Agradecemos a Michael Rosbash por su asesoría y apoyo durante la fase inicial del desarrollo de este método. Este trabajo fue financiado por el PRESTO JST programa, la Fundación Nacional Suiza de ciencia (31003A_149893 y 31003A_169548), el Consejo Europeo de investigación (ERC-StG-311194), Fundación Novartis para la investigación biomédica médica (13A39) y la Universidad de Ginebra .

1. preparación de soluciones Stock bajo una campana de cultura
<ol><li>Preparar 400 mL de 1 x medio activo Schneider (SAM) optimizado para cultivo ex vivo de cerebros larvales (modificado de referencia24,25) (tabla 1). Alícuota de 5 mL y flash congelar en nitrógeno líquido (LN2), tienda a - 80 ° C.</li>
	<li>Preparar 1 x disecante solución salina (DSS) por dilución 10 x solución (modificado de referencia26) (tabla 2).</li>
	<li>Fibrinógeno alícuota de 10 mg y almacenar a 4 ° C para un solo uso. PRECAUCIÓN: Pesar fibrinógeno bajo cabina de flujo laminar, con guantes, ya que es perjudicial.</li>
	<li>Preparar la solución stock de trombina en SAM (NIH 1500 unidad/mg) y alícuotas de 10 μl, flash freeze en LN2 y mantener a-80 ° C. PRECAUCIÓN: Lleve guantes al manipular la trombina ya que es perjudicial.</li>
	<li>Alícuota de solución madre de 100 x penicilina-estreptomicina. Mantener a-20 ° C.</li>
	<li>Corta círculos de membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) (véase tabla de materiales) al tamaño que se ajusta dentro de un plato de fondo de cristal. Enjuague en el 70% EtOH y luego esterilizado dH2O. esterilizar y secar bajo cabina de flujo laminar con UV. Mantenga en una placa Petri estéril. Uso individual. Nota: El PTFE es una membrana flexible porosa que permite el intercambio de gases y evita que el medio de evaporación durante la grabación a largo plazo.</li>
</ol>2. configuración de microscopia Time-lapse
Nota: La siguiente configuración es para un microscopio confocal tándem escáner invertido (véase tabla de materiales) equipada con un escáner de resonancia (8.000 Hz). El sistema incluye un detector muy sensible Foto-multiplicador, que junto con el escáner de resonancia previene la fototoxicidad y photobleaching. Temperatura y humedad son controladas dentro de una cámara microscopio (véase Tabla de materiales) que cubre la mayor parte del microscopio.
<ol><li>Coloque una cámara de humedad de la etapa superior.</li>
	<li>Activar los controladores de temperatura y humedad para equilibrar la cámara microscopio a 25 ° C y 80% de humedad.</li>
	<li>Para realizar experimentos en la oscuridad constante (DD), cubre la cámara microscopio con un paño opaco (a menos que la cámara del microscopio está hecha de un material opaco).</li>
	<li>Si utiliza un objetivo de inmersión en agua, colocar un dispensador de Micro de inmersión de agua sobre el objetivo y programa un protocolo con el software de controlador de Autoimmersion objetivo para dispensar agua a un ritmo constante durante la proyección de imagen de Time-lapse. Nota: Se recomiendan objetivos de inmersión en agua junto con un dispensador de agua o seco objetivo para largo plazo en la proyección de imagen, como otro tipo de medio de inmersión se seque.</li>
	<li>Coloque el soporte de una placa de Petri en el escenario, dentro de la cámara de humedad.</li>
	<li>Inicie el software del microscopio y seleccione el modo de escáner resonante desde el primer cuadro de diálogo. Seleccione Aceptar para iniciar la etapa cuando se le solicite. Ir a ficha Configuración y a la configuración de Hardware para conectar las líneas de láser pertinentes.</li>
	<li>Ir a ficha de adquisición y al panel XY para seleccionar modo bidireccional y conjunto imagen parámetros de adquisición. Nota: La descrita imagen Configuración presentada aquí (figura 2, figura 3 y 1 película) está optimizada para observar la expresión circadiana de reporteros fluorescentes específicos. Los siguientes parámetros fueron elegidos para encajar nuestras especificaciones: 40 X objetivo de inmersión, promedio de línea X 8 con resolución de imagen de 512 × 512 de agua. Imágenes multicolor, adquisición de imágenes secuenciales se requiere cuando la longitud de onda de la emisión de un fluoróforo y la longitud de onda de excitación de otra superposición (aquí, longitudes de onda de emisión de proteína fluorescente amarilla (YFP) y superposición de excitación de tomate). Elegir el modo secuencial "entre pila" ya que es el más rápido y el movimiento de las neuronas reloj es insignificante durante la adquisición de una pila de Z. Configuración de microscopía deben adaptarse para satisfacer el objetivo de cada experimento.</li>
</ol>3. configuración de la cultura de explante de cerebro larvas
Nota: Todo el procedimiento de disección a la incrustación de los explantes de cerebro tarda ~ 30 minutos.
<ol><li>
Preparación de los reactivos bajo una campana de cultura.
	<ol>
<li>Descongelar una alícuota de la trombina y mantener a temperatura ambiente hasta el paso de empotrar (paso 3.3). Uso individual.</li>
		<li>Descongelar rápidamente una alícuota de SAM a 37 ° C y mantener en hielo para un solo uso.</li>
		<li>Añadir a SAM a una alícuota de 10 mg de fibrinógeno 10 mg/ml, mueva suavemente e incubar a 37 ° C durante al menos 30 minutos y durante el paso de empotrar (paso 3.3). Uso individual. Nota: No incubar la solución de fibrinógeno más de 2 h empieza a polimerizar.</li>
		<li>Descongelar una alícuota de 100 acciones de x penicilina-estreptomicina. Preparar 2,5 mL de SAM que contiene 1 x penicilina-estreptomicina (SAM/antibióticos). Mantener a temperatura ambiente. Nota: Stock de tienda los restantes 100 x penicilina-estreptomicina a 4 ° C hasta 1 mes.</li>
		<li>Preparar una alícuota de 500 μl del SAM restantes. Mantener en hielo.</li>
		<li>Para la proyección de imagen a largo plazo, aplicar grasa para vacío en autoclave a la parte de plástico de la parte inferior del plato de fondo de cristal (figura 1A) y esterilizar bajo cabina de flujo laminar con UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Disección de la cuerda del nervio del sistema nervioso central y ventral.
	<ol>
<li>Limpie las pinzas y 2 x cristal bien tres platos de disección con el 70% EtOH. Verter 400 μL de DSS en pozos de 4 y 400 μL de SAM en un pozo. Mantener en hielo.</li>
		<li>Sacar medio mosca que contiene larvas y escoger no vagando larvas de estadio 3 (L3) con pinzas. Enjuagar sucesivamente en 2 pozos llenos de DSS. Mantenerlos en el pozo 3 lleno de DSS en el hielo que anestesia las larvas. Nota: L3 dura aproximadamente 2 días a 25 ° C. Para observar el cerebro en tiempo fisiológicamente relevante hemos optado por utilizar larvas L3 no errante. Otros subgrupos de neuronas reloj, tales como l-LNvs y DN3s, comienzan a formarse en la fase L3 que vaga pero aún no están necesariamente ciclismo (datos no mostrados). Por lo tanto, aunque es posible imagen ciclismo las neuronas reloj en esta etapa (datos no mostrados), es importante distinguir cuidadosamente las neuronas reloj larvas ya funcional de los análisis de datos desarrollo de. Errantes no L3 aparecen aproximadamente de 4 a 4,5 días después ponedora a 25 ° C. Para utilizar este protocolo para el estudio de los ritmos circadianos, sincronizar (arrastrar) el convertirse larvas en 12 h/12 h LD ciclos a 25 ° C durante 3 días antes de recoger las larvas L3.</li>
		<li>Diseccionar cerebros larvales con pinzas finas en el pozo lleno de DSS 4, que no se ha utilizado para el enjuague de larvas, utilizando el método de adentro hacia fuera27.<ol>
<li>Brevemente, corte la larva dos, suavemente pellizcar los ganchos de la boca con un par de pinzas y ruede para arriba de adentro hacia afuera la pared del cuerpo con el otro par de pinzas, exponiendo el cerebro. Libre el cerebro cortando a la tráquea y los nervios que se conectan con el resto del cuerpo.</li>
			<li>Aspire el cerebro en 3 μl de DSS con una pipeta de 20 μl (que han sido enjuagada con DSS) y dispensar en el pozo lleno de SAM. Repita el procedimiento para cerebros hasta 7. Nota: La disección debe realizarse sobre una superficie fría para mantener las larvas anestesiadas y el cerebro refrigerado. Por ejemplo, colocar el plato de la disección en un bloque de enfriamiento conectado a una bomba para circular el agua bien fría. La disección procedimiento toma 30 s por cerebro. Es importante mantener los discos imaginal ojo/antenal conectados al cerebro y la médula ventral del nervio intacta. Estas piezas se dañan el cerebro y reducir la calidad de la cultura. También, Evite exponer el cerebro al aire. Antes de aspirar el primer cerebro, pipetear arriba y abajo de los DSS que contiene piezas de las larvas disecadas, ya que evita que el cerebro se adhiera a la pared de la punta.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inclusión de los explantes de cerebro en una matriz 3D y montaje (~ 20 min).
	<ol>
<li>Sumerja un cerebro disecado en la solución de trabajo de fibrinógeno (~3.3 de final de la concentración de fibrinógeno mg/mL, 10.5 μl por cerebro) como sigue:</li>
		<li>Aspirar 3.5 μl de SAM/antibióticos (con la punta del mismo utilizada en el punto 3.2.3). Aspirar un cerebro disecado de la disección en la misma punta de pipeta sin dispensar el medio SAM/antibióticos en la punta.</li>
		<li>Dispensar el cerebro y el medio en la tapa de una placa de Petri estéril. Añadir otro 3.5 μl de SAM/antibióticos y 3.5 μl de solución de 10 mg/mL caliente fibrinógeno/SAM en la gota que contiene el cerebro. Mezcle suavemente la solución alrededor del cerebro mediante pipeteo con una pipeta de 20 μl. Nota: Usando una pipeta, en lugar de fórceps en este paso evita haciendo hincapié en el cerebro.</li>
		<li>Tomar 2 μl de la solución de trabajo de fibrinógeno de la gota y aplique sobre el cubreobjetos de vidrio plato inferior como un pequeño círculo. Añadir 0,8 μl de trombina y mezclar rápidamente con una punta de pipeta. El fibrinógeno se convierte en fibrina y comienza a polimerizar.</li>
		<li>Tomar el cerebro que se encuentra en el fibrinógeno solución (paso 3.3.1) entre un par de pinzas y colocarlo en la matriz una vez que un blanco de la matriz de fibrina es visible. Orientar la parte anterior del cerebro hacia abajo (para proyección de imagen las neuronas reloj). Empújela hacia abajo lo más cerca posible al cubierta de vidrio. Coágulo de fibrina se compone de capas de fibrina. Escoger una capa y doble en la parte superior del cerebro con movimientos suaves y pequeños sin extraer la matriz.<ol>
<li>Repita 2 a 3 veces de diferentes partes del coágulo para estabilizar el cerebro. Nota: Al manipular el cerebro con pinzas, tenga cuidado de no secar o se impone un estrés físico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Añadir 20 μl de SAM/antibióticos en la parte superior del cerebro incrustado para detener la acción de la trombina.</li>
		<li>Repita el procedimiento para montar los cerebros restantes. Es posible incorporar hasta 5 a 6 cerebros en un plato de fondo de cristal.</li>
		<li>De largo plazo en la proyección de imagen, añadir 600 μl de SAM/antibióticos en el pozo interior (la parte de vidrio). Colocar una membrana PTFE corta encima de la media y pegarla a la grasa para vacío aplicado en la parte de plástico de la parte inferior (3.1.5) (figura 1A).</li>
		<li>Para los ensayos farmacológicos, llene el plato con 2 mL de SAM/antibióticos (figura 1B). Nota: Es muy importante evitar la evaporación del medio, ya que la osmolalidad del medio es fundamental para la viabilidad de las neuronas. Por lo tanto, para los experimentos de proyección de imagen a largo plazo, es necesario sellar la placa de cultivo con membrana de PTFE. Mientras que para los experimentos a corto plazo, membrana de sellado no es necesaria siempre y cuando el plato se llena con 2 mL de medio y controlado en una cámara humidificada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. adquisición de la imagen Time-lapse
<ol><li>Coloque el plato de fondo de vidrio en el soporte del plato de Petri dentro de la cámara de humedad de la etapa superior.</li>
	<li>Ir al panel de z-stack en la pestaña de adquirir y fijar los pasos de la sección de z desde el software del microscopio (2 μm × 40 en los experimentos se muestra en la figura 2 y figura 3y 1 película). Establece el principio de una pila de z en el plano más alejado el cubreobjetos y el final en la superficie del explante cerebro, cerca del cubreobjetos. Aunque los movimientos cerebrales son insignificantes, añadir secciones z extras al principio y al final de la pila de z.</li>
	<li>Ir a marcar y encontrar instalación y panel de adquisición de imagen de múltiples posiciones. Con el objetivo de X 40, 1 hemisferio del cerebro puede ser capturado dentro de un campo de visión</li>
	<li>Ir a panel de modos de adquisición y selección xyzt (Time-lapse z-stack). Ir al panel de tiempo de adquisición y definir los parámetros de intervalo y la frecuencia de tiempo preferido. Nota: Adquisición de imágenes de Time-lapse con frecuencia deseada. Tenga en cuenta que a largo plazo en la proyección de imagen (24-72 h) con intervalo de lapso de tiempo más corto que 2 h tiende a resultados en menos neuronas ciclismo, probablemente debido a que reduce la viabilidad de las neuronas. El volumen de datos se expande como la tasa de aumento de adquisición de imagen, que hace el almacenamiento y análisis de datos más difícil.</li>
</ol>5. farmacológico tratamiento de explantes de cerebro con viva imagen a corto plazo
Nota: El siguiente procedimiento es esencialmente el mismo que para la proyección de imagen a largo plazo pero requiere una membrana PTFE. Para evitar exponer a los cerebros para luz azul cuando el producto químico se agrega a la cultura, el microscopio debe colocarse en el cuarto oscuro con luz roja.
<ol><li>Ir al panel de tiempo de adquisición y establecer el intervalo de tiempo deseado y el número de análisis para obtener los datos de línea de base antes de la aplicación de la droga. Iniciar el análisis.</li>
	<li>Después de la línea de base se ha completado la exploración, levante la cabeza de exploración de la sistema del microscopio. Retire la tapa del regulador de humedad de la etapa superior y con mucho cuidado retire la tapa del plato de fondo de vidrio sin moverla.</li>
	<li>Retire la cantidad apropiada de medio de cultivo si es necesario. Añadir la solución experimental en el medio y, con cuidado y muy suavemente, mezclar con una pipeta Pasteur estéril sin tocar los explantes de cerebro. Nota: Para aplicación de baño de PDF, utilice 2 μm PDF solución (en 10% DMSO).</li>
	<li>Vuelva a colocar las tapas del plato de fondo de cristal y la cámara húmeda y el jefe de exploración. Si se utiliza, volver a colocar el paño opaco negro alrededor de la cámara de microscopio.</li>
	<li>Compruebe si los cerebros están en sus posiciones originales en el modo de escaneado. Ajustar si es necesario.</li>
	<li>Ir al panel de tiempo de adquisición y establecer el intervalo de tiempo deseado y el número de análisis. Iniciar el análisis. Nota: Aquí hemos probado Time-lapse imágenes obtenidas cada hora durante un máximo de 10 h.</li>
</ol>

<ol>
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A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos el método de largo plazo de microscopía de fluorescencia Time-lapse de cerebros larvas cultivados. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, tales como la salud de la cultura, método para la inmovilización del explante de cerebro, la intensidad de fluorescencia y relación señal a ruido de la reportera, temporal y resolución espacial, y accesibilidad para el explante. Estos factores pueden ser mutuamente excluyentes. Por ejemplo, aumento de frecuencia de lapso de tiemp...

Relojes circadianos ayudan a los organismos para adaptarse a los cambios ambientales periódicos generados por la rotación de 24 h de la tierra. Los circuitos de retroalimentación transcripcional y traduccional enclavijado comúnmente subyacen la maquinaria molecular de los relojes circadianos a través de especies1. El circuito del marcapasos circadiano compuesto de reloj que contiene neuronas integra información de hora del día, transmitido por las señales ambientales, como luz/oscuridad (LD) y ciclos de temperatura, a coordinar los ritmos de una plétora de diario fisiológico y procesos conductuales2,3. La coordinación de ritmos moleculares neuronales entradas y salidas es críticamente importante para el funcionamiento del circuito circadiano pero sigue siendo sólo parcialmente entendida.
En Drosophila, en el centro del reloj molecular, el heterodímero/ciclo de reloj (CLK/CYC) activa la transcripción del período (por) y timeless (tim). PER y TIM forman un complejo y entrar en el núcleo, donde inhiben la actividad transcripcional de CLK/CYC y en consecuencia su propia transcripción. Reglamentos postranscripcional y poste-de translación causan retrasos entre CLK/CYC-mediada por transcripción y represión por / TIM, asegurando la generación de alrededor de 24-h oscilaciones moleculares1,3,4 . Unos 150 neuronas que contiene estos relojes moleculares forma un circuito para control circadiano comportamiento de adulto vuela5. Un mucho más simple pero totalmente funcional circadiano circuito que consiste en 3 grupos de neuronas reloj - 5 las neuronas laterales ventrales (LNvs; 4 LNvs PDF-positivo y uno negativo PDF LNv, ver abajo), 2 Dorsal neurona 1 (DN1s) y 2 2s Dorsal de neuronas (DN2s) - está presente en las larvas cerebro de6,7.
El simple circuito circadiano larvas ofrece un excelente modelo para estudiar las interacciones entre la comunicación inter neuronal y el mecanismo molecular. Usando nuestro nuevo reportero fluorescente por TDT, que imita los niveles de proteína y su localización subcelular, se intentó caracterizar la dinámica de la mecánica molecular en subgrupos de reloj diferentes neuronas en el circuito circadiano larvas 8. conocer el papel fundamental del factor de dispersión de pigmento neuropéptido (PDF) producido por 4 LNvs en la regulación de los ritmos circadianos en el nivel neuronal9,10,11, además, queríamos examinar el directo efecto de PDF sobre los relojes moleculares. Para ello, se desarrolló un método para controlar la expresión de genes circadianos ritmos en cerebro larvas presentaron durante varios días por microscopia confocal Time-lapse. El protocolo fue adaptado también para que Ensayos farmacológicos probar el efecto de PDF u otros compuestos en el nivel de la por-TDT. Así, la adaptación consiste en hacer accesible al uso de la droga la cultura de explante de cerebro, aumentando la resolución temporal y proyección de imagen para una duración más corta.
Ex vivo la cultura del cerebro de Drosophila de diferentes etapas de desarrollo han sido previamente establecidas12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando que estos protocolos se han utilizado para la proyección de imagen distintos fenómenos biológicos, algunos de ellos no son compatibles con la proyección de imagen en resolución unicelulares o no apoyo la cultura por más de varias horas. Métodos alternativos para realizar proyección de imagen a largo plazo de vivo de neuronas circadianas en Drosophila incluyen proyección de imagen de bioluminiscencia de ritmos molecular19,20,21 y proyección de imagen de fluorescencia de indicador de calcio con microscopia de luz hoja22,23. Aunque proyección de imagen de bioluminiscencia puede conseguir mayor resolución temporal y microscopía de luz de hoja puede ser adaptable para proyección de imagen en vivo , están limitadas en la resolución espacial y requieren sistemas especializados de microscopio.
El método descrito aquí está diseñado para visualizar señales fluorescentes en la cultura de todo el cerebro unicelular resolución durante varios días. Este método fácil y versátil puede adaptarse a cerebros de mosca adulta imagen cultivada y para experimentos farmacológicos estudiar diferentes problemas en Neurobiología de la Drosophila .

<table><tbody><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &quot;suitable for insect cell culture&quot; whenever available</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&amp;minus;)-Malic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>Fumaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Ketoglutaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH, pH 7.4</td><td>E&amp;amp;K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from bovine plasma</td><td>Calbiochem (Merck)</td><td>341573-1GM</td><td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td></tr><tr><td>PDF, NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum grease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td><td>fisherscientific</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td><td>Dupont</td><td>200A Teflon FEP Film</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, PVDF, 33&amp;nbsp;mm, gamma sterilized</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Three-well glass dissection dish</td><td>Any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps, size 5, Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature control chamber</td><td>Life Imaging Services</td><td>The CUBE &amp;amp; BOX temperature control system, custom designed</td><td></td></tr><tr><td>Stage-top humidity controller</td><td>Life Imaging Services</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td><td>ImageJ software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x iterative deconvolution</td><td>AutoQuant and Imaris software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

El circuito del marcapasos circadiano orquesta rítmicas salidas conductuales y fisiológicas coordinadas con señales ambientales, tales como ciclos de día/noche. El reloj molecular dentro de cada neurona de marcapasos genera ritmos circadianos en la expresión génica, que subyacen a las funciones neuronales rítmicas esenciales para el funcionamiento del circuito. Investigación de las propiedades de los osciladores moleculares individuales en diferentes subclases de las neuronas marcapasos y su interacción con la señalización neuronal produce una mejor comprensión del circuito del marcapasos circadiano. Aquí, presentamos un enfoque de Time-lapse microscopia fluorescente desarrollado para controlar el mecanismo molecular en las neuronas reloj del culto cerebro larvas de Drosophila . Este método permite la grabación de varios día de los ritmos de reporteros circadianos fluorescentes genéticamente codificados en resolución unicelular. Esta configuración puede combinarse con manipulaciones farmacológicas a analizar de cerca la respuesta en tiempo real del reloj molecular para varios compuestos. Más allá de los ritmos circadianos, este método polivalente en combinación con potentes técnicas de genética de la Drosophila ofrece la posibilidad de estudiar diversos procesos neuronales o moleculares en el tejido vivo cerebral.

Presentamos los resultados representativos de la grabación a largo plazo de un reportero fluorescente circadiano en ex vivo cerebro larvas cultura y los resultados de imagen vivo de PDF baño aplicación para la expresión del reportero.
Larvas L3 vagando por no expresar el reportero reloj molecular por TDT y la UAS-mCD8::YFP conducido por un conductor de neurona de reloj Clk 856-gal4 (fig...

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Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K vistas.  University of Geneva. El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.

Video: Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Uso de células Drosophila S2 para imágenes en vivo de la división celular

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genética

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Neurociencias

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparación de desarrollo y de adultos Drosophila Los cerebros y retinas de imágenes en vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Biología

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Imágenes de explantes cerebrales vivos de larvas de Drosophila melanogaster en el tercer estadio

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Autor destacado: Investigación de la dinámica de la división celular asimétrica: un protocolo para la obtención de imágenes en vivo de explantes cerebrales de larvas de Drosophila 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

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Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila