Nuestro protocolo se puede utilizar para determinar eventos dinámicos espaciales y temporales durante la mitosis, y también se puede utilizar para visualizar los efectos de los reguladores mitóticos en tiempo real. El uso de imágenes de doble color permite un análisis simultáneo de dos marcadores moleculares. Por ejemplo, podemos visualizar los microtúbulos del husillo mitótico y la estructura del núcleo cinético de los cromosomas replicados.
Para inducir la expresión de proteínas fluorescentes, cuatro días después del tratamiento de interferencia de ARN, exponga las células trans infectadas promotoras de metallo-tianina inducibles a una concentración final de 500 sulfatos de cobre micromolares durante 24 a 36 horas. Para preparar la proteína fluorescente que expresa las células para la toma de imágenes, transfiera las células a un tubo estéril de 15 mililitros y, después de contar, sedimentar las células por centrifugación. Resuspender el pellet en fresco, 25 grados Celsius calentado SIM, complementado con 10%FBS, a dos veces 10 a las 6 células por mililitro de concentración, y tratar las células con sulfato de cobre 500 micromolares adicionales.
Luego agregue 200 a 500 microlitros de células a un pozo de una cámara de celdas vivas de varios pozos, y coloque la cámara en una etapa de microscopio fluorescente invertido. Mientras las células se asientan en la cámara, abra el software de imágenes de células vivas y haga clic en nuevo y experimente. Para insertar un bucle de lapso de tiempo sobre el que se tomarán las imágenes, haga clic en el icono de bucle de lapso de tiempo.
Establezca el intervalo en segundos y divida la longitud total del experimento deseada en segundos por el intervalo para establecer el número de ciclos. Permita que el bucle se repita durante el período de tiempo total deseado. Para insertar una comprobación de enfoque infrarrojo para mantener el enfoque del objetivo, haga clic en el icono mover XY y seleccione Compensación de deriva Z para agregar un paso de compensación de deriva Z dentro de la capa de bucle de lapso de tiempo.
Para permitir la adquisición de una imagen multicanal, haga clic en el icono de grupo multicanal para agregar una capa de grupo multicanal y haga clic en el icono Agregar un bucle de pila Z para agregar una capa de bucle de pila Z. A continuación, establezca el tamaño de paso deseado y el número de rodajas, y establezca la exposición de cada canal en lo más bajo posible para minimizar el blanqueo fotográfico. Para crear una imagen de una división de celda, seleccione un objetivo de inmersión de 40 o 60 veces en aceite y el canal de florescencia mCherry y alinee el objetivo a lo largo de la parte superior o inferior del pozo.
A continuación, aléjese del divisor vertical de pozos para evitar interferencias con el paso de compensación de deriva Z. Localice una celda o celdas en la fase G2 tardía o M temprana, y haga clic en el botón de vista en vivo para comenzar a ver celdas en la pantalla del software. Encontrar células apropiadas en la transición de G2 a M es clave para crear imágenes de una división celular.
Localice una célula con un núcleo intacto y exactamente dos centrosomas para obtener mejores resultados. Usando la perilla de enfoque fino del microscopio, concéntrese en las celdas de interés y haga clic en buscar desplazamiento para establecer la comprobación de enfoque infrarrojo. Haga clic en Start para iniciar el programa de imágenes de lapso de tiempo y seleccione el canal deseado y ajuste las intensidades medias de píxeles para ajustar los histogramas según sea necesario, para visualizar claramente las celdas de interés.
Revise las celdas después de 15 a 20 minutos para confirmar que se ha producido la avería de la envolvente nuclear, según lo determinado por la desaparición del punto redondo y oscuro refractado cerca del centro de la célula. Después de otros 15 a 20 minutos, compruebe si se ha producido el inicio de la anafasa. A continuación, detenga el programa y guarde el archivo.
Para determinar la avería de la envolvente nuclear en la sincronización de inicio de anafas, haga clic en el botón de marco para determinar el tiempo de descomposición de la envolvente nuclear y el tiempo de separación inicial del cromosoma en minutos, y reste el tiempo de descomposición del tiempo de inicio para obtener la avería de la envolvente nuclear al tiempo de inicio de análisis para una celda determinada. Luego continúe buscando celdas pre-dividiendo para obtener múltiples extremos para una condición dada hasta 12 horas desde el asentamiento inicial. Las células que están a punto de dividirse pueden ser objetivo de la presencia de dos centroomas y un núcleo intacto, como lo indica la luz refractada y un punto más oscuro dentro de la célula cuando se ven en el canal alfa de la tubulina.
La descomposición de la envolvente nuclear se puede visualizar a través de la desaparición de esta mancha oscura, lo que resulta en la coloración uniforme del citoplasma. Después de la descomposición de la envolvente nuclear, el tiempo que tarda cada célula en formar el husillo y para congresos y segregar los cromosomas se puede medir observando los puntos de tiempo de estos eventos en relación con la descomposición de la envolvente nuclear. El tratamiento con ARN de doble cadena dirigido contra el cortocircuito, una proteína de reticulación de microtúbulos de actina que se sospecha que afecta a la dinámica del ciclo celular da como resultado un retraso mitótico significativo.
Este tratamiento resulta en un retraso significativo, con muchas células arrestando en la metafase y nunca pasando a anafase durante todo el experimento de imágenes de dos a tres horas. El co-tratamiento con ARN de doble cadena contra el disparo y el acuerdo brusca, un componente importante de este punto de control, conduce a una supresión del fenotipo de detención, lo que resulta en una ruptura de la envolvente nuclear a tiempos de anafase similares a las células controladas y no tratadas. Asegúrese de seleccionar las celdas adecuadas y no pierda el tiempo en las celdas de imágenes que no comienzan la división.
Si una celda no comienza a dividirse en 20 minutos, busque otra celda. Los investigadores pueden seguir este procedimiento para ayudar a identificar nuevos reguladores mitóticos, o posiblemente nuevos compuestos secos que afectan eventos específicos en la división celular.
