Cette méthode peut aider à répondre à des questions importantes dans le domaine cardiovasculaire sur l’impact de la matrice extracellulaire a au cours des différentes étapes physiologiques et développementales du cœur. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une analyse comparative entre les matrices extracellulaires fœtales et adultes en appliquant une méthode de décellularisation similaire aux deux types de tissus. Ainsi, cette méthode ont été appliquées avec succès à d’autres organes tels que les résections chirurgicales des patients atteints de cancer facilitant l’étude de la matrice extracellulaire dans différents contextes.
Commencez par rincer brièvement les cœurs de souris fœtales et adultes avec du PBS glacé. Ensuite, placez les tissus sous un microscope disséquant et utilisez de petits ciseaux droits pour enlever les oreillettes, le ventricule droit et la septa des cœurs adultes de la souris. Transférer le ventricule gauche dans une nouvelle boîte de Petri et diviser le mur libre du ventricule gauche en deux bandes longitudinales d’épaisseur millimétrique.
L’utilisation des explantations gauches adultes de ventricule de souris d’une taille homogène est essentielle pour une efficacité cohérente de décellularisation. Utilisez le scalpel et les pinces dentelées avec pointe incurvée pour enlever le muscle papillaire avant d’utiliser une grille de deux par deux millimètres pour hacher davantage les bandes en petits fragments de tissu. Lorsque tout le tissu a été haché, rincer brièvement les morceaux avec suffisamment de PBS pour couvrir les explants.
Et transférer les cœurs fœtaux et les morceaux de tissu cardiaque adulte dans des tubes individuels de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 250 microlitres de température de coupe optimale ou composé OCT par tube. Ensuite, congelez les échantillons de tissus cardiaques dans de l’isopentane refroidi par la glace sèche pour le stockage à 80 degrés Celsius négatifs. Pour décellulariser les tissus cryo-conservés placer les échantillons congelés dans une boîte de Pétri contenant suffisamment de PBS pour couvrir complètement les explants.
Après la fonte de l’OCT, submerger les échantillons dans une nouvelle boîte de Pétri de PBS et laver les échantillons trois fois sur un shaker pendant 10 à 15 minutes à 60 RPM par lavage. Après le dernier lavage, ajouter un millilitre de tampon hypotonique de travail à chaque puits d’une plaque stérile de culture tissulaire de 24 puits et utiliser des forceps fins pour transférer un fragment à chaque puits. Incuber la plaque à 25 degrés Celsius pendant 18 heures, à 165 rPM suivie de trois lavages d’une heure dans un millilitre de PBS par puits, par lavage.
Après le dernier lavage, ajouter un millilitre de sulfate de dodecyl de sodium fraîchement préparé ou une solution SDS à chaque puits pour une incubation de 24 heures à 25 degrés Celsius. Le lendemain, rincez les échantillons avec trois lavages de 20 minutes dans un millilitre de tampon de lavage hypotonique par lavage suivi de l’ajout d’un millilitre de solution de traitement DNase à chaque puits pour une incubation de trois heures, à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, les échantillons décellulaires devraient perdre leur consistance gélatineuse.
Lavez ensuite les fragments de tissu trois fois avec un millilitre de PBS pendant 20 minutes par lavage suivi d’un lavage de nuit dans un millilitre de PBS frais par puits à température ambiante et de 60 RPM. Pour évaluer l’enlèvement des restes cellulaires du tissu décellulaire, le lendemain matin fixer les échantillons en un millilitre de tampon neutre fraîchement préparé de formule 10%complété par 0,03% d’éosine aqueuse par puits pendant 2,5 à trois heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les échantillons en un millilitre de PBS par puits.
Et utilisez un moule de spécimen de vinyle jetable pour encapsuler les fragments décellularisés dans le gel de traitement d’histologie selon les spécifications du fabricant. Ensuite, transférez les fragments encapsulés dans une cassette d’intégration de traitement de biopsie. Et traiter les échantillons de paraffine intégrant à travers des incubations successives de 30 minutes dans des concentrations ascendantes d’éthanol, isoparaffinique solution d’hydrocarbures aliphatiques et deux 56 degrés Celsius paraffine émerge.
Après la deuxième paraffine émergente, monter des échantillons dans un bloc de paraffine et utiliser un microtome pour obtenir trois micromètres d’épaisseur sections. Vérifiez ensuite l’efficacité de la décellularisation en souinant les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine et les taches trichromes de Masson selon les protocoles standard. Après le lavage de PBS de nuit avec la secousse, ajoutez 500 microlitres de DPBS fraîchement préparé, complété avec 2.5 microgrammes par millilitre de solution antibiotique d’amphotericine B 1% à chaque échafaudage.
Et stockez les échantillons pendant un à sept jours à quatre degrés Celsius. Avant d’asseoir les cellules, remplacer la solution DPBS par 500 microlitres de milieu basal cellulaire complétés par des antibiotiques. Et incuber les échafaudages pendant une heure à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, utiliser un microscope pour ajouter une goutte de quatre microlitres de DPBS au centre d’un puits d’une plaque de 96 puits par échafaudage. Et utilisez de fines pinces droites pour transférer un échafaudage décellulaire vers le haut de chaque goutte. Retirez tout DPBS supplémentaire par aspiration et confirmez que l’échafaud n’est pas plié ou froissé.
Lorsque les échafaudages ont séché sur les bords, placez lentement une seule suspension cellulaire des cellules d’intérêt sur le dessus de chaque échafaudage. Le jour embryonnaire 18 tissus décellulaires sont caractérisés par une structure fortement translucide tandis que les explants adultes présentent un aspect translucide à blanc. L’hématoxyline et l’éosine et les taches de trichome de Masson confirment une élimination efficace de cellules par le maillage poreux de présence.
La matière nucléaire est réduite d’environ 99,8% après la décellularisation, par rapport aux tissus non manipulés qui est essentiel pour éviter de déclencher une réponse inflammatoire non désirée lors de l’implantation. La viabilité cellulaire dans les échafaudages assis peut être surveillée pendant la culture in vitro par coloration de calcéine. L’analyse terminale du repeuplement et de la distribution cellulaires entre les échafaudages peut également être effectuée après le traitement de la paraffine, comme l’observent ces images représentatives d’une section centrale de biocaffold.
Cette technique a donc ouvert la voie aux chercheurs dans l’exploration des propriétés bioactives de la matrice extracellulaire à partir de cœurs de souris fœtales et adultes, mais aussi d’autres tissus.
