Agradecemos a Lars Dölken para o Conselho para estabelecer 4sU rotulagem para primárias células T; Elisabeth Graf e Thomas Schwarzmayr pela crítica ajuda nas gerações de biblioteca e sequenciamento; Dirk Eick e Andrew Flatley para fornecimento de anticorpos RNAPII e células T; S. Henriette Uhlenhaut e Franziska Greulich para ajudar na preparação da biblioteca para ChIP-seq; Caroline C. Friedel foi apoiado por subsídios FR2938/7-1 e CRC 1123 (Z2) da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Glasmacher foi apoiado pela subvenção GL 870/1-1 da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e do centro alemão de pesquisa para Diabetes (DZD), Helmholtz Zentrum München.

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	<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation.">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li><li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection.">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126 (2015).</li><li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+advances,+challenges+and+opportunities.">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution.">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li><li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription,+Splicing,+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses.">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ContextMap+2:+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping.">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints.">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).</li><li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor.">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li><li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+housekeeping+genes,+revisited.">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li><li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533 (2016).</li><li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover.">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).</li><li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs.">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li><li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles.">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li></ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Analisar todo o processo de regulação gênica é necessário compreender plenamente as adaptações celulares em resposta a um estímulo ou tratamento. Combinando o RNA total-seq, seq-4sU, Ribossoma perfilamento e ChIP-seq em pontos diferentes do tempo leva a uma análise abrangente dos principais processos de regulação dos genes ao longo do tempo. Uma compreensão profunda dos processos biológicos é necessária para definir a configuração experimental, bem como os pontos de tempo ideal.
Desde métodos para estudar a regulação gênica melhorar rapidamente, estes protocolos podem ser adaptados para mudanças rápidas. No entanto, eles fornecem os métodos mais importantes para estudar os mecanismos de regulação genética básica em qualquer tipo de célula. Aqui, vamos discutir alguns dos fatos, deve-se considerar quando usando estes métodos e armadilhas.
Células: As células devem ser altamente viáveis e, se usando células isoladas primárias, pureza de populações de células deve ser garantida (por exemplo, análise de FACS para primárias células T). Células até mesmo um pouco estressadas podem influenciar os resultados desses métodos de sequenciamento muito sensível e diminuir a quantidade de RNA recém transcrito ou traduzido e levar a leituras indesejadas da resposta stress nos resultados do sequenciamento. A velocidade de centrifugação mencionada neste protocolo para células de Pelotas é otimizada para primárias células T. Assim, ajuste a velocidade de acordo com o tipo de célula.
4 sU efeitos na fisiologia celular: Além das opções acima para verificar a mínima perturbação de fisiologia celular sobre adição 4sU, análise adicional e/ou adicional pode ser executada, especialmente quando os números de celular são limitados. Efeitos sobre a proliferação celular podem ser testados por verificar o tempo de duplicação das células simplesmente contando células etiquetadas e sem rótulo. Indução de estresse nucleolar também poderia ser testada através da análise de morfologia celular através de mancha de nucleolin e núcleos da imunofluorescência. Para ainda mais verificar o impacto de 4sU, expressão gênica global alterado poderia ser medido pela correlação ler contagens de RNA total rotulado de RNA total sem rótulo.
Números de celular: Para em vitro gerado as células T, recomendamos começar pelo menos a quantidade de células indicado na tabela 2. Escolha números adequados por método de acordo com o tipo de células. Uma vez que as células T têm menos citoplasma e RNA em comparação com outras células, provavelmente menor quantidade de outras células será adequada. Para ChIP-seq, número de células altamente depende o anticorpo usado e o nível de expressão da proteína de interesse dentro das células. Para histona ou ChIP RNAPII, células fewe podem ser usadas, Considerando que o número de células precisa ser aumentada quando são utilizados fatores de transcrição, especialmente se eles são expressos em níveis baixos.
4 sU-rotulagem e RNA biotinylation: Ao usar células aderentes, 4sU rotulagem pode ser direcionado conforme descrito por Rädle et al. 19 desde 4sU muito rapidamente incorporar células, ele pode ser adicionado diretamente ao meio de suspensão, aderente ou células semi aderentes.
Recomenda-se iniciar o biotinylation com 60-80 µ g de RNA. No entanto, a menor quantidade de RNA pode ser usada, embora não testámos para menos de 30 µ g. adicionar uma coprecipitant (por exemplo, GlycoBlue) quando precipitação do RNA se o sedimento é difícil de ver. Duffy et al . demonstraram também que biotina methylthiosulfonate ativado (MTS-biotina) mais eficientemente reage com RNA 4sU-rotulado HPDP-biotina31. Por isso, valeria a pena pensando em mudar para MTS-biotina, em particular, para a recuperação de pequenos RNAs, que tendem a ter menos resíduos de uridina (referem-se ao protocolo biotinylation mencionado pela Sé de Duffy et al; purificação do RNA 4sU-rotulados, Procedimentos experimentais).
Para a recuperação do RNA recém transcrito, é possível usar grânulos paramagnéticos ou grânulos de limpeza de RNA de sua escolha. Sempre leve em conta que estes kits podem ou não podem purificar para RNAs específicos. Por exemplo, se você está interessado em miRNAs, considere o uso de jogos específicos para sequenciamento e captura de miRNA.
Quantificação do RNA recém transcrito: Para quantificar com precisão recentemente transcrito de RNA, medição deve ser realizada por um dados adequados (ver Tabela de materiais). Dentro de 1 h de exposição 4sU, recentemente transcrito de RNA representa cerca de 1-4% do RNA total. Recentemente transcrito de RNA de 1h rotulado, células T ativadas consiste em ~ 90-94% de rRNA11.
De perfil Ribossoma: Ao estabelecer o método, determinamos que usando 1,5 x a quantidade de nuclease do sugerido no protocolo original garante a boa digestão. Além disso, sem efeitos adversos têm sido relatados para quantidades elevadas de nuclease. Desde que é muito difícil para overdigest os RPFs enquanto eles são parte do RNA vinculado por proteínas ribossomais, ainda ligeiramente pode aumentar a quantidade para dosear a digestão de nuclease ideal.
Se inferior a 500 ng do RPF RNA foram recuperadas na etapa 4.4.2, repita a depleção de rRNA e piscina purificado RPFs com RNA Clean & concentrador-5 colunas. Em alternativa, carrega duas amostras idênticas ao lado uns aos outros sobre o gel (etapa 4.5.3) e fatias de gel de piscina durante a eluição de RNA do gel (etapa 4.5.6).
Recomendamos que os RPFs de corte em um gel tão firmemente quanto possível, para as bandas de nt 28 e 30. Isso ajuda na eliminação de fragmentos indesejados de rRNAs e tRNAs, que mais tarde tornar-se parte de sua biblioteca e reduzirá a leituras de sequenciamento para seus RPFs.
Também é aconselhável evitar a luz durante a purificação de gel UV. Isto pode criar nicks em fragmentos de RNA, os dímeros de pirimidina, que no final podem afetar severamente a biblioteca preparação e resultados de sequenciamento.
Preparação de biblioteca e sequenciamento de dados: Ribossoma protocolo de criação de perfil permite que para gerar uma biblioteca de cDNA apropriada para sequenciamento. Gerado pelo 4sU-rotulagem de amostras podem ser usadas diretamente para a preparação de biblioteca com qualquer kit de sequenciamento de RNA apropriado. Desde recentemente transcrito RNA, especialmente quando usando curto rotulagem vezes, pode ainda não estar polyadenylated, nenhuma seleção de poli-A deve ser realizada. Em vez disso, recomendamos a depleção de ARNr para evitar reduzir a profundidade de sequenciamento para a amostra real. Usando células-T, começamos com depleção de rRNA 400 ng de RNA total e recentemente transcrito (dependendo do kit, veja materiais), executada e reduzidos ciclos de amplificação por PCR minimizar o viés PCR. Preparação de biblioteca pode ser executada com menos matéria-prima. Conta para números de complexidade biblioteca de ciclos PCR deve ser otimizada.
Para ChIP-seq há também muitos kits disponíveis para preparação de biblioteca. Em nossa biblioteca de mãos preparação trabalhou bem, começando com 2 ng de DNA de ChIP (ver materiais para uma sugestão na qual kit de usar). Não se esqueça de verificar os índices para o equilíbrio de cor durante o sequenciamento. Recomendamos uma profundidade de sequenciamento de ≥ 40 x 106 lê cada para 4sU-seq, total RNA-seq e amostras de ChIP-seq e ≥ 80 x 106 leituras para Ribossoma amostras de criação de perfil. A profundidade de sequenciamento depende da amostra e a análise de Bioinformática a jusante e deve ser considerada cuidadosamente. Para analisar intrônicas leituras para a emenda cotranscriptional, 100 sequenciamento de bp emparelhado-final precisa ser escolhido.
Viés de sequenciamento: Sequenciamento tornou-se o padrão de ouro ao determinar mudanças globais na ligação do fator de transcrição, tradução ou transcrição. Em anos recentes, os métodos existentes foram empurrados para os seus limites ou novas técnicas foram desenvolvidas para cada vez mais pequenos montantes iniciais do RNA de sequenciamento. Isto requer amplificação do cDNA, que introduz ruído ou preconceito. Recentemente, identificadores exclusivos moleculares (UMIs) foram desenvolvidos para identificar experimentalmente duplicatas introduzidas pelo PCR. Recentemente, foi demonstrado que UMIs apenas ligeiramente melhorar o poder de sequenciamento e taxa de falsa descoberta de expressão diferencial do gene32. No entanto, considere usando identificadores exclusivos moleculares (UMIs) para todas as bibliotecas de sequenciamento de controle para a complexidade da biblioteca, especialmente quando começar com pequenas quantidades de RNA e quando são necessários muitos ciclos de PCR.
Buffer e soluções estoque: Todos os buffers para 4sU-seq e perfilamento Ribossoma devem ser preparados em condições rigorosas, RNase-livre usando água livre de nuclease. É recomendável comprar pre-feita livre de nuclease NaCl, Tris-HCl, EDTA, citrato de sódio e água. Para garantir condições de nuclease-livre, uma solução de RNase descontaminação pode ser usada para limpar superfícies ou pipetas. Todos os buffers para ChIP-seq precisam ser pelo menos livre de DNase e podem ser armazenados à temperatura ambiente. Sempre adicionar inibidores de protease e, opcionalmente, inibidores da fosfatase bem antes de usar e manter no gelo.
Bioinformática: Análise de todos os dados de sequenciamento (i.e., ChIP-seq, RNA-seq e criação de perfil ribsosome) envolve o controle de qualidade (por exemplo, usando FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), aparamento de adaptador (por exemplo, com cutadapt20) seguido de mapeamento para o genoma de referência para as células em estudo. Para dados de RNA-seq (total e seq-4sU), bem como dados de perfil de Ribossoma, um mapeador de RNA-seq emendado é necessário, tais como 2 ContextMap21. Para alinhamentos de dados unspliced ChIP-seq, usando BWA-MEM22 é suficiente. Expressão do gene pode ser calculada usando o modelo (leituras por quilobase do Exon por milhões de fragmentos mapeados) RPKM1, depois de determinar a ler contagens por gene usando um programa, por exemplo, featureCounts23. Para chamada de pico de dados ChIP-seq, uma série de programas está disponível, por exemplo, MACS24 ou GEM25. Mais análises a jusante podem ser executadas em R26, em particular, usando ferramentas fornecidas pelo projeto Bioconductor27.
Aqui, um grande desafio em integrar os níveis de RNA - 4sU e total e atividade translacional de perfilamento do ribossoma é a normalização. É uma abordagem clássica para resolver este problema para normalizar níveis de genes de manutenção da casa. Para reduzir o ruído devido a flutuações aleatórias de genes individuais de manutenção da casa, é recomendável usar não apenas alguns genes domésticas mas níveis medianos para um conjunto maior, por exemplo, a > 3.000 genes domésticas, compilados por Eisenberg e Levanon28 . Para o cálculo das taxas de rotatividade de RNA de rácios de 4sU-para que RNA total, normalização é baseado no volume de negócios médio de taxas (por exemplo, supondo que uma meia-vida do RNA de 5h)29. No entanto, já que isto supõe nenhuma alteração global para genes de manutenção da casa, recomendamos a utilização de abordagens de análise independente de normalização, por exemplo, de uma série de tempo dos tipos de dados diferentes para identificar grupos de genes de clustering baseado em correlação com comportamento distinto em transcrição e tradução durante a ativação. Para uma descrição detalhada sobre a integração de bioinformatical dos tipos de dados diferentes, consultar a publicação original11.
Análise de integração de dados e taxas de volume de negócios: Um artigo recentemente publicado33 comparando a meia-vida determinada por um controle de gene multiplexado (MGC) com métodos globais poderia mostrar que meias-vidas correlacionaram melhor com aqueles obtidos por métodos de rotulagem metabólicos em comparação com outros métodos (por exemplo, inibição geral da transcrição por drogas). No entanto, deve ser mencionado que as diferenças entre os cálculos de Half-Life podem surgir e tem sido descrito 15,34. Nós representam a maioria dos problemas e diferenças introduzidas pela resposta de estresse devido à exposição prolongada 4sU. Portanto, é indispensável para excluir a resposta ao stress introduzida por 4sU-rotulagem. Para validar ainda mais taxas de rotatividade, recomendamos o uso de MGCs.
Além disso, um conjunto de dados, conforme gerado aqui também poderia ser usado para um mais Integrativa dados análise (por exemplo, regulamento de tempo não-codificantes RNAs)35,36.

Nos últimos anos, sequenciamento de RNA (RNA-seq) tornou-se a ferramenta padrão para analisar tudo expressas RNAs dentro de uma célula ou um organismo1. No entanto, para compreender todo o processo de adaptação em resposta a uma estímulo/droga específica de células, é necessário determinar completamente todos os processos subjacentes, variando de transcrição de mRNA para processamento, faturamento e tradução. A curto prazo alterações na transcrição do RNA dificilmente podem ser medidas por RNAseq total, desde que as alterações do RNA total dependem de fatores por exemplo, RNA meias-vidas e atividade transcricional, que são um modelo pobre para refletindo a adaptação de células para efeitos ambientais2,3. Com efeito, uma variedade de novas técnicas de sequenciamento foram desenvolvidos que permitem uma análise das diferentes etapas no processo de gene Regulamento4 quando combinados da maneira correta. Este protocolo descreve como combinar algumas técnicas de sequenciamento bastante facilmente aplicável que permitem o acompanhamento do Regulamento das camadas essenciais do mRNA de forma comparativa. Para analisar a atividade transcricional, uma variedade de métodos têm sido descritos, como Cap-análise do gene expressão (CAGE)5, alongamento nativo transcrição sequenciamento (NET-seq)6e todo o genoma nuclear pperigoso (GRO-seq)7 , 8, bem como bromouridine-sequenciamento (Bru-seq) e 4-thiouridine-sequenciamento (seq-4sU), que usam metabólitos que são incorporados no recém transcrito de RNA9,10, só para citar alguns. Enquanto gaiola identifica o local de início de transcrição exata, NET-seq e GRO-seq fornecem informações mais precisas sobre as direções de leitura e 4sU-seq (que é o método descrito aqui) detecta apenas recentemente transcrito de RNA. No entanto, 4sU-seq é altamente sensível e pode ser aplicado em diferentes períodos de tempo para medir a atividade transcricional quantitativa em ativamente mudando células, bem como alterações quantitativas no processamento de mRNA (que acontece em poucos minutos)9, 11,12. Além disso, 4sU-seq é ideal para combinar com o RNA-seq para calcular taxas de rotatividade de RNA para genes9. A transcrição do mRNA é realizada pela RNA polimerase II (RNAPII), que por sua vez é influenciado por uma multiplicidade de fatores, tais como fatores de transcrição, modificações do histone e ativadores/repressores gerais que pode até mesmo ser parte do transcriptional complexo. Para testar quantas regiões do gene/promotor/realçador obrigam-se em um fator, ChIP-seq desenvolveu-se, que agora é o método padrão para essa finalidade, devido a muitos anticorpos comercialmente disponíveis13. No entanto, apesar de ChIPseq dá informações claras sobre onde regulamenta fatores vincular, não reflete se ele realmente leva a alterações na transcrição14. Portanto, realizar ChIP-seq com 4sU-seq é a combinação ideal para tais questões biológicas. Regulação da expressão genética também pode ocorrer numa fase posterior, desde que os níveis de mRNA e proteína não se correlacionam necessariamente15,16, indicando Regulamento potencialmente significativo na translação ou borne-translational nível, dependendo do contexto. No ano de 2011, o ribossoma profiling tinha foram combinado pela primeira vez com RNA-seq e é agora o método de escolha para quantificar as mudanças que ocorrem rapidamente em proteínas, uma vez que ainda existem alguns limites de sensibilidade com espectrometria de massa17. Com efeito, taxas de conversão obtidas de tais métodos foram mostradas para fornecer uma estimativa relativamente bom de alterações nos níveis de proteína (medidas pelo menos para mudanças de longo prazo) e permitem uma visão mais detalhada sobre o processo de tradução, por exemplo, o determinação da tradução alternativa e iniciar-lado quadros17. A utilização combinatória de todos os quatro métodos podem ser usados em estado estacionário, entre vários tipos de células, ou em uma série de tempo experimentar de uma rápida mudança de cela11. Este uso fornece uma visão geral de todo o genoma de alterações na ligação do fator de transcrição influenciando RNA transcrição, processamento e tradução.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;4sU-labeling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &amp;ndash;20&amp;deg;C in aliquots of 50-500 &amp;micro;l; do not refreeze.</td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Optional</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>WARNING &amp;ndash; HAZARDOUS TO HEALTH</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; always prepare fresh</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&amp;deg;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Use in step 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polypropylene 15&amp;nbsp;ml centrifuge tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &amp;times; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &amp;ndash; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Optional; includes Buffer RLT</td></tr><tr><td>Sodium citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Store at 4&amp;deg;C, includes &amp;micro;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell viability and stress assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>Optional</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Optional</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Washing Buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td><td>store at 4 &amp;deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA precipitation buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Optional</td></tr><tr><td>UV/VIS spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptors for 15 ml tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>One stand holds 8 &amp;micro;Macs columns.</td></tr><tr><td>Ultra-fine scale</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Optional</td></tr><tr><td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome Profiling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (Yeast)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (Mammalian)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-25 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 or MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(High Sensitivity DNA Kit)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Already needed for 4sU-seq</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;All other consumables and equipment are listed in the User guide&lt;/strong&gt;</td><td>!!!</td><td></td><td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ChIP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Add to a final concentration of 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Always prepare fresh</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ChIP library preparation kit</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Or use the kit of your choice</td></tr><tr><td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Prepare a 2M stock solution</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td></tr><tr><td>Rnase, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (ChIP grade if possible)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>or antibody of interest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&amp;nbsp;mM EDTA; 16.7&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td>Store at RT up to 6 months</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>Nuclei-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td></tr><tr><td>Wash buffer I</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer II</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&amp;nbsp;mM EDTA; 20&amp;nbsp;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.25&amp;nbsp;M LiCl; 1% NP-40; 1&amp;nbsp;mM EDTA; 10&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>use this instrument for electrophoretical analysis</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>or tubes special for your sonication device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td><td></td><td></td><td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &amp;micro;l each tube)</td></tr><tr><td>Magnetic stand for tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td></tr></tbody></table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

Após a ativação, células alterar rapidamente os seus programas funcionais e, desse modo, seu perfil de expressão do gene. Grandes mudanças na expressão gênica ocorrem, por exemplo, durante a diferenciação celular, morfogênese e estimulação funcional (como a ativação de células do sistema imunológico), ou após a exposição a drogas e outros fatores do ambiente local. Dependendo do tipo de estímulo e célula, essas mudanças ocorrem rapidamente e em qualquer nível possível de regulação gênica. Exibir todos os processos moleculares de uma célula de resposta para um determinado tipo de estímulo/droga é uma das tarefas mais difíceis em biologia molecular. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise simultânea de múltiplas camadas de regulação gênica. Podemos comparar, em particular, fator de transcrição vinculação (cromatina-imunoprecipitação-sequenciamento (ChIP-seq)), transcrição de novo (4-thiouridine-sequenciamento (seq-4sU)), processamento de mRNA e volume de negócios, bem como tradução (Ribossoma criação de perfil). Combinando estes métodos, é possível exibir um curso detalhado e todo o genoma de ação.
Sequenciamento do RNA recém transcrito é especialmente recomendado quando analisando rapidamente adaptar ou alterar sistemas, desde que este retrata a atividade transcricional de genes de todos durante o tempo de exposição 4sU (independentemente se eles são acima - ou ativador). A utilização combinatória de RNA total-seq e perfilamento Ribossoma, além disso, permite o cálculo das taxas de rotatividade e tradução de RNA. Análise de Bioinformatic dos resultados do sequenciamento do elevado-throughput permite muitos meios para análise e interpretação dos dados. Os dados gerados também permite rastreamento co-transcriptional e alternativas emenda, só para mencionar alguns resultados possíveis.
A abordagem combinada descrita aqui pode ser aplicada para organismos modelo diferentes ou tipos de células, incluindo as células primárias. Além disso, podemos fornecer protocolos detalhados para cada método utilizado, incluindo controles de qualidade e discutir potenciais problemas e armadilhas.

4 sU rotulagem: verificar ideal 4 sU-rotulagem condições (apoptose, nuclear stress, stress citoplasmática), tempo e concentração: Altos níveis de 4sU podem inibir a produção e processamento de RNA ribossomal e induzir stress citoplasmática, bem como nuclear30. Portanto, as células de interesse devem ser testadas para 4sU induzida por estresse, bem como a apoptose. Análise ocidental do Borrão é recomendado para a visualização de acumulação de p53, que indica a tensão nuclear, aumentando os níveis de fosfo-EIF2a que apresentam estresse citoplasmática e fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS) por apoptose. Níveis elevados e longa exposição ao 4sU ou drogas como thapsigargin ou Arsenito podem ser usados para induzir o estresse celular. Para induzir apoptose morte celular, as células foram tratadas com BH3I-1 (500 ng / µ l) ou incubadas por 5 min a 95 ° C (choque térmico). Anexina V/7-AAD coloração foi usada para determinar a apoptose (anexina V) e células de mortos (7-AAD). Rotulagem de in vitro gerado primárias células Th1 para 0,5 h com 500 µM 4sU (concentração final) ou 1 h com 200 µM 4sU induz nem sinais de estresse celular nem apoptose (Figura 1), mas leva a incorporação de 4sU suficientes.
RNA rotulagem tempo também pode ser encurtado (≤ 5 min) que leva ao aumento de curta duração intrônicas sequências vezes em comparação com mais de rotulagem. Para visualizar taxas emenda co-transcriptional, vezes 4sU-rotulagem não devem ultrapassar 30 min. Para obter mais detalhes sobre 4sUlabeling, por favor consulte Rädle et al. 19
Controle de qualidade: Integridade do RNA é de grande importância quando o processamento do RNA. É mais conveniente verificar a qualidade do RNA do RNA 4sU-rotulado depois biotinylation pela análise electrophoretical (ver Tabela de materiais). Considere a possibilidade de verificar RNA isolado da etapa 2.2.2, especialmente quando usá-lo para sequenciamento do RNA total. Número de integridade do RNA (RIN) deve ser ≥ 8 para garantir a integridade do RNA para tratamento posterior (Figura 3).
Electrophoretical análise também pode ser usado para verificar recentemente transcrito de RNA. Esteja ciente de que o RNA recém transcrito contém significativamente menos maduro rRNAs comparado ao RNA total com as bandas rRNA típico, sendo muito menos proeminente.
De perfil Ribossoma: amplificação por PCR da biblioteca de cDNA: amplificação do cDNA (etapa 4.9.1) é um passo fundamental para garantir resultados bom sequenciamento. Analise bibliotecas amplificadas pela análise electrophoretical. Uma boa amostra de bibliotecas amplificadas mostra um pico em torno de 140-160 bp (Figura 4A). Quantidades excessivas de adaptador dímeros devem ser evitado (Figura 4B) e as amostras devem ser purificadas ainda mais usando o procedimento de purificação de página de acordo com o protocolo do fabricante (purificação da página de produtos do PCR). Muito modelo ou muitos ciclos PCR podem resultar em amplificação excessiva, caracterizada pelo aparecimento de bandas de peso molecular maior do que o esperado, produtos PCR borrados e produtos de dímero de adaptador (Figura 4). Para a maioria das amostras 1-5 µ l do cDNA circular e 9 ciclos PCR para amplificação tipicamente produzirá quantidades suficientes do produto correto do PCR.
ChIP: cromatina de corte: Óptimas condições de corte precisam ser ajustado para cada tipo de célula. Determine as condições de corte (por exemplo, o número de ciclos, alta ou baixa potência) com antecedência. Use o mesmo número de células e o mesmo volume para testes, uma vez que uma menor densidade celular aumenta a eficiência de corte. Tente evitar sobre ou sob-corte a cromatina. Fragmentos de cromatina grande podem afetar drasticamente os resultados de ChIP por entupimento, e excesso de corte pode destruir resumos sobre a proteína de interesse, levando a uma menor eficiência de ligação pelo anticorpo. Neste experimento, os melhores resultados foram alcançados quando a fração principal da cromatina cortada era cerca de 1.000 bp ou ligeiramente inferior (Figura 5A).
Verificar o ChIP por qPCR: Antes de iniciar o ChIP, é aconselhável testar se o anticorpo utilizado é apropriado para ChIP (se possível, usar os anticorpos da classe de ChIP) por ChIP-qPCR. Verifique se o ChIP para sequenciamento por qPCR antes de iniciar a preparação de biblioteca (consulte a etapa 5.6.5). Projetar primers que se ligam a um site conhecido alvo da proteína de interesse. Se o site de destino exato dentro de um gene é desconhecido, vários pares de primeira demão podem ser usados para escanear o gene e elementos normativos associados. Para RNAPII ChIP de Th1 células Ifng, que transcricionalmente é upregulated após estimulação e actina primeiras demão podem ser usadas como controle positivo. Sox9 e insulina servem como um controle negativo, uma vez que esses genes não são expressos em células Th1 (Figura 5B). Lembra de não usar exon-abrangendo as primeiras demão, que são normalmente utilizadas para qPCR de mRNA. Um controle de IgG também pode ser usado para provar a especificidade do anticorpo usado. Immunoprecipitated DNA pode ser medido com um apropriado dados (ver Tabela de materiais). Quantidades de DNA nonspecifically acoplado pelo controle IgG devem ser significativamente mais baixo comparadas com a quantidade de DNA vinculada o anticorpo de interesse.
Replica: prova de importância biológica: É altamente recomendável realizar o experimento cinético para todos os métodos a partir do mesmo pool de células para garantir que as células têm a mesma identidade para todas as amostras não tratadas e tratadas (Figura 2). No entanto, é aconselhável levar pequenas alíquotas de tempo principais pontos para cada método comparar amostras biológica idêntico (por exemplo, por qPCR, análise de FACS). Isto permite uma estimativa grosseira se o tratamento para ambas as repetições foi reprodutível e você pode prosseguir com o sequenciamento. Validação das repetições deve ser executada por meio da análise de bioinformatical. Reprodutibilidade dos resultados pode ser avaliada em termos de correlação entre os valores FPKM entre repetições e visualizadas usando gráficos de dispersão (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> Figura 1: Verificação de condições óptimas 4sU-rotulagem sem distorçer fisiologia celular (figura de Davari et al. 11) (A) deteção de apoptosis da pilha por análise de FACS: In vitro gerado Th0 células foram tratadas com diferentes concentrações de 4sU (entre parênteses) para 0,5 h, 1 h e 2 h, respectivamente. BH3I-1 tratamento foi usado para induzir apoptose determinado pela anexina V, Considerando que o choque térmico (5 min a 95 ° C) foi usado para induzir a morte celular, determinada pelo 7-AAD. (B) análise ocidental do borrão para p53 de 4sU tratados e ativadas as células T: amostras foram rotuladas com 200 µM 4sU para a hora indicada de ativação, exceto o ponto de tempo de 0,5 h que foi rotulado com 500 µM 4sU. (C) análise ocidental do borrão de fosfo-EIF2a e EIF2a total em células Th1 ativadas com as mesmas condições de rotulagem como em (B). Thapsigargin foi usado como controle positivo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> Figura 2: Visão geral esquemática de uma instalação cinética para controlar as alterações de todo o genoma Este esquema ilustra a configuração para a combinação de 4sU-seq, total RNA-seq, Ribossoma Profiling e ChIP-seq para estudar todo o genoma alterações após tratamento com células. Células do pool e reserve o número necessário de células para controle não tratado. Tratar as células restantes e dividir para cada ponto de tempo e método. Rótulo não tratada/tratados células para seq-4sU com 4sU como descrito. Pontos de tempo e amostras para cada método dependem a questão biológica específica a ser examinada. Colher amostras para cada ponto de tempo e método e siga a parte dedicada do protocolo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> Figura 3: controle de qualidade de RNA 4sU-etiquetado Total do RNA e biotinilado RNA obtido de células Th1 ativadas foram analisados em um Bioanalyzer. RRNA 18s e rRNA 28S são mostrados e número de integridade do RNA (RIN) é dado pelo instrumento para determinar a integridade do RNA. RIN deve ser ≥ 8 para garantir a integridade do RNA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> Figura 4: Bioanalyzer perfis de Ribossoma perfis de bibliotecas (A), A boa biblioteca: A amostra mostra um pico na faixa de tamanho esperado (bp 140-160) e sem depuração adicional é necessária. (B), este exemplo mostra o produto amplificado de dímero de adaptador excessiva (120 bp) em relação ao produto desejado (bp 140-160). Esta biblioteca requer mais purificação. (C) uma amostra de excesso amplificada: picos de peso molecular maior do que o esperado e manchado PCR amplicons são visíveis (indicado pelas setas). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> Figura 5: Tamanho de cromatina ideal depois da tosquia e verificação do ChIP por qPCR (A) Agarose gel de imagens mostra o tamanho do fragmento ideal da cromatina cortado de três amostras que foram cortados para 25 ciclos em um sonicador e purificado conforme descrito antes no protocolo. (B) resultados Q-PCR de um ChIP de RNAPII total (anti-RNA Pol II, 8WG16, ab817) é representado como uma porcentagem de entrada. As primeiras demão IFNG e actina foram usadas como um positivo enquanto Sox9 e insulina são controles negativos (ambos os genes não são expressos em células Th1 ativadas). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> Figura 6: Comparação de biológico Replica (figura de Davari et al 11.) Representante de dispersão comparando valores de expressão (FPKM) entre Replica de recentemente transcrito (4sU) RNA 4 h após a estimulação de células Th1 ativadas. A linha verde indica valores iguais FPKM e correlação é indicada em cada parcela.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Duração de rotulagem (min)</td>
			<td>Concentração recomendada 4sU (µM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100 - 200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 - 30</td>
			<td>500 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500 - 2000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Recomendado 4sU concentrações (de Rädle, et al. 19) A gama de concentrações 4sU recomendada é indicada para diferentes tempos de rotulagem.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Método</td>
			<td>Número do celular</td>
			<td>Quantidade de RNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU-rotulagem</td>
			<td>≥2 x 107
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ribossoma perfilamento</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ChIP-seq</td>
			<td>≥2 x 107 - 3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Quantidade necessária de células primárias de T Quantidade mínima de pilhas de T primárias necessárias para cada método. Quantidades podem ser menor quando usando outros tipos de células.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation at JoVE.com

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

13.5K visualizações.  Helmholtz Zentrum München. Este protocolo descreve a utilização combinatória de ChIP-seq, seq-4sU, RNA total-seq e Ribossoma profiling para linhas de células e as células primárias. Permite rastreamento de alterações em fator de transcrição vinculativas, novo de transcrição, processamento de RNA, volume de negócios e tradução ao longo do tempo e exibindo o curso geral dos acontecimentos nas células ativadas e/ou rápida mudança.

Vídeo: Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Genética

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Imunologia e Infecção

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Mapeando as Relações Estrutura-Função de Fatores de Transcrição Oncogênica Desordenados usando análise transcriômica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Pesquisa do câncer

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Biologia do Desenvolvimento

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Biologia

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

Cromatina Análise de Interação com Emparelhados Fim-Tag Sequencing (Chia-PET) para mapeamento Interações cromatina e Compreensão regulação da transcrição

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Molécula única imagem da regulação gênica<em&gt; Em vivo</em&gt; Uso de ativação Cotranslational por clivagem (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome Fracionamento e Análise de mamíferos Translatomes em uma escala genômica

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imagem de células vivas da atividade transcricional no DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

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