이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회, 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC 발견 부여)와 사 보이 재단에 의해 지원 되었다. OC에서 NSERC 박사 장학금에 의해 지원 되었다.

모든 실험 동물 보호 위원회 대학교 발 및 동물 관리에 캐나다 위원회의 동물 복지 지침에 따라 수행 했다.
1. 사전 준비 (선택 사항: 1 일을 사전에 준비)
<ol><li>세 가지 유형의 인공 척수 (실제) 솔루션 (일반, 자당 및 복구 솔루션, 1 L 각; 표 1참조)를 준비 합니다. 300 ± 10 mOsm25 솔루션의 osmolality 조정 하 고 실제 자당 근처 빙 점 아래로 냉각 (0-4 ° C). 참고: 낮은 나트륨 절단 솔루션 (실제-자당)를 사용 하 여 급성 조각26의 표면 층에 있는 뉴런의 생존 능력을 유지 도움이 됩니다.</li>
	<li>준비 빨간색 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사-594)를 포함 하는 패치 솔루션의 0.75 mL와 녹색 합성 칼슘 표시기 (예를 들어, 오 레 곤 그린 BAPTA-1, 표 1참조). Biocytin 포함 ( 표 1참조)에 기록 된 셀의 임시 게시물 형태학 식별이 필요한 경우 패치 솔루션.</li>
	<li>280 ± 5 mOsm 해결책의 pH를 7.35 ± 0.5 osmolality를 조정 합니다. 항상 솔루션 또는 얼음에 냉장고에서 유지. 참고: 칼슘 표시기의 선택 해야 수 입각 한 동적 범위와 조사 캘리포니아2 + 이벤트의 성격.</li>
	<li>≈ 2 µ m 팁 (3-5 m ω의 저항 피 펫)와 붕 세타-유리 모 세관 (참조 테이블의에서 자극 펫 패치 펫에서 붕 규 산 유리 모 세관 ( 재료의 표참조)를 준비 하는 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여, 재료) 2-5 µ m 팁. 참고: 주어진된 직경 및 모양의 펫을 끌어당기는 설정은 끌어당기는 필 라 멘 트 유형 및 유리의 특정된 유형에 대 한 램프 테스트 결과 따라 결정 됩니다.</li>
</ol>2. hippocampal 슬라이스 준비
<ol><li>Anesthetize 마우스 (P13-20, 스트레인 및 마우스의 성 실험 질문 해결 되 고에 의해 결정 됩니다) isoflurane 흡입 마 취 법 챔버 내의 종이 타월에 배치의 1 mL와 함께. 동물 취 깊이 움직임과 느린 호흡의 부족에 의해 입증으로 때 마 취 법 상공에서 그것을 제거 하 고는 단두대를 사용 하 여 목을 벨.</li>
	<li>코에 두개골의 뒤에서가 위의 작은 쌍으로 피부를 절단 하 여 두개골을 노출 합니다. Bregma 수준에서 구멍을 미니 뼈 rongeurs의 작은 쌍을 사용 합니다. 그런 다음가 위를 사용 하 여 화살 봉합을 따라 꼬리-rostral 컷을 만들기 위해. rongeurs와 뒷면 각 두개골 플랩 리프트 상승 및 바깥쪽 각 반구를 덮고 두개골을 제거 하 파악.</li>
	<li>두뇌 완전히 노출 후 작은 주걱으로 시 신경 약화. 두개골에서 뇌를 제거 하 고 지속적으로 산소, 차가운 실제 자당을 포함 하는 배양 접시에 넣어 (자당 농도 표 1 참조).<ol>
<li>더 오래 된 쥐에서 조직에 필요한 경우는 intracardiac 관류 뇌 추출 전에 차가운 실제 자당의 20 mL 가득 주사기 (25 G) 좋은 품질 슬라이스를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>추출한 동물 두뇌에서 hippocampal 조각을 준비.<ol>
<li>약 2 분에 대 한 뇌 진정 얼음 포장 페 트리 접시에 필터 종이, 필터 종이에 두뇌를 전송 하자. 두 개의 반구를 해 부.</li>
		<li>Vibratome 테이블에 (방향 화관, 횡단, 또는 수평 분할을 얻기 위해 실험 목표에 의해 결정 됩니다) 해 부 반구를 접착제와 차가운 산소 실제 자당 가득 vibratome 트레이에 몰입할. Vibratome 트레이 주위 얼음 배치 또는 vibratome 쿨러를 사용 하 여 300 µ m 약 1 ° C의 온도에서 두꺼운 조각을 확인 합니다.</li>
		<li>37 ° c가 열 산소 실제 복구를 포함 하는 목욕에서 해 마 (반구 당 최대 6 조각)를 포함 하는 조각 축적 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여</li>
		<li>적어도 45 분 동안 실제 복구 목욕에서 슬라이스를 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 전체 셀 패치 클램프 기록
<ol><li>목표에서 배치 하는 목욕에서 hippocampal 슬라이스를 설정 (배율: 40 x, 숫자 조리개: 0.8) 레이저 스캔 2 광자 현미경의. 지속적으로 산소 실제 정상에 2.5-3 mL/min의 속도로 30-32 ° C에 온수로 목욕을 perfuse.</li>
	<li>적외선 차동 간섭 콘트라스트 (IR-DIC) 또는 Dodt-SGC 현미경에 사용 하 여 관심의 크기, 모양 및 위치를 사용 하 여 셀을 찾습니다. 참고: 대상된 신경 인구에 따라 유전자 변형 마우스 모델 관심사의 세포를 쉽게 찾으려면 사용할 수 있습니다. 이 경우에,이 단계는 형광 광원의 사용으로 교체하실 수 있습니다.</li>
	<li>(예를 들어, 알 렉 사-594) 빨간 fluorophore를 포함 하는 실제 일반 솔루션에 자극 피 펫을 채우십시오.</li>
	<li>팁의 셀과 같은 지역에 되도록 조각 위에 자극 피 펫 (전기 자극 장치에 연결 된)을 설정 합니다.</li>
	<li>패치 솔루션 패치 피 펫을 채우는 머리 단계에 그것을 연결 후, 설정 조각에는 그것의 팁의 셀 바로 위에.</li>
	<li>3 방향 자 지에 주사기를 맞게 하 고 플라스틱 튜브를 통해 패치 피 펫을 연결. 패치 피펫으로 지속적인 긍정적인 압력 주입 (≈ 0.1 mL) 주사기를 사용 하 여. "가까운" 위치에 있는 자 지를 계속.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어 모듈을 활성화 하 고 "VC" 버튼을 클릭 하 여 전압 클램프 모드를 전환할. Electrophysiological 신호 수집을 위한 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 (예, clampex)를 오픈 하 고 지속적으로 모니터링 하는 데 필요한 사각형 전압 펄스 (5 mV, 10 ms)를 보내 그것을 "막 테스트" 아이콘을 클릭 피 펫 저항 변화입니다.</li>
	<li>오른쪽 상단에 대상된 셀의 될 때까지 패치 피 펫을 낮춥니다. 제작 시 세포 막과 접촉, "열기" 위치로 자 지를 설정 하 여 압력을 제거. 참고: 세포 막과 접촉 감지 때 피 펫 저항에 작은 증가 (≈ 0.2 m ω) 볼은 셀에 작은 들여쓰기는 긍정적인 압력에 의해 발생 하는 고.</li>
	<li>자 지에 적합 해 소프트웨어에서 제공 하는 피 펫 저항 1 GΩ에 도달할 때까지 빈 주사기를 사용 하 여 패치 피 펫에 약간의 부정적인 압력을 적용 됩니다. 데이터 수집 소프트웨어의 ' 막 테스트 ' 창에서 클램프-60 셀 mV.</li>
	<li>부정적인 압력을 적용 하는 셀 열리고 전체 셀 구성 달성 될 때까지 계속 합니다. 이 셀의 검출 (interneuron 유형에 따라 70-500 m ω 1 GΩ)에서 피 펫 저항과 ' 막 테스트 ' 창에 큰 용량 성 과도의 외관에 급격 한 변화를 기반으로 합니다.</li>
</ol>4. 2-광자 캘리포니아2 + 영상
<ol><li>흥분 성의 postsynaptic 응답에 관심이 있으면 추가 GABAA 수용 체 차단 gabazine (10 µ M) 및 GABAB 수용 체 차단 CGP55845 (2 µ M)에서 실제 목욕.</li>
	<li>앰프 제어 소프트웨어 모듈에 "CC" 버튼을 클릭 하 여 패치 구성을 전류 클램프로 설정 하 고 전류를 depolarizing의 체세포 주사에 대 한 응답에서 셀의 발사 패턴 기록 (0.8-1.0 나, 1 s). 지표에 패치 솔루션으로 채워질 셀에 대 한 적어도 30 분을 기다립니다. 참고: 셀의 발사 패턴 및 활성 속성 사용할 수 있습니다 셀의 하위;을 식별 하 예를 들어, 빠른 급상승 셀입니다. 표시기 농도 기록 (문제 해결 참조 표 2 ) 고양이를 시작 하기 전에 보급을 통해 안정화를 위해 중요 하다.</li>
	<li>AP 갖는 고양이<ol>
<li>이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 수집 시작 합니다. 빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다. 보이는 응답을 보장 하기 위해, AP 역전파의 효율성을 크게 GABAergic 수22거리 거부할 수 있습니다으로 먼저, 근 모 수석 (≤ 50 µ m)를 선택 합니다.</li>
		<li>'직사각형 도구'를 사용 하 여 이미지 수집 소프트웨어에서, 대상된 지역에 확대 하 고 전환 하는 "xt" (라인) 모드. 관심의 수지상 지점에 걸쳐 스캔 위치입니다. 수집 소프트웨어에서 레이저 강도 컨트롤러 2 광자 레이저 phototoxicity을 피하기 위해, 단지 약간 표시 기준 녹색 형광이는 최소한의 전력 레벨에서 설정 합니다.</li>
		<li>전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어 '프로토콜' 창 및 이미지 수집 소프트웨어, 원하는 진폭의 체세포 현재 분사를 포함 하는 원하는 기간의 기록 재판을 만듭니다.<ol>
<li>이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 "시작 기록" 버튼을 클릭 하 고 3-10 회 지속적으로 1-2 미 반복을 위한 형광 이미지 수집을 취득. 단일 검색을 피하기 위해 photodamage 사이 대기 적어도 30 s. 모 수석 따라 여러 지점에서 linescans를 취득 하는 경우 순서 효과 피하기 위해 임의의 순서로 그들을 데리고.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synaptically 갖는 고양이<ol>
<li>빨간 형광 신호를 사용 하 여 관심사의 모 수석을 찾습니다.</li>
		<li>관심 있는 모 수석 위에 조각의 표면에 자극 피 펫을 설정 합니다. 천천히 낮은 자극 피 펫에 운동을 방해 하는 전체 셀 구성 하지 않으려면를 최소화. 위치는 모 수석에서 10-15 µ m에 피 펫입니다.</li>
		<li>Aspiny 모 수석에서 시 냅 스 microdomains의 위치를 시각화 하려면 이미지 수집 소프트웨어에서 전환 하는 'xt' (라인) 모드와 관심의 수지상 지점 따라 라인 위치.</li>
		<li>(의 전기 생리학 데이터 수집 소프트웨어) '프로토콜' 창에 이미지 수집 소프트웨어, 시험 시작 후 자극 단위는 기록 재판을 만듭니다.</li>
		<li>수집 소프트웨어를 사용 하 여 버튼을 클릭 "시작 기록"를 3-5 번, 1-2 미 반복 수집을 위한 지속적으로 모 수석에 따라 스캔 30 대기 photodamage를 방지 하기 위해 검사 사이 s. 참고: 스캔 길이 갖는 이벤트의 속도 따라 조정 될 수 있다 하지만 photodamage 방지를 최소화 해야 합니다 (문제 해결 참조 표 2 ).</li>
		<li>해결 되 고 특정 질문에 따라 다른 조건 (예를 들면, 자극의 다른 강도/길이, 약리 차단, 등의 도입)에 4.5.5 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>셀 건강 악화의 흔적을 보여줍니다 때 인수를 중지:-45 아래 도발은 mV, 기준선 Ca2 + 레벨, 모 수석 (예를 들어, blebbing, 조각화; 보십시오 표 2 의 형태학 저하의에서 증가 대 한 문제 해결).</li>
		<li>셀의 형태에 예비 정보를 자극 피 펫의 위치 기록을 유지, Z-스택 빨강 채널에 셀의 취득. 수집 소프트웨어를 사용 하 여 'xyz' 모드, 포함 하는 모든 프로세스와 전체 셀을 이미지를 상단 및 낮은 스택 제한을 설정. 1 µ m에서 '스텝 크기'를 설정 하 고 "시작 기록" 버튼을 사용 하 여 스택 수집 시작.</li>
		<li>때 Z-스택 인수 완료, 소프트웨어에서 "최대 투영" 옵션을 사용 하 여 스택의 모든 초점 계획을 입력 해 수집의 품질을 확인 하. 그런 다음, 천천히 조각에서 패치 피펫으로 철회.</li>
		<li>특별 게시 형태 식별에 대 한 슬라이스를 해결 하려면 신속 하 게 무광택 페인트 브러시를 사용 하 여 목욕에서 슬라이스를 제거 하 고 실제 가득 페 트리 접시에 두 개의 필터 논문 사이 장소. 4 %paraformaldehyde (PFA) 솔루션으로는 실제를 대체 하 고 밤새 4 ° C 방 또는 냉장고에 있는 요리를 두고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunohistochemistry 포스트 Hoc 기록 된 셀의 형태학 식별
참고: 고정 PFA에서의 1 박 후 조각을 저장할 수 있습니다 나트륨 아 지 드 (0.5%)와 인산 버퍼 (PB)에 최대 1 개월.
<ol><li>Tris 버퍼 염 분 솔루션 (TBS) 트라이 톤 X-100 (0.3%)에 슬라이스를 넣고 4 세척 (5-10 분 마다) 수행.</li>
	<li>TBS-트리톤에는 슬라이스를 넣어 1 시간에 대 한 10% 정상 염소 혈 청 (NGS) 0.3%.</li>
	<li>TBS-트리톤 0.3%는 슬라이스를 넣어 1 %NGS는 Streptavidin 활용 fluorophore (예를 들어, 알 렉 사 Fluor 546 활용 Streptavidin 1: 200)에 대 한 하룻밤 부 화.</li>
	<li>씻어 4 번 (5-10 분) tbs.</li>
	<li>현미경 슬라이드와 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지에 분할 영역을 탑재 합니다. 완전 한 세포 재건 하려면, Z취득-스택 (단계 크기: 1 µ m) 20 x 목표를 사용 하 여. 알 렉 사-546-활용 된 레이블 이미징, 543 nm 레이저와 515-560 nm 검색 필터를 사용 하 여 설정 합니다.</li>
</ol>6입니다. 고양이의 분석
<ol><li>빨간색과 녹색 채널에서 라인 이미지에 관심 (ROIs) 영역에서 형광 값을 추출 하 고 소음을 줄이기 위해 각 조건에 대해 여러 개의 반복의 값을 평균. 참고: 라인 인수는 모 수석에 따라 수행 될 때 그것은 수지상 microdomains (2-5 µ m)에 해당 하는 수 있습니다, 여러 ROIs에서 데이터를 추출 하 고 따라서 Ca2 + 신호 구획의 연구를 수 있도록.</li>
	<li>각 투자 수익에 대 한 캘리포니아2 + 진폭으로 변화를 표현. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> 참고: 여기 G는 녹색 채널;에서 형광 값 G0 은 녹색 채널에서 기준선 형광 값 사전 자극 기간; R은 빨강 채널18에서 형광 값입니다. 와 2 광자 여기 매우 지역화 된 중요 한 배경 생성 하지 않습니다, 배경 형광의 빼기 필요 하지 않습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+semi-automated+strategy+to+develop+multi-compartment+models+that+predict+biophysical+properties+of+interneuron-specific+3+(IS3)+cells+in+hippocampus.">Using a semi-automated strategy to develop multi-compartment models that predict biophysical properties of interneuron-specific 3 (IS3) cells in hippocampus.</a> eNeuro. 3, 1-26 (2016).</li><li>Evstratova, A., Chamberland, S., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+and+activity-dependent+dynamics+of+action+potential-evoked+Ca2++signals+in+dendrites+of+hippocampal+inhibitory+interneurons.">Cell type-specific and activity-dependent dynamics of action potential-evoked Ca2+ signals in dendrites of hippocampal inhibitory interneurons.</a> J Physiol. 589, 1957-1977 (2011).</li><li>Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+mechanisms+and+long-term+potentiation+in+cortical+inhibitory+interneurons.">Dendritic calcium mechanisms and long-term potentiation in cortical inhibitory interneurons.</a> Eur J Neurosci. 35, 496-506 (2012).</li><li>Camir&#233;, O., Lacaille, J. C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+studies+in+the+facial+nucleus+illustrating+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+motoneurons+in+adult+rat+brain+slices.">Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices.</a> Synapse. 3, 331-338 (1989).</li><li>Pettit, D. L., Wang, S. S., Gee, K. R., Augustine, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+two-photon+uncaging:+anovel+approach+to+mapping+glutamate+receptors.">Chemical two-photon uncaging: anovel approach to mapping glutamate receptors.</a> Neuron. 19, 465-471 (1997).</li><li>Salom&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+random-access+scanning+in+two-photon+microscopy+usingacousto-optic+deflectors.">Ultrafast random-access scanning in two-photon microscopy usingacousto-optic deflectors.</a> J Neurosci Methods. 154, 161-174 (2006).</li><li>Lechleiter, J. D., Lin, D. T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

저자는 아무 경쟁 금융 관심사 또는 다른 충돌 있다.

여기에 나와 있는 메서드는 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 신호 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 및 패치 클램프 전기 생리학의 결합을 사용 하는 방법을 보여 줍니다. 이 메서드는 두는 로컬 Ca2 + 고도 전기 자극 또는 backpropagating AP 수지상 세그먼트, 및 세포의 체세포 응답에 의해 evoked의 모니터링에 대 한 수 있습니다. 이렇게 하면 수지상 나무의 ?...

뉴런 네트워크 활동의 기여는 주로 수신 시 냅 시스 입력의 동적 특성에 의해 결정 됩니다. 전통적으로, 신경 세포에 시 냅 스 활동을 특성화의 주된 방법 postsynaptic 전류 통로의 축 삭의 전기 자극에 의해 evoked의 체세포 전체 셀 패치 클램프 기록에 의존. 그러나,이 경우1사실 proximally 있는 시 냅 스의 유일한 활동 보고 됩니다. 또한, 시 냅 스 특정 메커니즘을 평가, 녹음 및 특정 위치에 모 수석 신경의 쌍에서 각각의 시 냅 스 및 수지상 통합의 메커니즘을 대상으로 사용 되었습니다. 시 냅 스 생리학의 분야에서 중요 한 돌파구는 광학 및 electrophysiological 기법의 결혼을 통해 달성 되었다. 2 광자 여기 레이저 스캐닝 현미경 검사 법 (2PLSM) Ca2 + 이미징 및 optogenetic 도구와 함께 뇌 조각 에서에서 특정 신경 연결에 시 냅 시스 활동의 동적 조직의 엄청난 정보를 계시 할 수 있다 체 외 그리고 vivo에서.
몇 가지 주요 장점 만든 2PLSM 기존의 한 광자 여기 현미경2에서 밖으로 서: (1)의 2 광자 여기 비선형 특성상 형광 초점 볼륨에만 생성 되 고 모든 내보낸된 광자 대표 유용한 신호 (pinhole에 대 한 필요는 없음); (2) 긴 파장, 2PLSM, 사용 침투 분산 조직을 보다 효율적으로; 또한, 흩어져 광자는 2 광자 여기 및 배경 형광; 너무 희석 (3) photodamage 및 phototoxicity 초점 평면으로 제한 됩니다. 따라서, 기존의 confocal 현미경에 비해 2 광자 시스템의 높은 비용에도 불구 하 고는 2PLSM 신경 구조와 기능 두꺼운 살아있는 조직에서의 고해상도 조사 방법의 선택에 남아 있다.
분산 조직에서 2PLSM의 첫 번째 응용 프로그램 구조와 기능 수지상 쪽이3의 이미지를 했다. 캘리포니아2 + 이미지와 함께에서 2PLSM 고립 된 생 화 확 적인 격실으로 그 쪽이 기능을 공개 했다. 두 광자 캘리포니아2 + 곧 이미징 되었다 유용한 도구 그대로 조직5, 개별 시 냅 스의 활동을 보고 많은 신경 종류에 등뼈와 개별 시 냅 스4사이의 일대일 대응 관계입니다, 6,,78. 또한, 2PLSM 기반 Ca2 + 이미징 성공적으로 사용한 단일 칼슘 채널 및 기본 및 시 냅 스 conductances 사이 비선형 상호 작용의 활동을 모니터링 하로 평가 하는 상태 및 활동 의존 하 규칙의 캘리포니아2 + 신경 dendrites5,6,7,8,9,,1011에 신호.
칼슘은 유비 쿼터 스 세포내 두번째 메신저, 그리고 그것의 subcellular spatiotemporal 조직 이온의 레 귤 레이 션을 시 냅 스 강도에 따른 생리 적 반응의 방향을 결정 합니다 채널, 모 수석 등뼈 성장으로 뿐만 아니라 세포 죽음 및 생존 수지상 캘리포니아2 + 고도 여러 통로의 활성화를 통해 발생합니다. 활동 전위 (APs), 모 수석에 backpropagating 전압 개폐 칼슘 채널12 열고 dendrites와 쪽이13에 상대적으로 글로벌 캘리포니아2 + 과도 (고양이)를 생성 합니다. 시 냅 스 전송 postsynaptic 캘리포니아2 +의 활성화와 관련 된-투과 수용 체 (NMDA, 캘리포니아2 +-침투성 AMPA와 kainate),6,,1415고양이 시 냅 스 트리거링. 마지막으로, 특정 조건11,12,,1316에서 모 수석에 supralinear Ca2 + 이벤트를 생성할 수 있습니다.
두 광자 캘리포니아2 + 영상 패치 클램프 electrophysiological 녹음와 함께에서 사용 하 여 합성 캘리포니아2 +-전체 셀 녹음 중 패치 전극을 통해 일반적으로 배달 민감한 형광 표시기 . 캘리포니아2 + 역학의 정량화에 대 한 표준 방법 듀얼 표시기 방법17,18을 기반으로 합니다. 두 fluorophores 잘 분리 된 방출 스펙트럼을 사용 하 여 (예를 들어, 빨간색 캘리포니아2 +의 조합-녹색 Ca2 + 지표, 오 레 곤 그린 BAPTA-1 또는 Fluo-4 등을 구분 하지 않는 염료)에 비해 몇 가지 장점이 고는 단일 표시 방법입니다. 첫째, 캘리포니아2 +-구분 염료는 캘리포니아2 + 이미징 수행할 수 관심 (수지상 지점과 쪽이)의 작은 구조를 찾는 데 사용 됩니다. 둘째, 녹색과 적색 형광 (ΔG/R)에 있는 변화 사이 비율 측정 [캘리포니아2 +], [캘리포니아2 +]017 에서 변동으로 인해 초기 형광의 변화에 크게 민감한은으로 계산 됩니다. , 18. 또한, 형광 변경 절대 캘리포니아2 + 농도19의 점에서 측정 될 수 있다.
급성 조각에서 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 실험을 실행 하는 때 일반적인 관심사 셀 건강 및 일반적으로 사용 하는 높은 레이저 전원 인해 이미지 수집의 안정성 이다. 또한, 캘리포니아2 + 이미징 실험, 거기에서는 섭 동 및 subcellular 캘리포니아2 + 역학의 실질적인 과대평가 대 한 우려 사실은 캘리포니아2 + 지표 역할 높은 모바일 exogenous 캘리포니아2 + 완충기입니다. 따라서, 실험 질문 및 신경 유형, 고양이의 예상된 진폭에 따라 Ca2 + 표시기와 그것의 농도의 선택 합니다.
우리는 캘리포니아2 + 변동 GABAergic 수9,,1011,,2021 의 dendrites의 조사를 위해 2 광자 캘리포니아2 + 이미징 방법 적응 , 22. 초기 캘리포니아2 + 이미징 연구의 대량 주 신경에서 수행 했다, 금지 수 피라미드 세포20 에 그 고유 기능 캘리포니아2 + 메커니즘의 큰 다양 한 쇼케이스 , 23 , 24. 이러한 interneuron 관련 메커니즘 (예:, 캘리포니아2 + 침투성 AMPA 수용 체) 세포 활동을 조절에 특정 역할을 재생할 수 있습니다. 수지상 캘리포니아2 + 수에서 신호는 추가 조사에 대 한 유혹 대상, 하는 동안 2 광자 캘리포니아2 + 모 수석 세포 이미징 과제가 추가, 모 수석의 더 얇은 직경을 등뼈의 부족에서 특히 높은 생 캘리포니아2 + 바인딩 용량. 우리의 연구 관심 hippocampal 수의 연구에 초점, 다음 프로토콜 다른 신경 인구에 적용 하는 동안 했다 그 문제를 다루는 적응.
이 프로토콜은 상업 confocal 2 광자 현미경, 2 개의 외부, descanned 비 감지기 (NDDs), 전기 광학 변조기 (엄), 및 Dodt 그라데이션 대비 (SGC), 스캔 광학 테이블에 설치는 처형 되었다. 현미경 모드 잠겨 800 Ti:Sapphire multiphoton 레이저와 결합 되었다 (> 3 W, 140 fs 펄스, 80 Hz 반복 속도) nm. 이미징 시스템 온도 제어, 2 개의 micromanipulators와 번역 플랫폼, 컴퓨터 제어 microelectrode 앰프, 디지타이저,는 자극 관류 챔버를 포함 하 여 표준 전기 생리학 장비를 장착 했다 단위, 및 데이터 수집 소프트웨어

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

칼슘 (캘리포니아2 +) 이미징 신경 모 수석에 세포내 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 역학 조사 하는 강력한 도구입니다. 캘리포니아2 + 변동 막과 세포내 메커니즘의 다양 한 통해 발생 하 고 시 냅 스가 소성의 유도 및 수지상 흥분의 규칙에 중요 한 역할을 담당할 수 있습니다. 따라서, 수지상 지점에서 서로 다른 유형의 Ca2 + 신호를 기록 하는 기능 모 수석 정보를 통합 하는 방법을 공부 하는 그룹에 대 한 가치가 있다. 두 광자 현미경의 출현이 했다 이러한 연구를 훨씬 쉽게 이미징 산란 등 photodamage 살아있는 조직에 내재 된 문제를 해결 하 여. 또한, 기존의 electrophysiological 기법 2 광자 캘리포니아2 + 이미지의 조합를 통해 수는 로컬 Ca2 + 변동에 녹음과 동시에 신경 모 수석에서 시 냅 스 활동의 조사 소마입니다. 여기, 우리가 GABAergic 금지 수의 dendrites에이 메서드를 사용 하 여 로컬 Ca2 + 과도 (고양이)의 역학을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 공부 수지상 캘리포니아2 + 급성 뇌 조각에서 신경 종류에 신호에 적용할 수 있습니다.

여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 고양이 체세포 현재 분사와 해 마의 CA1 영역에서 oriens/alveus 수의 모 수석에 전기 자극을 갖는 얻은. 여러 점에서 근 모 수석에 걸쳐 linescans 획득 후에 그것의 모양 및 위치에 따라 식별 신경, 패치, 소마 (그림 1A)에서 거리에 주어진. 우리 고양이 소마 증가 (감소 AP 진폭 또는 칼슘 채널 유통, <strong class="xfig"...

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Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K 조회수.  Université Laval. 우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

비디오: Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

연구

신경과학

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

두 광자 레이저와 Zebrafish 애벌레의 칼슘 이미징 및 행동 녹화를 사용 하 여 평가 사용 하 여 신경 인구의 제거

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...