (B) dieses Beispiel zeigt übermäßige Adapter Dimer verstärkten Produkt (120 bp) bezogen auf das gewünschte Produkt (140-160 bp). Diese Bibliothek erfordert weitere Reinigung. (C) eine übermäßig verstärkten Probe: Molekulargewicht Gipfel höher als erwartet und verschmiert PCR Amplifikate sind sichtbar (durch Pfeile angedeutet). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Abbildung 5: Optimale Chromatin Größe nach Scheren und Überprüfung der ChIP durch qPCR (A) Agarose Gel Bild zeigt die optimale Fragmentgröße geschert Chromatin von drei Proben, die für 25 Zyklen auf einem Sonikator geschoren und gereinigt wie zuvor im Protokoll beschrieben wurden. (B) Q-PCR-Ergebnisse eines gesamten RNAPII Chips (Anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) wird als ein Prozentsatz des Eingangs dargestellt. IFNG und Aktin Primern dienten als positiv, während Sox9 und Insulin Negativkontrollen (beide Gene sind nicht in aktivierten Th1-Zellen exprimiert). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Abbildung 6: Vergleich von biologischen repliziert (Abbildung von Davari Et al. ( 11) Repräsentative Streudiagramm Vergleich Ausdruckswerte (FPKM) zwischen repliziert neu transkribierten (4sU) RNA-4 h nach der Stimulation der aktivierten Th1 Zellen. Die grüne Linie zeigt gleich FPKM Werte und Rangkorrelation wird in jeder Parzelle.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dauer der Beschriftung (min)</td>
			<td>Empfohlene 4sU Konzentration (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Empfohlene 4sU Konzentrationen (von Rädle, Et Al. 19) Die Palette der empfohlenen 4sU Konzentrationen ist für unterschiedliche Tageszeiten Kennzeichnung angegeben.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Methode</td>
			<td>Anzahl von Zellen</td>
			<td>RNA-Menge</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU-Beschriftung</td>
			<td>≥2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribosom Profilierung</td>
			<td>≥2 X107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Erforderliche Menge an primären T-Zellen Mindestbetrag der erforderlichen primären T-Zellen für jede Methode. Mengen können kleiner sein, wenn andere Zelltypen zu verwenden.

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

13.5K Aufrufe.  Helmholtz Zentrum München. Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Serie: Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Forschung

Genetik

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Immunologie und Infektion

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Krebsforschung

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung der Notch-Signaldynamik während der murinen Neurogenese

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Entwicklungsbiologie

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biologie

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Die Messung der Kinetik der mRNA Transkription in einzelnen lebenden Zellen

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Einzel-Molekül-Imaging der Genregulation<em&gt; In vivo</em&gt; Verwenden cotranslationalen Aktivierung durch Spaltung (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysomprofile Fraktionierung und Analyse von Säuger Translatomes auf einer Genom-weite Skala

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Live-Cell-Bildgebung der Transkriptionsaktivität an DNA-Doppelstrangbrüchen

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Zusammenfassung

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