우리는 4sU 라벨 기본 T 세포;에 대 한 설정에 대 한 조언 라스 Dölken 감사 합니다. 엘리자베스 그라프와 토마스 Schwarzmayr에 대 한 중요 한 도움 라이브러리 세대와 시퀀싱; RNAPII 및 T 세포 항 체;를 제공 하기 위한 Eick와 앤드류 Flatley 더크 명. Henriette Uhlenhaut와 프란체스카 Greulich 칩 seq;에 대 한 라이브러리 준비에 대 한 도움 캐롤라인 C. 프리 델 FR2938/7-1 하 고 CRC 1123 (Z2)에서 도이치 가운데 (DFG); 교부 금에 의해 지원 되었다 Elke Glasmacher 부여 GL 870/1-1 독일 가운데 (DFG) 독일 센터에서 대 한 당뇨병 연구 (DZD), 헬름홀츠 Zentrum 뮌헨에 의해 지원 되었다.

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	<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq.">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nat Methods. 5 (7), 621-628 (2008).</li><li>Chavez, S., Garcia-Martinez, J., Delgado-Ramos, L., Perez-Ortin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+controlling+mRNA+turnover+during+cell+proliferation.">The importance of controlling mRNA turnover during cell proliferation.</a> Curr Genet. 62 (4), 701-710 (2016).</li><li>Rutkowski, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+disruption+of+host+transcription+termination+in+HSV-1+infection.">Widespread disruption of host transcription termination in HSV-1 infection.</a> Nat Commun. 6, 7126 (2015).</li><li>Ozsolak, F., Milos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequencing:+advances,+challenges+and+opportunities.">RNA sequencing: advances, challenges and opportunities.</a> Nat Rev Genet. 12 (2), 87-98 (2011).</li><li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mammalian+promoter+architecture+and+evolution.">Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution.</a> Nat Genet. 38 (6), 626-635 (2006).</li><li>Churchman, L. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+transcript+sequencing+visualizes+transcription+at+nucleotide+resolution.">Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution.</a> Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).</li><li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters.">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145 (4), 622-634 (2011).</li><li>Dolken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67 (1), 45-54 (2014).</li><li>Davari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Genome-wide+Recruitment+of+RNA+Polymerase+II+Drives+Transcription,+Splicing,+and+Translation+Events+during+T+Cell+Responses.">Rapid Genome-wide Recruitment of RNA Polymerase II Drives Transcription, Splicing, and Translation Events during T Cell Responses.</a> Cell Rep. 19 (3), 643-654 (2017).</li><li>Windhager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrashort+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution.">Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. 22 (10), 2031-2042 (2012).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Blecher-Gonen, R., Barnett-Itzhaki, Z., Jaitin, D., Amann-Zalcenstein, D., Lara-Astiaso, D., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+chromatin+immunoprecipitation+for+genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+and+epigenomic+states.">High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states.</a> Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+genome-wide+landscape+of+translational+control.">Toward a genome-wide landscape of translational control.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (1), a012302 (2013).</li><li>Brar, G. A., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling+reveals+the+what,+when,+where+and+how+of+protein+synthesis.">Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Radle, B., Rutkowski, A. J., Ruzsics, Z., Friedel, C. C., Koszinowski, U. H., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+newly+transcribed+RNA+for+high+resolution+gene+expression+profiling+of+RNA+synthesis,+processing+and+decay+in+cell+culture.">Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bonfert, T., Kirner, E., Csaba, G., Zimmer, R., Friedel, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ContextMap+2:+fast+and+accurate+context-based+RNA-seq+mapping.">ContextMap 2: fast and accurate context-based RNA-seq mapping.</a> BMC Bioinformatics. 16, 122 (2015).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li><li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints.">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS Comput Biol. 8 (8), e1002638 (2012).</li><li>Team, R. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> R: A Language and Environment for Statistical Computing. , (2016).</li><li>Huber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestrating+high-throughput+genomic+analysis+with+Bioconductor.">Orchestrating high-throughput genomic analysis with Bioconductor.</a> Nature Methods. 12 (2), 115-121 (2015).</li><li>Eisenberg, E., Levanon, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+housekeeping+genes,+revisited.">Human housekeeping genes, revisited.</a> Trends Genet. 29 (10), 569-574 (2013).</li><li>Friedel, C. C., Dolken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA:+implications+for+transcriptomics.">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol Biosyst. 5 (11), 1271-1278 (2009).</li><li>Burger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-thiouridine+inhibits+rRNA+synthesis+and+causes+a+nucleolar+stress+response.">4-thiouridine inhibits rRNA synthesis and causes a nucleolar stress response.</a> RNA Biol. 10 (10), 1623-1630 (2013).</li><li>Duffy, E. E., Rutenberg-Schoenberg, M., Stark, C. D., Kitchen, R. R., Gerstein, M. B., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+Distinct+RNA+Populations+Using+Efficient+and+Reversible+Covalent+Chemistry.">Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry.</a> Mol Cell. 59 (5), 858-866 (2015).</li><li>Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+amplification+on+differential+expression+analyses+by+RNA-seq.">The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq.</a> Sci Rep. 6, 25533 (2016).</li><li>Baudrimont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+gene+control+reveals+rapid+mRNA+turnover.">Multiplexed gene control reveals rapid mRNA turnover.</a> Sci Adv. 3 (7), e1700006 (2017).</li><li>Rabani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells.">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).</li><li>Schlackow, M., Nojima, T., Gomes, T., Dhir, A., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+Patterns+of+Transcription+and+RNA+Processing+for+Human+lincRNAs.">Distinctive Patterns of Transcription and RNA Processing for Human lincRNAs.</a> Mol Cell. 65 (1), 25-38 (2017).</li><li>Mukherjee, N., Calviello, L., Hirsekorn, A., de Pretis, S., Pelizzola, M., Ohler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+classification+of+human+coding+and+noncoding+genes+through+RNA+metabolism+profiles.">Integrative classification of human coding and noncoding genes through RNA metabolism profiles.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (1), 86-96 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

유전자 규칙의 전체 과정을 분석 하는 것은 완전히 특정 자극 또는 치료에 대 한 응답에 세포질 적응을 이해 하는 데 필요한입니다. 총 RNA-seq 결합, 4sU-seq, 프로 파일링, 리보솜 그리고 다른 시간 지점에서 칩 seq 시간 유전자 규칙의 주요 프로세스에 대 한 포괄적인 분석을 지도 한다. 생물 학적 과정의 깊은 이해는 실험 설정으로 최적의 시간 포인트 정의 필요 합니다.
유전자 규칙을 공부 하는 방법을 빠르게 개선, 이후 이러한 프로토콜의 급속 한 변화에 적용할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그들은 모든 종류의 셀에 기본 유전자 규제 메커니즘을 공부에 대 한 가장 중요 한 방법을 제공 합니다. 여기, 우리가 논의 일부 함정 사실 하나는이 메서드를 사용할 때 고려해 야 하.
셀: 셀 매우 실용적 이어야 하 고, 순도 세포 인구의 기본 격리 된 셀을 사용 하는 경우 (예를 들어, 기본 T 세포에 대 한 FACS 분석) 보장 되어야 한다. 조금 이라도 스트레스 세포 수 있습니다이 매우 민감한 시퀀싱 방법의 결과 영향을 미칠 및 새로 베낀 또는 번역 된 RNA의 양을 줄이는 고 시퀀싱 결과에 스트레스 반응의 원치 않는 정보. 작은 셀을이 프로토콜에 언급 된 원심 분리 속도 기본 T 세포에 최적화 되어 있습니다. 따라서, 셀 형식에 따라 속도 조정 합니다.
4 세포 생리학에 수 효과: 4sU 추가 시 세포질 생리학을 최소한의 섭 동을 확인 하기 위한 전술 옵션 외에 추가 및 추가 분석 수행할 수 있습니다, 셀 수는 제한 하는 경우에 특히. 세포 증식에 영향을 단순히 레이블 및 레이블 셀을 계산 하 여 셀의 2 배 시간을 확인 하 여 테스트할 수 있습니다. Nucleolar 스트레스 유도 수 또한 nucleolin와 핵의 면역 형광 염색을 통해 셀 형태를 분석 하 여 테스트할 수 있습니다. 추가로 4sU의 영향을 확인, 변경 된 글로벌 유전자 발현 레이블이 없는 총 RNA를 레이블이 총 RNA에서 카운트를 읽는 연관 하 여 측정 될 수 있는.
휴대폰 번호: T 세포에서 생체 외에서 생성 된 표 2에 표시 된 셀의 금액 이상으로 시작 하는 것이 좋습니다. 셀 유형 방법 당 충분 한 숫자를 선택 합니다. 이후 T 세포 적은 세포질 RNA를 다른 세포에 비해, 다른 셀의 가장 가능성이 낮은 금액 적절 한 될 것입니다. 칩 seq에 대 한 셀 숫자 매우 사용 하는 항 체 및 세포 내에 관심사의 단백질의 표현 수준에 따라 다릅니다. 히스톤, RNAPII 칩에 대 한 fewe 셀 사용할 수 있습니다, 반면 셀 숫자 증가 녹음 방송 요인 사용 됩니다 때, 그들은 낮은 수준에서 표현 하는 경우에 특히 필요.
4 수 라벨 및 RNA biotinylation: 부착 세포를 사용할 때 4sU 라벨 감독이 할 수 Rädle 외에 설명 된 대로. 19 셀 매우 빠르게 통합 4sU, 이후 그것은 추가할 수 있습니다 서 스 펜 션, 부착, 또는 반 부착 세포의 매체에 직접.
RNA의 60-80 µ g는 biotinylation 시작 하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 낮은 양의 RNA 사용할 수 있는, 우리가 30 미만 테스트 하지 않았다 비록 µ g. 추가 (예:GlycoBlue)에 coprecipitant 때 펠 릿은 보기 힘들 경우 RNA를 계기. 더 피 외. 그 methylthiosulfonate 활성화 비오 틴 (biotin MTS) HPDP-biotin31보다 4sU 표시 된 RNA와 보다 효율적으로 반응 또한 나타났습니다. 따라서, 그것은 하는 경향이 (더 피 외.; 참조 4sU 표시 된 RNA의 정화에 의해 언급 하는 biotinylation 프로토콜을 참조 하십시오 적은 uridine 잔류물, 작은 RNAs의 복구에 대 한 특히, MTS-biotin, 전환 고려 가치가 있을 수도 있습니다. 실험 절차)입니다.
새로 베 껴 진된 RNA의 복구, 상자성 구슬 또는 당신의 선택의 RNA 정리 구슬 사용 가능 하다. 항상 고려이 키트 또는 특정 RNAs에 대 한 정화 하지 않을 수 있습니다. 예를 들어 당신이 miRNAs에 관심이 있다면, 미르 캡처 및 시퀀싱에 대 한 특정 키트를 사용 하십시오.
새로 베 껴 진된 RNA의 정량화: 새로 베 껴 진된 RNA는 정확 하 게 계량, 측정은 적당 한 fluorometer에 의해 수행 되어야 합니다 ( 재료의 표참조). 4sU 노출의 1 시간, 내 새로 베 껴 진된 RNA 총 RNA의 약 1-4%를 나타냅니다. 1 h 표시의 새로 베 껴 진된 RNA, 활성화 된 T 세포의 rRNA11~ 90-94% 이루어져 있다.
리보솜 프로 파일링: 방법 때, 우리는 적절 한 소화를 보장 보다 원래 프로토콜에 제안 된 nuclease 금액 x 1.5를 사용 하 여 결정. 또한, 아무 부작용 높은 양의 nuclease에 대 한 보고 되었습니다. 꽤 어려운 ribosomal 단백질에 의해 구속 하는 RNA의 일부인 동안에 RPFs를 overdigest 때문에, 최적의 nuclease 소화 적정 금액을 여전히 약간 높일 수 있습니다.
만약 500 ng RPF RNA의 단계 4.4.2에서에서 재기 되었다, rRNA 고갈 및 수영장 정화 RPFs RNA 클린 & 집중-5 열 반복. 또는 젤 (4.5.6 단계)에서 RNA 차입 중 젤 (4.5.3 단계)에 서로와 수영장 젤 조각 2 개의 동일한 샘플을 로드 합니다.
가능한 한 단단히 28 및 30 nt 밴드에는 RPFs 젤에 절단 하는 것이 좋습니다. 이 rRNAs를 tRNAs는 나중에 라이브러리의 일부가 되 고 당신의 RPFs에 대 한 시퀀싱 읽기를 줄일 것입니다 원치 않는 파편을 제거에 도움이 됩니다.
그것은 또한 UV 젤 정화 동안 빛을 피하기 위해 권장 됩니다. 닉스는 RNA 조각으로 pyrimidine 이합체, 그 끝에 심하게 라이브러리 준비 및 시퀀싱 결과 영향을 미칠 수 있습니다 만들 수 있습니다이.
라이브러리 준비 및 데이터의 연속: 프로토콜을 프로 파일링 하는 리보솜 시퀀싱에 대 한 적합 한 cDNA 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 샘플 4sU 라벨에 의해 생성 된 모든 적절 한 RNA 시퀀싱 키트 라이브러리 준비를 위해 직접 사용할 수 있습니다. 이후 새로 베 껴 진된 RNA, 특히 때 짧은 사용 시간, 라벨 수 있습니다 아직 polyadenylated, 아니 폴 리 A 선택 수행 되어야 한다. 대신, 우리는 좋습니다 rRNA 고갈 방지 하기 위해 실제 샘플에 대 한 시퀀싱 깊이 감소. T 세포를 사용 하 여, 우리는 400 수행 (키트, 참조 자료), 따라 새로 베 껴 진 고 총 RNA의 ng rRNA 고갈 시작 하 고 PCR 바이어스를 최소화 하기 위해 PCR 확대 주기를 감소. 라이브러리 준비는 더 적은 시작 물자로 수행할 수 있습니다. PCR의 라이브러리 복잡 한 숫자에 대 한 계정에 최적화 되어야 합니다.
칩 seq에 또한 있다 많은 키트 라이브러리 준비에 사용할 수 있는. 우리 손으로 도서관에서 준비 일 잘 2 시작 칩 DNA의 ng (사용 하는 키트에 대 한 제안에 대 한 자료 참조). 시퀀싱 하는 동안 색상 균형에 대 한 인덱스를 확인 해야 합니다. 4sU-seq, 총 RNA-seq, 및 칩 seq 샘플, 각 106 읽기 x ≥40 x 106 읽기 리보솜 샘플 프로 파일링에 대 한 ≥80의 시퀀싱 깊이 좋습니다. 시퀀싱 깊이 샘플 및 다운스트림 생물 정보학 분석에 의존 하 고 신중 하 게 고려해 야 합니다. Cotranscriptional 접합, 100 intronic 읽기를 분석 하 bp 쌍-엔드 시퀀싱 선택 될 필요가 있다.
바이어스 시퀀싱: 전사, 번역, 또는 녹음 방송 요인 바인딩 글로벌 변화를 결정할 때 시퀀싱 금 되고있다. 최근 몇 년 동안, 내 기존의 방법 그들의 한계를 밀어 했다 또는 새로운 기술을 점점 시작의 소량 RNA 시퀀싱을 위해 개발 되었다. 잡음 또는 편견을 소개 하는 cDNA 증폭을 해야 합니다. 최근, 독특한 분자 식별자 (Umi) 실험적으로 PCR에 의해 도입 된 중복을 식별 하기 위해 개발 되었다. 최근, Umi를 그냥 약간 전원 시퀀싱 및 차동 진 식32거짓 검색 속도 개선 보였다. 그럼에도 불구 하 고, RNA의 낮은 금액으로 시작 하는 때에 특히 그리고 많은 PCR 주기 필요한 모든 시퀀싱 라이브러리 라이브러리 복잡성에 대 한 제어를 위한 독특한 분자 식별자 (Umi)를 사용 하 여 고려 하십시오.
버퍼 및 재고 솔루션: 4sU-seq와 리보솜 프로 파일링에 대 한 모든 버퍼 nuclease 무료 물을 사용 하 여 엄격한 RNase 없는 조건 하에서 준비 되어야 한다. 미리 만든된 nuclease 무료 NaCl, Tris HCl, EDTA, 나트륨 구 연산 염과 물 구입 하는 것이 좋습니다. Nuclease 무료 조건을 보장 하기 위해, 펫 또는 표면 청소 RNase 오염을 솔루션을 사용할 수 있습니다. 칩 seq에 대 한 모든 버퍼 해야 적어도 DNase 무료 실내 온도에 저장 될 수 있다. 항상 protease 억제제와, 필요에 따라 사용 하기 바로 전에 인산 가수분해 효소 억제제를 추가 하 고 얼음에 계속.
생물 정보학: (즉, 칩 seq, RNA-seq, 및 ribsosome 프로 파일링) 모든 시퀀싱 데이터 분석의 품질 관리를 포함 (예를 들어, FastQC를 사용 하 여 http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), 어댑터 트리밍 (예를 들어, 함께 cutadapt20) 다음에 매핑 참조 게놈 연구에서 셀에 대 한. (총 및 4sU-seq), RNA-seq 데이터 뿐만 아니라 데이터를 프로 파일링 하는 리보솜, 접합된 RNA-seq 매퍼는 ContextMap 221등 필요 합니다. 칩 seq unspliced 데이터 정렬의 경우, BWA MEM22 를 사용 하 여 충분 하다. 유전자 발현은 유전자 프로그램, 예를 들면 featureCounts23을 사용 하 여 당 수를 읽고 확인 한 후 RPKM 모델 (Kilobase의 Exon 백만 조각 매핑 당 당 읽기)1을 사용 하 여 계산할 수 있습니다. 하기 위한 피크 칩 seq 데이터, 프로그램의 수 있습니다, 예를 들어, 맥24 또는 보석25. 또한 다운스트림 분석 R26, 특히 Bioconductor 프로젝트27에서 제공 하는 도구를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
여기, 4sU 및 총 RNA 수준 및 리보솜 프로 파일링에서 변환 활동의 통합에 주요 도전은 정규화 이다. 이 문제를 해결 하기 위해 고전적인 방법은 집 유지 유전자의 수준에 정상화 하는 것입니다. 소음을 줄이기 위해 개별 집 유지 유전자에 대 한 임의의 변동으로 인해, 것이 좋습니다 아니라 더 큰 집합, 예를 들어 중간 수준 하지만 몇 집 유지 유전자를 사용 하는 > 3000 집 유지 유전자 아이젠 버그와 Levanon28에 의해 컴파일된 . 비율-에 4sU의 총 RNA, 정규화는 평균 매출 기반에서 RNA 이직 률의 계산에 대 한 요금 (예를 들어, 5 h의 RNA 반감기를 가정)29. 그러나,이 가정 집 유지 유전자에 대 한 전체 변경, 이후 좋습니다 정규화, 예, 상관 관계 기반 유전자의 그룹을 식별 하는 다른 데이터 형식의 시계열의 클러스터링의 독립적인 분석 방법을 사용 하 여 와 함께 전사 및 번역 활성화 중에 뚜렷한 동작입니다. 서로 다른 데이터 형식의 bioinformatical 통합에 대 한 자세한 설명에 대 한 우리는 원래 게시11를 참조 하십시오.
회전율 속도 데이터 통합의 분석: 최근에 출판 된 종이33 반감기 멀티플렉스 유전자 제어 (MGC)에 의해 결정 글로벌 방법 비교 반감기 (예를 들어, 다른 방법에 비해 대사 표기 방법으로 얻은 그 최고 상관을 보여줄 수 있는 일반의 금지 약물에 의해 전사)입니다. 그러나, 그것은 하프 라이프 계산 차이 발생할 수 있습니다 고 설명된 15,34되었습니다 언급 되어야 합니다. 우리는 대부분의 문제 및 장기 4sU 노출으로 인해 스트레스 반응에 의해 도입 된 차이점에 대 한 계정. 따라서, 4sU 라벨 도입 스트레스 응답을 제외에 없어서는 아니다. 이직 률을 추가 검증 하려면 MGCs 사용을 하는 것이 좋습니다.
또한, 데이터 집합으로 여기에 생성 된 더 통합 데이터 분석 (예를 들어, 긴 비 코딩 RNAs의 규칙)35,36또한 사용 될 수 있습니다.

최근 몇 년 동안, RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 분석 하는 셀 또는 유기 체1내 모든 표현된 RNAs를 표준 도구가 되고있다. 그러나, 특정 자극/약물에 대 한 응답에 적응 하는 셀의 전체 프로세스를 이해 하려면 그것은 완벽 하 게 처리, 회전율, 및 번역 mRNA 전사에서 배열 하는 모든 기본 프로세스를 결정 하는 데 필요한. RNA 녹음 방송에 있는 단기적인 변화 거의 측정 될 수 있다 총 RNAseq에 의해 총 RNA의 변화 요인 예: RNA 반감기 그리고 transcriptional 활동에 따라 달라 집니다 이후는 세포의 적응을 반영을 위한 빈약한 서식 파일 환경 효과2,3. 사실, 다양 한 새로운 시퀀싱 기법 개발 되었다 유전자 규칙4 오른쪽 방식으로 결합 하는 과정에서 다른 단계에 대 한 분석을 허용 하는. 이 프로토콜 비교 방식에서 mRNA의 필수 레이어 규제를 추적 하도록 하는 일부 오히려 쉽게 적용 가능한 시퀀싱 기법을 결합 하는 방법을 설명 합니다. Transcriptional 활동을 분석 하기 위한 다양 한 방법 설명 되었습니다, 모자-진 식 (케이지)5, 네이티브 신장 사본 시퀀싱 (NET-seq)6및 게놈 넓은 핵 실행 (GRO-seq)7 의 분석 등 , 8로 bromouridine-시퀀싱 (Bru-seq) 및 4-thiouridine-시퀀싱 (4sU-seq), 대사 산물을 사용 하는에 새로 통합은 복사할 RNA9,10, 그냥 몇 가지 언급. 케이지 정확한 전사 시작 사이트 식별, NET-seq와 촉진제-seq 방향, 독서에 대 한 더 정확한 정보 제공 및 4sU-seq (이 방법은 여기에 설명 된) 감지만 새로 동안 RNA를 복사할 수 있습니다. 그러나, 4sU-seq 매우 민감한 이며 적극적으로 변화 하는 mRNA 처리 (분 이내 발생)는 양적 변화 뿐 아니라 셀에 양적 transcriptional 활동 측정에 서로 다른 시간 프레임에 적용할 수 있는9, 11,12. 또한, 4sU-seq RNA 유전자9에 대 한 이직 률을 계산 하는 RNA-seq와 결합 이상적입니다. MRNA의 전사를 실시 하 여 RNA 중 합 효소 II (RNAPII), 녹음 방송 요인, 히스톤 수정 및 일반적인 활성/repressors 수는 transcriptional의 일부가 될 같은 다양 한 요인에 의해 영향에 복잡 한. 테스트 하려면 얼마나 많은 유전자/발기인/증강 지역 한 요인에 의해 묶여있다, 칩 seq는 개발 되었습니다는 지금 많은 상용 항 체13인이 목적에 대 한 표준 방법입니다. 그러나, 비록 ChIPseq 어디 바인딩 요소 규제에 대 한 명확한 정보를 제공, 그것은 반영 하지 않습니다 그것은 실제로 전사14에서 변화를 리드 하는 경우. 따라서, 4sU-seq와 함께 수행 하는 칩 seq 같은 생물학 질문에 대 한 이상적인 조합 이다. MRNA와 단백질 수준에 반드시15,16, 변환 또는 닢에 잠재적으로 중대 한 규칙을 나타내는 연관 하지 않습니다 이후 유전자 발현의 규칙 또한 이후 단계에서 발생할 수 있습니다. 수준, 상황에 따라입니다. 2011 년에 리보솜 프로 파일링 먼저 RNA-seq 결합 되었습니다 했다 하 고 지금 있기 때문에 여전히 일부 감도 한계 질량 분석17단백질, 급속 하 게 발생 하는 변화를 계량 하는 선택의 방법입니다. 실제로, 그런 방법에서 얻은 번역 요금 보였다 변화 단백질 수준 (적어도 장기적인 변화에 대 한 측정)에 상대적으로 좋은 견적을 제공 하 고 번역, 예를 들면 의 과정에 더 상세한 보기를 허용 하는 시작-측면 및 대체 번역의 결정17프레임. 모든 4 개의 방법의 조합 사용 다양 한 세포 유형 사이 정상 상태에서 사용할 수 있습니다 또는 시간 직렬에서11빠르게 변화 하는 셀 실험. 이 사용의 녹음 방송 요인 바인딩 RNA 전사, 처리, 및 번역에 영향을 미치는 변화 게놈 넓은 개요를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;4sU-labeling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine (100 mg)</td><td>Carbosynth</td><td>13957-31-8</td><td>Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at &amp;ndash;20&amp;deg;C in aliquots of 50-500 &amp;micro;l; do not refreeze.</td></tr><tr><td>1.5 ml safe-lock tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30121589</td><td>Optional</td></tr><tr><td>1.5 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72692005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2.0 ml screw-top polypropylene tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72694005</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatible with Dimethylformamide</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldirch</td><td>372978</td><td>WARNING &amp;ndash; HAZARDOUS TO HEALTH</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roth</td><td>6908.1</td><td>Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; always prepare fresh</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg)</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4&amp;deg;C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>1.09634.1011</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71386</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stock solution</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml)</td><td>5Prime</td><td>2302830</td><td>Use in step 1.3.4.</td></tr><tr><td>Polypropylene 15&amp;nbsp;ml centrifuge tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 &amp;times; g</td></tr><tr><td>QIAzol Lysis Reagent (200 ml)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING &amp;ndash; CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol)</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32852</td><td>Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Optional; includes Buffer RLT</td></tr><tr><td>Sodium citrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Store at 4&amp;deg;C, includes &amp;micro;Macs columns used in step 1.4.6. (store at RT)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cell viability and stress assay&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I</td><td>BD Biosciences</td><td>559763</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p53</td><td>abcam</td><td>ab26</td><td>Optional</td></tr><tr><td>p-EIF2a (Ser51)</td><td>Cell Signaling</td><td>9721</td><td>Optional</td></tr><tr><td>BH3I-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B 8809</td><td>Optional</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4sU Washing Buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Biotinylation Buffer (10x)</td><td></td><td>store at 4 &amp;deg;C</td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>RNA precipitation buffer</td><td></td><td>store at RT</td><td>1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10</td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Optional</td></tr><tr><td>UV/VIS spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Or equivalent equipment capable of reaching 13,000&amp;nbsp;&amp;times;&amp;nbsp;g</td></tr><tr><td>High-speed rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Fiberlite F15-6 x 100y</td><td></td></tr><tr><td>Adaptors for 15 ml tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated table-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430 R</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer C</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td>One stand holds 8 &amp;micro;Macs columns.</td></tr><tr><td>Ultra-fine scale</td><td>Mettler Toledo</td><td>ML204T</td><td>Or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel iBase Power System</td><td>Invitrogen</td><td>G6400UK</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>E-Gel EX 1% agarose precast gels</td><td>Invitrogen</td><td>G4020-01</td><td>For RNA gels; or equivalent.</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet-1 each</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td>Optional</td></tr><tr><td>TruSeq stranded total RNA library prep kit</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ribosome Profiling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPYSC12116 (Yeast)</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast)</td><td>Illumina</td><td>RPHMR12126 (Mammalian)</td><td></td></tr><tr><td>Illustra MicroSpin S-400 HR Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5140-01</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-25 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1017</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &amp;amp; Concentrator-5 kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat)</td><td>Illumina</td><td>MRZG126 or MRZG12324</td><td></td></tr><tr><td>(High Sensitivity DNA Kit)</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>Already needed for 4sU-seq</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;All other consumables and equipment are listed in the User guide&lt;/strong&gt;</td><td>!!!</td><td></td><td>Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;ChIP&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 bp Plus Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0323</td><td></td></tr><tr><td>16 % Formaldehyde</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td>Add to a final concentration of 1 %</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Always prepare fresh</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>ChIP library preparation kit</td><td>KapaBiosystems</td><td>KK8504</td><td>Or use the kit of your choice</td></tr><tr><td>DNA low bind microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td>Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td>Prepare a 2M stock solution</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10-901-393-001</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4.</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor (PhosStop)</td><td>Roche</td><td>4906837001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Power SYBRgreen Master mix</td><td>Thermo Fisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Add freshly to the buffer and keep on ice</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer</td></tr><tr><td>Rnase, DNase free</td><td>Roche</td><td>11-119915001</td><td></td></tr><tr><td>Salmon sperm (sonicated to around 100bp)</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>TE pH 8.0</td><td>gereral lab supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies (ChIP grade if possible)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-RNA Pol II [8WG16]</td><td>abcam</td><td>ab817</td><td></td></tr><tr><td>anti-Histon H3K36me3</td><td>abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>or antibody of interest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Buffers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Binding/Blocking buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20</td></tr><tr><td>Cell-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40</td></tr><tr><td>ChIP IP buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2&amp;nbsp;mM EDTA; 16.7&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td></td><td>Store at RT up to 6 months</td><td>10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS</td></tr><tr><td>Nuclei-Lysis buffer</td><td></td><td>Store at RT</td><td>50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS</td></tr><tr><td>Wash buffer I</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer II</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2&amp;nbsp;mM EDTA; 20&amp;nbsp;mM Tris-HCL pH 8.1; 500&amp;nbsp;mM NaCl</td></tr><tr><td>Wash buffer III</td><td></td><td>Store at RT</td><td>0.25&amp;nbsp;M LiCl; 1% NP-40; 1&amp;nbsp;mM EDTA; 10&amp;nbsp;mM Tris-HCl, pH 8.1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>use this instrument for electrophoretical analysis</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010</td><td></td></tr><tr><td>or tubes special for your sonication device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor sonication device or sonication device of your choice</td><td></td><td></td><td>Sonication of T cells with Bioruptor: 20 - 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 &amp;micro;l each tube)</td></tr><tr><td>Magnetic stand for tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA</td></tr></tbody></table>

real-time analysis of transcription factor binding, transcription, translation, and turnover to display global events during cellular activation

활성화, 세포 급속 하 게 그들의 기능 프로그램 변경 및, 따라서, 그들의 유전자 식 프로필. 유전자 발현에 거 대 한 변화, 예를 들어 중 발생 세포 분화, morphogenesis, 고 기능 자극 (예: 면역 세포의 활성화), 또는 로컬 환경에서 약물 및 기타 요인에 노출 후. 자극 및 세포 유형에 따라 이러한 변경 내용을 신속 하 고 유전자 규칙의 모든 수준에서 발생합니다. 자극/약물의 특정 유형에 응답 셀의 모든 분자 프로세스 표시 분자 생물학에서 가장 어려운 작업 중 하나입니다. 여기, 우리는 유전자 규칙의 여러 층의 동시 분석을 가능 하 게 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리를 비교 하 여, 특히, 녹음 방송 요인 바인딩 (Chromatin-immunoprecipitation-시퀀싱 (칩 seq)), 드 노 보 전사 (4-thiouridine-시퀀싱 (4sU-seq)), mRNA 처리, 및 회전율으로 번역 (리보솜 프로 파일링). 이러한 메서드를 결합 하 여 작업의 상세 하 고 게놈 넓은 과정 표시 가능 하다.
새로 베 껴 진된 RNA 시퀀싱 특히 좋습니다 빠르게 적응 또는이 (업 또는 downregulated 인지 여부)에 관계 없이 4sU 노출 시간 동안 모든 유전자의 transcriptional 활동을 묘사 하는 때문에, 시스템, 변화를 분석할 때. 총 RNA-seq와 리보솜 프로 파일링의 조합 사용은 또한 RNA 회전율 및 번역 요금 계산 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱 결과 Bioinformatic 분석 분석 및 데이터의 해석에 대 한 많은 의미에 대 한 수 있습니다. 생성 된 데이터는 또한 co-transcriptional 및 대체 접합, 그냥 몇 가지 가능한 결과 언급을 추적 있습니다.
결합된 방법은 여기에 설명 된 다른 모형 유기 체 또는 세포 유형, 1 차 셀을 포함 하 여 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 품질 컨트롤을 포함 하 여 사용 하 고, 각 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 잠재적인 문제 및 함정을 토론.

4 수 라벨: 최적의 확인 4 수 라벨 조건 (apoptosis, 핵 스트레스, 세포질 긴장), 시간, 및 농도: 4sU의 높은 수준의 생산 및 처리 rRNA의 억제 하 고 세포질로 핵 스트레스30유도 수 있습니다. 따라서, 관심사의 세포 apoptosis로 서 4sU을 이용한 스트레스 테스트 되어야 합니다. 서쪽 오 점 분석 시각화 p53 축적, 핵 스트레스를 나타내는 것이 좋습니다 세포질 스트레스와 형광 활성화 된 세포 apoptosis에 대 한 분석 (FACS) 정렬 표시 인-EIF2a 레벨을 증가. 높은 수준 및 4sU 또는 thapsigargin 또는 arsenite 같은 약물에 긴 노출 세포 스트레스를 유도 하기 위해 사용할 수 있습니다. Apoptosis 또는 세포 죽음을 유도, 세포 BH3I-1로 치료 했다 (500 ng / µ L) 또는 incubated 95 ° C (열 충격)에서 5 분. V/7-AAD 얼룩 annexin apoptotic (Annexin V)과 죽음 (7-AAD) 셀을 결정 하기 위해 사용 되었다. 500 µ M 4sU와 0.5 h에 대 한 기본 Th1 세포 생성 된 생체 외에서 의 라벨 (최종 농도) 또는 200 µ M 4sU와 함께 1 h도 유도 하는 세포 긴장의 표시도 apoptosis (그림 1)은 충분 한 4sU 설립 하지만 이어질.
RNA 라벨 시간 또한 단축 될 수 있다 (≤ 5 분) 이상에 비해 라벨 시간 시퀀스 intronic 짧은 증가를 리드. Co-transcriptional 접합 속도 시각화 하려면 4sU 라벨 시간 30 분 넘지 말아야 한다. 4sUlabeling에 대 한 자세한 내용은 Rädle 외를 참조 하십시오. 19
품질 관리: RNA 무결성은 매우 중요 때 RNA를 처리. 그것은 electrophoretical 분석에 의해 biotinylation 후 4sU 표시 된 RNA의 RNA 품질을 확인 하기 가장 편리한 ( 재료의 표참조). 총 RNA의 시퀀싱에 대 한 그것을 사용 하는 경우에 특히 단계 2.2.2에서 고립 된 RNA를 확인 하십시오. RNA 무결성 번호 (린) ≥8 추가 처리 (그림 3)에 대 한 RNA 무결성을 보장 해야 합니다.
Electrophoretical 분석은 또한 새로 베 껴 진된 RNA를 확인을 사용할 수 있습니다. 훨씬 덜 눈에 띄는 되 고 전형적인 rRNA 밴드와 함께 총 RNA에 비해 훨씬 덜 성숙 rRNAs 새로 베 껴 진된 RNA에 포함 되어 있음을 유의 하십시오.
리보솜 프로 파일링: cDNA 라이브러리의 PCR 증폭: cDNA 증폭 (단계 4.9.1) 좋은 시퀀싱 결과 보장 하기 위해 중요 한 단계입니다. Electrophoretical 분석에 의해 증폭 된 라이브러리를 분석 합니다. 증폭된 라이브러리의 좋은 샘플 보여줍니다 주위 피크 140-160 bp (그림 4A). 이합체 되어야 하는 어댑터의 과도 한 양의 피해 (그림 4B)와 제조 업체의 프로토콜 (PCR 제품의 정화 페이지)에 따라 페이지 정화 절차를 사용 하 여 이러한 샘플을 더 순화 될 한다. 너무 많은 템플릿 또는 너무 많은 PCR 주기 예상 보다 높은 분자량 밴드, 바탕색이 PCR 제품 및 어댑터 이합체 제품 (그림 4C)의 외관에 의해 특징-증폭 될 수 있습니다. 대부분의 샘플에 대 한 circularized cDNA의 1-5 µ L 및 확대를 위한 9 PCR 주기 올바른 PCR 제품의 충분 한 양의 얻을 것입니다 일반적으로.
칩: Chromatin 전단: 최적의 전단 조건 셀의 각 유형에 대 한 조정 될 필요가 있다. 사전에 전단 조건 (예를 들어, 사이클, 높은 또는 낮은 전력의 수)을 결정 합니다. 셀과 동일한 볼륨의 동일한 수를 사용 하 여 테스트 목적으로, 더 낮은 세포 밀도 전단 효율 증가 때문에. 이상-또는 아래-기울이기는 chromatin를 방지 하려고 합니다. 큰 chromatin 조각 극적으로 영향을 미칠 수 칩 결과 막힘, 여 고-전단 항 체에 의해 낮은 바인딩 효율성에 지도 하는 관심사의 단백질에 epitopes를 파괴할 수 있다. 이 실험에서 전단된 chromatin의 주요 분수 주위 1000 때 최상의 결과 달성 했다 혈압 또는 약간 낮은 (그림 5A).
정량 하 여 칩 확인: 시작 하기 전에 칩, 그것은 사용 된 항 체는 칩에 적합 테스트 하는 것이 좋습니다 (만약에 가능 하다 면, 칩 학년 항 체 사용) 칩 정량에 의해. 라이브러리 준비를 시작 하기 전에 정량 하 여 시퀀싱에 대 한 칩을 확인 (단계 5.6.5 참조). 관심사의 단백질의 알려진된 대상 사이트에 바인딩되는 뇌관 디자인. 유전자 내에서 정확한 대상 사이트를 알 수 없는 경우 여러 뇌관 쌍 유전자와 관련 된 규제 요소 검색에 사용할 수 있습니다. RNAPII 칩의 Th1 세포 Ifng, 대 한 어떤 transcriptionally 자극, 따라 upregulated 이며 말라 뇌관 긍정적인 컨트롤로 사용할 수 있습니다. Sox9 및 인슐린 역할을 부정적인 컨트롤 때문에이 유전자 Th1 세포 (그림 5B)에서 표현 되지 않는다. MRNA의 정량에 대 한 일반적으로 사용 되는 엑손에 걸친 프라이 머를 사용 하지 기억 하십시오. IgG 컨트롤 사용된 항 체의 특이성을 증명 하기 위해 사용할 수 있습니다. Immunoprecipitated DNA는 적당 한 fluorometer로 측정 될 수 있다 ( 재료의 표참조). IgG 컨트롤에서 바인딩된 nonspecifically DNA의 양은 해야 크게 낮은에 비해 수 DNA 금액의 항 체에 의해 구속.
복제: 생물학 중요성의 증거: 그것은 강력 하 게 셀 모든 치료 및 치료 샘플 (그림 2)는 동일한 id를 가질 수 있도록 셀의 동일한 수영장에서 시작 하는 모든 방법에 대 한 운동 실험을 수행 하 고 좋습니다. 그럼에도 불구 하 고, 생물 복제 (예를 들어, 정량, FACS 분석에 의해)을 샘플 비교 하 각 방법에 대 한 주요 시간 포인트의 작은 aliquots를 려는 것이 좋습니다. 이로써 거친 추정 두 복제에 대 한 치료 재현 되었고 시퀀싱으로 진행할 수 있습니다. 유효성 검사는 복제의 bioinformatical 분석을 통해 수행 되어야 한다. 결과의 재현성 복제 사이의 FPKM 값 사이 상관 관계 측면에서 평가 될 수 있다 고 점도 (그림 6)를 사용 하 여 시각.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig1.jpg"> 그림 1: 세포 생리학을 perturbing 없이 최적의 4sU 라벨 조건 확인 (그림에서 Davari 외. 11) FACS 분석에 의해 세포 apoptosis의 (A) 탐지: 시험관에 각각 생성 Th0 세포 0.5 h, 1 시간, 2 시간, (괄호 안에 표시) 4sU의 다른 농도로 치료 했다. BH3I-1 치료는 반면 열 충격 (95 ° C에서 5 분) 7-AAD에 의해 결정 하는 세포 죽음을 유도 하는 데 사용 되었다 Annexin V에 의해 결정 하는 apoptosis를 유도 하기 위해 사용 되었다. (B) 서쪽 오 점 분석 4sU의 p53에 대 한 치료 및 T 세포 활성화: 샘플 200 µ M 4sU 활성화, 0.5 h 시간 점은 500 µ M 4sU와 함께 표시 했다를 제외 하 고 지정 된 시간에 대 한 표시 했다. (C) 인 EIF2a 및 (B)와 같이 동일한 라벨 조건 활성화 Th1 세포에서 총 EIF2a의 서쪽 오 점 분석. Thapsigargin 긍정적인 제어로 사용 되었다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig2.jpg"> 그림 2: 게놈 넓은 변화를 추적 하는 키네틱 설치의 개요 개요 이 제도 4sU-seq, 총 RNA-seq, 리보솜 프로 파일링 및 세포 치료 시 게놈 넓은 변화를 공부 하 칩 seq 결합에 대 한 설치 프로그램을 보여 줍니다. 세포를 풀 고 치료 컨트롤에 대 한 셀의 필요한 수를 따로. 나머지를 취급 하 고 각 방법 및 시간 요소에 대 한 분할. 설명 된 대로 4sU와 4sU-seq에 대 한 치료/치료 셀 라벨. 시간 점 및 각 메서드에 대 한 샘플 검사 되 고 특정 생물 학적 질문에 따라 달라 집니다. 각 시간 포인트 및 방법, 샘플 고 프로토콜의 전용된 부분을 따라. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig3.jpg"> 4sU 표시 된 RNA의 그림 3: 품질 관리 총 RNA와 RNA 활성화 Th1 세포에서 얻은 biotinylated는 Bioanalyzer에 분석 되었다. 18S rRNA와 28S rRNA 표시 되 고 RNA 무결성 번호 (린) RNA의 무결성을 확인 하는 계기에 의해 주어진 다. 린 ≥8 RNA 무결성을 보장 해야 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig4.jpg"> 그림 4: Bioanalyzer 프로 파일 라이브러리를 프로 파일링 하는 리보솜의 (A) A 좋은 라이브러리: 샘플 예상된 크기 범위 (혈압 140-160)에 피크를 표시 하 고 아니 더 정화가 필요 하다. (B)이이 샘플 보여 과도 한 어댑터 이합체 증폭된 제품 (120 bp) 원하는 제품 (혈압 140-160)를 기준으로. 이 라이브러리는 더 정화를 필요합니다. (C)-증폭 된 샘플: 예상 보다 높은 분자량 봉우리와 바탕색이 PCR amplicons (화살표로 표시) 볼 수 있습니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig5.jpg"> 그림 5: 최적의 chromatin 크기 전단 및 칩의 정량 확인 후 (A) Agarose 젤 그림 25 주기는 sonicator에 대 한 전단 및 정화 하기 전에 프로토콜에 설명 된 대로 세 가지 샘플에서 깎인된 chromatin의 최적의 조각 크기를 보여 줍니다. (B) 총 RNAPII 칩 (안티-RNA Pol II, 8WG16, ab817)의 Q-PCR 결과 입력의 백분율로 표현 됩니다. Sox9 와 인슐린 부정적인 컨트롤 (두 유전자 활성화 Th1 세포에 표현 되지 않는다)는 Ifng 와 말라 뇌관 긍정적으로 사용 되었다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56752/56752fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56752/56752fig6.jpg"> 그림 6: 생물의 비교 복제 (Davari 그 외 여러분 에서 그림 11) 식 값 (FPKM) 사이 비교 하는 대표적인 점도 활성화 Th1 세포의 자극 후 새로 베낀된 (4sU) RNA 4 h의 복제 합니다. 녹색 라인 같은 FPKM 값을 나타냅니다 그리고 순위 상관 관계 각 플롯에 표시 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>기간 (분) 라벨</td>
			<td>권장된 4sU 농도 (µ M)</td>
		</tr>
<tr>
<td>120</td>
			<td>100-200</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>200-500</td>
		</tr>
<tr>
<td>15-30</td>
			<td>500-1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>< 10</td>
			<td>500-2000</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 권장 4sU 농도 (Rädle에서 외. 19) 권장된 4sU 농도의 범위는 라벨의 다른 시간에 대 한 표시 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>메서드</td>
			<td>휴대폰 번호</td>
			<td>RNA의 금액</td>
		</tr>
<tr>
<td>4sU 라벨</td>
			<td>≥2 10 x7
</td>
			<td>≥60µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>리보솜 프로 파일링</td>
			<td>≥2 x107
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>칩 seq</td>
			<td>≥2 10 x7 -3 x 107
</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 필요한 양의 기본 T 세포 각 방법에 대 한 필요한 기본 T 세포의 최소 양입니다. 다른 세포 유형을 사용 하 여 때 금액은 작을 수도 있습니다.

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Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

13.5K 조회수.  Helmholtz Zentrum München. 이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

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Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

연구

유전학

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

면역학 및 감염병학

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

전사 분석을 사용하여 무질서한 온코겐 전사 요인의 구조 기능 관계 매핑

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

암 연구학

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic expression. Notch signaling effector Hes1 and the Notch ligand Delta-like1 (Dll1) are expressed in an oscillatory manner in neural stem/progenitor cells. Because the period of the oscillatory expression of these genes is very short (2 h), it is difficult to monitor their cyclic expression. To examine such rapid changes in the gene expression or protein dynamics, fast response reporters are required. Because of its fast maturation kinetics and high sensitivity, the bioluminescence reporter luciferase is suitable to monitor rapid gene expression changes in living cells. We used a destabilized luciferase reporter for monitoring the promoter activity and a luciferase-fused reporter for visualization of protein dynamics at single cell resolution. These bioluminescence reporters show rapid turnover and generate very weak signals; therefore, we have developed a highly sensitive bioluminescence imaging system to detect such faint signals. These methods enable us to monitor various gene expression dynamics in living cells and tissues, which are important information to help understand the actual cellular states.

Neural stem/progenitor cells exhibit various expression dynamics of Notch signaling components that lead to different outcomes of cellular events. Such dynamic expression can be revealed by real-time monitoring, not by static analysis, using a highly sensitive bioluminescence imaging system that enables visualization of rapid changes in gene expressions.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

발생학

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

생물학

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

싱글 생활 세포에서 mRNA의 전사의 속도론을 측정

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such architectures are not random and involve interactions between gene promoters and regulatory elements 13. The binding of transcription factors to specific regulatory sequences brings about a network of transcription regulation and coordination 1, 14. 
Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) was developed to identify these higher-order chromatin structures 5,6. Cells are fixed and interacting loci are captured by covalent DNA-protein cross-links. To minimize non-specific noise and reduce complexity, as well as to increase the specificity of the chromatin interaction analysis, chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used against specific protein factors to enrich chromatin fragments of interest before proximity ligation. Ligation involving half-linkers subsequently forms covalent links between pairs of DNA fragments tethered together within individual chromatin complexes. The flanking MmeI restriction enzyme sites in the half-linkers allow extraction of paired end tag-linker-tag constructs (PETs) upon MmeI digestion. As the half-linkers are biotinylated, these PET constructs are purified using streptavidin-magnetic beads. The purified PETs are ligated with next-generation sequencing adaptors and a catalog of interacting fragments is generated via next-generation sequencers such as the Illumina Genome Analyzer. Mapping and bioinformatics analysis is then performed to identify ChIP-enriched binding sites and ChIP-enriched chromatin interactions 8. 
We have produced a video to demonstrate critical aspects of the ChIA-PET protocol, especially the preparation of ChIP as the quality of ChIP plays a major role in the outcome of a ChIA-PET library. As the protocols are very long, only the critical steps are shown in the video.

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing ChIA-PET for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) is a method for de novo detection of chromatin interactions, for better understanding of transcriptional control.

염색질 상호 작용을 매핑 및 전사 규정을 이해하는 데 이점 엔드 태그 장면 (ChIA-PET)과 염색질의 상호 작용 분석

Genomes are organized into three-dimensional structures, adopting higher-order conformations inside the micron-sized nuclear spaces 7, 2, 12. Such ...

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

유전자 규정의 단일 분자 이미징<em&gt; 생체에</em&gt; 절단하여 Cotranslational 인증 (CoTrAC)를 사용

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

게놈 전체 규모에 Polysom​​e 분별과 포유류 Translatomes 분석

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

DNA 이중 가닥 휴식에서 전사 활동의 살아있는 세포 화상 진찰

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

요약

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