이 방법은 세포외 매트릭스가 심장의 다른 생리적 및 발달 단계 동안 가지고있는 영향에 대한 심혈관 분야에서 중요한 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 유형의 조직에 유사한 탈세포화 방법을 적용하여 태아와 성인 세포 외 세포 행렬 사이의 비교 분석을 허용한다는 것입니다. 그래서 이 방법은 다른 맥락에서 세포외 매트릭스의 연구를 촉진하는 암 환자에서 외과 절제술과 같은 그밖 기관에 성공적으로 적용되었습니다.
먼저 얼음이 차가운 PBS로 태아와 성인 마우스 하트를 잠시 헹구십시오. 그런 다음 조직을 해부 현미경 아래에 놓고 직선 작은 가위를 사용하여 심실, 성인 마우스 하트에서 아리아, 오른쪽 심실 및 셉타를 제거합니다. 왼쪽 심실을 새로운 페트리 접시로 옮기고 왼쪽 심실 없는 벽을 2mm 두께의 세로 스트립으로 나눕니다.
상종 마우스 왼쪽 심실의 사용은 일관된 탈세포화 효율에 필수적입니다. 메스와 톱니 모양의 핀셋을 사용하여 구체 근육을 제거한 후 2mm 그리드를 사용하여 스트립을 더 작은 조직 조각으로 더 잘라낸다. 모든 조직이 다진 경우, 간략하게 이절을 커버하기에 충분한 PBS로 조각을 헹구는 다.
그리고 태아 심장과 성인 심장 조직의 조각을 튜브 당 최적의 절삭 온도 또는 OCT 화합물 250 마이크로 리터를 포함하는 개별 1.5 밀리리터 미세 센심 분리 튜브로 옮킨다. 그런 다음, 냉각 된 드라이 아이스에서 심장 조직 샘플을 동결하면 음의 섭씨 80도에서 보관할 수 있습니다. 냉동 보존 조직을 탈세포화하기 위해 냉동 샘플을 페트리 접시에 놓고 충분한 PBS가 함유되어 이 기간을 완전히 덮습니다.
OCT가 녹은 후, PBS의 새로운 페트리 접시에 샘플을 담그고 세척 당 60 RPM에서 10 ~ 15 분 동안 셰이커에 샘플을 세 번 세척하십시오. 마지막 세척 후, 멸균 24 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 작동 저혈압 버퍼의 1 밀리리터를 추가하고 각 우물에 하나의 조각을 전송하는 미세 한 집게를 사용합니다. 18시간 동안 섭씨 25도에서 플레이트를 배양하고, 165 RPM에서 플레이트를 165RPM에서 배양한 다음, 세차당 PBS 1밀리리터로 1밀리리터로 3시간 세척합니다.
마지막 세척 후, 25섭씨24시간 배양시 신선하게 준비된 도데실 황산나트륨 또는 SDS 용액 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 다음 날, 세척당 저혈압 세척 버퍼 1밀리리터에 3개의 20분 세척으로 샘플을 헹구고 37°C의 배양시 각 웰에 DNase 처리 용액 1밀리리터를 첨가합니다. 잠복이 끝나면 셀룰러 화된 샘플은 젤라틴과 같은 일관성을 잃어야 합니다.
그런 다음 세차당 PBS 1밀리리터로 조직 조각을 세 번 씻은 다음 실온과 60 RPM에서 1 밀리리터의 신선한 PBS로 하룻밤 세척합니다. 탈세포 조직에서 세포 잔해의 제거를 평가하기 위해, 다음 날 아침 은 실온에서 2.5 ~ 3 시간 동안 잘 당 0.03 %의 수성 에신으로 보충 된 신선하게 준비 된 10 %의 수제 중성 버퍼의 1 밀리리터로 샘플을 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 샘플을 PBS 의 1 밀리리터로 잘 세척하십시오.
그리고 일회용 비닐 시편 몰드를 사용하여 제조업체의 사양에 따라 조직학 처리 젤에서 탈세포화된 조각을 캡슐화합니다. 다음으로 캡슐화된 조각을 생검 처리 카세트로 옮기. 그리고 에탄올, 이소파라피닉 알리파틱 탄화수소 용액 및 섭씨 56도의 상승 농도에서 연속적으로 30분 배양을 통해 파라핀을 포함시키는 파라핀 샘플을 처리한다.
두 번째 파라핀이 나타난 후, 파라핀 블록에 샘플을 장착하고 마이크로토메를 사용하여 3마이크로미터 두께의 단면을 얻습니다. 그런 다음 표준 프로토콜에 따라 haematoxylin 및 eosin 및 Masson의 삼색 얼룩으로 섹션을 염색하여 탈세포화 효율을 확인합니다. 하룻밤 PBS가 흔들리는 후, 새로 준비된 DPBS 500 마이크로리터를 첨가하고, 각 비계에 암포테리신 B 1%의 항생제 용액의 밀리리터 당 2.5 마이크로그램을 첨가합니다.
그리고 샘플을 섭씨 4도에서 1~7일 동안 보관하십시오. 세포를 앉기 전에, DPBS 용액을 항생제로 보충된 세포 기저 배지500 마이크로리터로 대체하십시오. 그리고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 비계를 배양하십시오.
인큐베이션의 끝에서 현미경을 사용하여 스캐폴드 당 96웰 플레이트의 한 우물의 중앙에 DPBS의 4개의 마이크로리터 드롭을 추가합니다. 얇은 직선 핀셋을 사용하여 탈세포 비계 1개를 각 낙하의 상단으로 옮기습니다. 포부로 추가 DPBS를 제거하고 스캐폴드가 접히거나 구겨지지 않은지 확인합니다.
스캐폴드가 가장자리에서 건조되면 각 스캐폴드 의 상단에 관심 있는 셀의 단일 셀 현탁액을 천천히 앉히게 합니다. 배아일 18탈세포조직은 고반투명 구조가 특징이며, 성인 이질은 백색 외관에 반투명을 나타낸다. 헤마톡시린과 에오신과 마슨의 트리홈 얼룩은 존재 다공성 메쉬에 의해 효율적인 세포 제거를 확인합니다.
핵 물질은 탈세포화 후 약 99.8%까지 감소하며, 이식 시 원치 않는 염증 반응을 유발하는 것을 피하는 데 필수적인 비조작 조직과 비교됩니다. 앉아있는 비계 내의 세포 생존능력은 칼신 염색에 의해 체외 내 배양 중에 모니터링될 수 있다. 스캐폴드에 걸친 세포 재인구 및 분포의 말단 분석은 중앙 바이오스캐폴드 섹션의 대표적인 이미지에서 관찰된 바와 같이 파라핀 처리 후에도 수행될 수 있다.
그래서이 기술은 태아와 성인 마우스 심혼 뿐 아니라 그밖 조직의 세포외 매트릭스의 생리활성 속성의 탐구에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
