Bu yöntem, kalbin farklı fizyolojik ve gelişimsel aşamalarında hücre dışı matriksin etkisi hakkında kardiyovasküler alandaki önemli soruların ele alınmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, her iki doku tipine de benzer bir hücre dışılaştırma yöntemi uygulayarak fetal ve erişkin hücre dışı matrisler arasında karşılaştırmalı bir analize olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, kanser hastalarının cerrahi rezeksiyonları gibi diğer organlara da uygulandı ve hücre dışı matrisin farklı bağlamlarda incelenmesini kolaylaştırdı.
Cenin ve yetişkin fare kalplerini buz gibi PBS ile kısa bir süre durulayarak başlayın. Sonra bir diseksiyon mikroskop altında dokuları yerleştirin ve yetişkin fare kalplerinden atria, sağ ventrikül ve septa kaldırmak için düz küçük makas kullanın. Sol ventrikülü yeni bir Petri kabına aktarın ve sol ventrikülsüz duvarı iki milimetre kalınlığında uzunlamasına şeritlere bölün.
Homojen boyutta yetişkin fare sol ventrikül explants kullanımı tutarlı bir decellularization verimlilik için gereklidir. Daha küçük doku parçaları içine şeritler kıyma için iki tarafından iki milimetre ızgara kullanmadan önce papiller kas kaldırmak için kavisli ucu ile neşter ve tırtıklı cımbız kullanın. Tüm doku doğrlandığında, kısaca ekspertiyi kapsayacak kadar PBS ile parçaları durulayın.
Ve fetal kalpleri ve yetişkin kalp dokusu parçalarını, tüp başına 250 mikrolitre optimum kesme sıcaklığı veya OCT bileşiği içeren tek tek 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere aktarın. Daha sonra, negatif 80 santigrat derece depolama için kuru buz soğutulmuş isopentane kardiyak doku örnekleri dondurun. Kriyo-korunmuş dokular hücreyi decellularize etmek için tamamen ekspertize etmek için yeterli PBS içeren bir Petri kabına dondurulmuş örnekleri yerleştirin.
OCT eridikten sonra, numuneleri pbs'in yeni bir Petri kabına batırın ve numuneleri yıkama başına 60 RPM'de 10 ila 15 dakika çalkalayıcıüzerinde üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, steril 24 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyuya bir mililitre çalışan hipotonik tampon ekleyin ve her kuyuya bir parça aktarmak için ince çalgılar kullanın. Plakayı 18 saat boyunca 25 derecede, 165 RPM'de ve ardından yıkama başına bir mililitre PBS'de bir saatlik yıkama yla inkübe edin.
Son yıkamadan sonra, 25 santigrat derecede 24 saatlik kuluçka için her kuyuya bir mililitre taze hazırlanmış sodyum dodecyl sülfat veya SDS çözeltisi ekleyin. Ertesi gün, üç saatlik kuluçka için her kuyuya bir mililitre DNase tedavi çözeltisi eklenmesini takip eden bir mililitre hipotonik yıkama tamponu içinde üç adet 20 dakikalık yıkama ile numuneleri 37 santigrat derece ile durulayın. Kuluçka sonunda, hücreden arındırılmış örnekler jelatin benzeri tutarlılıklarını kaybetmelidir.
Daha sonra doku parçalarını bir mililitre PBS ile yıkama başına 20 dakika yıkayın ve ardından oda sıcaklığında ve 60 RPM'de bir mililitre taze PBS'de bir geceyıkama. Hücreli dokudan hücresel kalıntıların çıkarılmasını değerlendirmek için, ertesi sabah taze hazırlanmış bir mililitre örnekleri düzeltmek 10%formül nötr tampon oda sıcaklığında 2,5 ila üç saat boyunca iyi başına sulu eozin% 0.03 ile takviye. Kuluçka sonunda, iyi başına PBS bir mililitre örnekleri yıkayın.
Ve üreticinin özelliklerine göre histoloji işleme jel decellularized parçaları kapsüllemek için tek kullanımlık vinil örnek kalıp kullanın. Daha sonra, kapsüllenmiş parçaları biyopsi işleme katıştırma kasetine aktarın. Ve etanol, izoparafinik alifatik hidrokarbon çözeltisi ve iki 56 santigrat derece parafin ortaya çıkan artan konsantrasyonlarda art arda 30 dakikalık kuluçka yoluyla parafin gömme örnekleri işlemek.
İkinci parafin ortaya çıktıktan sonra, numuneleri bir parafin bloğuna monte edin ve üç mikrometre kalınlığında kesitler elde etmek için bir mikrotom kullanın. Daha sonra hematoksilin ve eozin ve Masson'un trikrom lekelerini standart protokollere göre boyandırarak hücre dışılaştırma verimliliğini doğrulayın. Sallayarak bir gecede PBS yıkayın sonra, taze hazırlanmış DPBS 500 mikrolitre ekleyin, her iskele için amphotericin B 1% antibiyotik çözeltimililitre başına 2.5 mikrogram ile desteklenmektedir.
Ve örnekleri 1-7 gün boyunca dört santigrat derecede saklayın. Hücreleri oturmadan önce, antibiyotiklerle birlikte 500 mikrolitre hücre bazal orta ile DPBS çözeltisini değiştirin. Ve iskeleleri 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, iskele başına 96 kuyuluk bir kuyunun ortasına dört mikrolitrelik DPBS damlası eklemek için bir mikroskop kullanın. Ve her damla üstüne bir hücresiz iskele aktarmak için ince düz cımbız kullanın. Aspirasyon la herhangi bir ekstra DPBS çıkarın ve iskele katlanmış veya kırışık olmadığını onaylayın.
İskeleler kenarlarında kuruduktan sonra, her iskelenin üstüne ilgi çeken hücrelerin tek bir hücre süspansiyonuna yavaşça oturun. Embriyonik gün 18 hücreli dokular yüksek yarı saydam bir yapı ile karakterize iken yetişkin ekstatlar beyaz görünüm enine bir yarı saydam sergilerler. Hematoksilin ve eozin ve Masson's trichome lekeleri varlığı gözenekli mesh tarafından etkili bir hücre kaldırma onaylamak.
Nükleer madde, hücreleşmeden sonra yaklaşık %99.8 oranında azalır, implantasyon üzerine istenmeyen inflamatuar yanıtı tetiklemekten kaçınmak için gerekli olan manipüle edilmemiş dokulara göre. Oturan iskeleler içinde hücre canlılığı kalsedin boyama ile in-vitro kültür sırasında izlenebilir. Hücre popülasyonunun ve iskeleler arasında dağılımının terminal analizi, merkezi bir biyoiskele bölümünün bu temsili görüntülerinde görüldüğü gibi parafin işleme sonrasında da yapılabilir.
Bu teknik, fetal ve yetişkin fare kalplerinden hücre dışı matrisin biyoaktif özelliklerinin araştırılmasında araştırmacıların yanı, aynı zamanda diğer dokuların da önünü açtı.
