Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Agradecemos a las instalaciones de proyección de imagen del Instituto de Ciencias de la vida de UBC (LSI) para apoyar y mantener el microscopio STED. Este trabajo fue financiado por beca #68865 de los institutos canadienses de investigación en salud (a M.R.G.). Agradecemos al Dr. Kozo Kaibuchi (Universidad de Nagoya, Nagoya, Japón) el plásmido CLIP-170-GFP.

Todos los procedimientos animales fueron aprobados por la Universidad de Columbia Británica Comité de cuidado de animales.
1. expresión de proteínas de la fusión de GFP en células de linfoma B de A20
<ol><li>Células en cultivo A20 en completan Medio RPMI (RPMI-1640 suplementado con 10% inactivado con calor suero bovino fetal (FBS), 50 μm 2-Mercaptoetanol, glutamina 2 mM, piruvato de 1 mM, 50 U/mL de penicilina y estreptomicina 50 de μg/mL) a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con 5 % CO2.</li>
	<li>Preparar el reactivo de transfección (véase la Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante. Nota: Este protocolo ha sido optimizado para los reactivos específicos y Protocolo de la transfección se describe en la Tabla de materiales. Otros reactivos de transfección que hemos intentado no han producido suficiente eficacia de transfección.</li>
	<li>Contar las células usando un hemocitómetro. Células de6 A20 centrífuga 2,5 x 10 (para cada transfección) por 5 min a x 525 g. resuspender las células en 100 μl de reactivo de transfección que contienen 1-2,5 μg de ADN plásmido. Para el ADN codificación CLIP-170-GFP23, utilizar 2,5 μg por transfección. Mezclar suavemente.</li>
	<li>Transferir las células a un pozo de una placa de 6 pozos y ajustar el volumen de 2 ml con el Medio RPMI completo precalentado. Las células de 18 h a 37 ° C para permitir la expresión de la proteína de la cultura.</li>
</ol>2. aislamiento de células primario de ratón B y activación con LPS
<ol><li>Uso de herramientas quirúrgicas esterilizadas para extirpar el bazo de un ratón, siguiendo protocolos de actuación aprobados por el Comité de cuidado de animales de la institución.</li>
	<li>En la campana de cultivo de tejidos, coloque un filtro de célula estéril 70 μm en un plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contiene 3 mL de PBS estéril temperatura ambiente. Use la parte de goma del émbolo de una jeringa de 5 ml para triturar el bazo a través de la coladera de la célula.</li>
	<li>Pipetear la suspensión unicelular de splenoctyes en un tubo de 15 mL estéril y centrifugar a 525 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Uso un aislamiento magnético basado en el grano de la célula de B kit (véase Tabla de materiales) para obtener una población altamente enriquecida de las células de B.</li>
	<li>Resuspender las células B a 3 x 106/ml de Medio RPMI completo suplementado con 2,5 μg/mL LPS más factor (BAFF, una citoquina de supervivencia) de activación de células B de 5 ng/mL.</li>
	<li>Las células de la cultura durante 6 h a 37 ° C.</li>
</ol>3. capa de vidrio cubreobjetos con anticuerpos Anti-Ig
<ol><li>Preparar la solución de anticuerpo para el revestimiento de los cubreobjetos. Diluir la solución madre de anticuerpos de cabra anti-mouse Ig en PBS estéril temperatura para hacer un 12,5 μg/mL de solución; 400 μL de solución de anticuerpo se requiere para cada cubreobjetos. Nota: Uso cabra anti-ratón IgG para las celdas A20; Utilice cabra anti-ratón IgM de las células B primarias. Anticuerpos de cabra IgG no se unen a receptores de Fc de ratón. Sin embargo, para evitar cualquier posible atascamiento del receptor de Fc, se puede utilizar F(ab) o F(ab')2 fragmentos de anti-ratón IgG o anticuerpos de anti-ratón IgM.</li>
	<li>Sumerja un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 mm #1.5 en metanol al 100% y dejar secar completamente (~ 10 min).</li>
	<li>Utilizando pinzas, coloque un cubreobjetos seco un cultivo de tejidos 12-bien placa y pipetee 400 μL de la 12.5 μg/mL anticuerpos solución (5 total μg, 2 μg/cm2) sobre el cubreobjetos para que forma una burbuja en el centro del cubreobjetos y se extiende a los bordes.</li>
	<li>Tenga cuidado de cubrir el cubreobjetos todo, pero no permita que la solución de anticuerpo extender más allá del borde del cubreobjetos de vidrio y el plástico de cultivo de tejidos. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Lavar los cubreobjetos por Pipetear 1 mL de PBS estéril en el bien y, posteriormente, aspirando la solución. Repetir dos veces más para eliminar los anticuerpos no Unidos.</li>
	<li>Añadir 1 mL de PBS estéril para el bien que contienen cubreobjetos recubiertos de anticuerpos hasta que las células están listas para añadirse. Nota: El cubreobjetos pueden conservarse a temperatura ambiente, cubierta con PBS, para su uso en el mismo día.</li>
</ol>4. la célula de B que se separa en cubreobjetos recubierto de Ig Anti
<ol><li>Preparar modificado tamponado con HEPES salina (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7.2, 125 mM NaCl, KCl, 1 mM CaCl2de 5 mM, 1 mM de Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, dextrosa de 1 mg/mL, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 50 μm 2-Mercaptoetanol). Filtro esta solución de esterilizar y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>En el día del experimento, hacer 50 mL de mHBS con 2% FBS (mHBS-FBS) añadiendo 1 mL de SFB inactivado con calor a 50 mL mHBS. Caliente la mHBS SBF a 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Centrifugar las células transfected A20 o a las células B primarias que habían sido cultivadas con BAFF más LPS 525 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Resuspender las células en 1 mL de SBF mHBS, contar las células usando un hemocitómetro y diluir las células a 2 x 105 células/mL en mHBS FBS.</li>
	<li>Usando pinzas transfiera el cubreobjetos de la placa de cultivo de tejidos a un pedazo de la película de parafina.</li>
	<li>Añadir 250 μl de células de B (5 x 104 células) a cada cubreobjetos.</li>
	<li>Incubar el cubreobjetos a 37 ° C durante 15 min en la oscuridad para permitir que las células B para extender por la superficie anti-IgG-revestida.</li>
</ol>5. la fijación y el Immunostaining, las células
<ol><li>Preparar la solución de fijación diluyendo la solución madre de paraformaldehído al 16% y la solución glutaraldehído al 50% en agua a temperatura ambiente agua destilada para obtener concentraciones finales de glutaraldehido paraformaldehido y 0.1% de 3%. Preparar la solución de fijación en el día es para ser utilizado y desechar cualquier exceso. PRECAUCIÓN: Las soluciones stock paraformaldehido y glutaraldehído deben ser utilizadas en una campana de humos químicos. Siga las instrucciones en la hoja de datos de seguridad del material (MSDS).</li>
	<li>Preparar el buffer de permeabilización/bloqueo (BSA 3% y 0,1% Tritón X-100 diluido en PBS). Filtro esta solución de esterilizar y almacenar a 4 ° C. En el día del experimento, calentar la cantidad necesaria a la temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar el tampón de tinción (saponina 1% de BSA y un 0.1% en PBS). Esta solución utiliza un filtro μm 0.2 de esterilizar y almacenar a 4 ° C. En el día del experimento, calentar la cantidad necesaria a la temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipetear 350 μl de la solución de fijación en cada cubreobjetos, asegurando que la superficie está totalmente cubierta. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min en la oscuridad.</li>
	<li>Retire la solución de fijación el cubreobjetos aspirando cuidadosamente desde el borde del cubreobjetos con una micropipeta. PRECAUCIÓN: La solución de fijación debe ser desechada como residuos químicos peligrosos.</li>
	<li>Lavar los cubreobjetos una vez con 500 μl de buffer de permeabilización/bloqueo. Pipeta el líquido.</li>
	<li>Permeabilizar y bloquear las células añadiendo 250 μl de buffer de permeabilización/bloqueo a cada cubreobjetos y incubando durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo anti-tubulina de conejo 1: 100 en tampón de tinción.</li>
	<li>Aspirar apagado el buffer de permeabilización/bloqueo del cubreobjetos y añadir 50 μl de la solución diluida del anticuerpo anti-tubulina a cada cubreobjetos. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min en la oscuridad.</li>
	<li>Preparar la solución de tinción de anticuerpo secundario/actina mediante la dilución del anticuerpo secundario de cabra Alexa Fluor 532-conjugado anti-conejo IgG y phalloidin Alexa Fluor 568 conjugado 1: 100 en tampón de tinción.</li>
	<li>Lavar los cubreobjetos 3 veces para quitar exceso de anticuerpo primario por agregar 500 μl de tampón de tinción y luego de aspiración.</li>
	<li>Añadir 50 μl de la solución de tinción de anticuerpo secundario/actina a cada cubreobjetos e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Lavar los cubreobjetos 3 veces para quitar exceso de anticuerpo secundario agregar 500 μl de tampón de tinción y luego de aspiración.</li>
	<li>Añadir 10 μl de reactivo de montaje a un portaobjetos de microscopio. Monte el cubreobjetos sobre el portaobjetos con el lado de la celda hacia abajo. Nota: Un medio de montaje de "anti-fade" (véase Tabla de materiales) se recomienda para preservar la intensidad de fluorescencia de proteínas de la fusión de GFP. Evitar el uso de reactivos que contiene DAPI, que puede interferir con la proyección de imagen de los fluoróforos cuando se utiliza el láser STED de montaje.</li>
	<li>Deje que los portaobjetos se seque durante la noche en la oscuridad. Imágenes de las diapositivas el día siguiente. Nota: Las diapositivas de imágenes tan pronto como el cubreobjetos esté seco se recomiendan, como la fluorescencia de GFP disminuirá con el tiempo.</li>
</ol>6. proyección de imagen usando el microscopio STED
Nota: Tenga en cuenta que todos los pasos de software se describen a continuación son específicos para el microscopio y el software que utilizamos (véase la Tabla de materiales). Los pasos y configuración necesitará ajustarse si la proyección de imagen se realiza utilizando un microscopio y software diferentes.
<ol><li>En el microscopio STED, activar el láser y lámpara de iluminación epifluorescente y el software del microscopio.</li>
	<li>Establecer los parámetros para los lasers de agotamiento de STED. Nota: Esto dependerá del microscopio específico se utiliza y los láseres que se equipa. Algunas recomendaciones de configuración es de luz blanca (WLL) 70%; 592 nm láser 80%; 660 nm láser 80%.</li>
	<li>Activar los ajustes de STED y alinear los rayos de láser STED usando el objetivo X 100.</li>
	<li>Utilizando el ocular, enfoque la muestra y seleccionar una celda con moderada expresión de GFP. Nota: Expresión de GFP bajo no aparecerán ya que STED reduce la intensidad de emisión. Por el contrario, la alta expresión de CLIP-170-GFP induce la formación espontánea de grandes grupos, que no reflejan la normal microtubule final plus proteína compleja morfología y distribución. Seleccionando una celda con moderada expresión de GFP es esencial para la proyección de imagen con precisión las estructuras citoesqueléticas en el sitio de contacto del antígeno.</li>
	<li>Zoom en la celda seleccionada y elija la región de interés a ser reflejada. Ajustar el enfoque para que el plano x-y de la célula de B que está más cerca el cubreobjetos está en foco.<ol>
<li>Para ello, hacia el objetivo progresivamente más cerca el cubreobjetos para que las estructuras citoesqueléticas de células B entran en foco y luego ir fuera de foco. Entonces mueva gradualmente el objetivo en la dirección opuesta hasta que las estructuras citoesqueléticas de células B en primer lugar volver en foco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimizar la configuración, incluida la potencia del láser, haz de excitación y detector gama. Comenzar con la configuración recomendada por el fabricante. Luego hacer los ajustes necesarios para optimizar la señal de las muestras. Todas las muestras a comparar entre sí con la misma configuración de la imagen.</li>
	<li>En la pestaña de "adquirir" del software, establece la adquisición de la imagen en adquisición secuencial del marco en el panel inferior izquierdo de "Análisis secuencial" marcando la opción "entre bastidores".</li>
	<li>Establecer la secuencia de adquisición. Nota: Adquirimos la fluorescencia de GFP en primer lugar con el fin de evitar la degradación de la señal de la GFP. Dependiendo de la combinación de fluoróforos que sirven además de GFP, la señal de fluorescencia de longitud de onda más larga de la proyección de imagen primero puede obtenerse mejores resultados. Sin embargo, el orden en que los fluoróforos o proteínas fluorescentes están sujetos a agotamiento de la emisión estimulada y reflejadas debe ser optimizado para obtener las señales de fluorescencia más fuertes y mejor resolución.</li>
	<li>Seleccionar y ajustar la potencia del láser STED para cada fluoróforo en la pestaña de "Adquisición" del software y utilice la barra deslizante para 592-nm o el láser 660 STED para ajustar la potencia del láser. Ajustar la potencia para el agotamiento de 592 nm láser para GFP y Alexa Fluor 532. Ajustar la potencia para el láser 660 nm agotamiento para Alexa Fluor 568.</li>
	<li>Para aumentar la resolución y reducir la señal de fondo, vaya a la configuración de "Adquisición" en la pestaña de "Adquisición" del software, aumentar la línea marco un promedio mediante la selección de un valor mayor que 1 se puede usar el menú desplegable para cada opción.</li>
	<li>También, adquirir la señal fluorescente con STED tiempo cerrada la opción bloquea para el fluoróforo en la pestaña de "Adquirir", y especificando valores para sincronización de tiempo (ver nota más abajo). Aumentar la potencia del láser STED para mejorar la resolución, aunque esto también aumentará el fotoblanqueo de los fluoróforos. Nota: El tiempo bloquea necesitará optimizarse para el microscopio, la muestra y fluoróforos se utiliza. Una vez que bloquean de 0.3 a 6 ns se recomienda. Después de la fijación, GFP es particularmente sensible a la energía láser de alta. Para reducir el fotoblanqueo de GFP, sincronización de tiempo se debe aplicar y debe reducirse la potencia del láser STED.</li>
	<li>Para capturar imágenes 3D de STED, utilice el control deslizante para cambiar el punto extendido función (PSF) a "STED 3D".</li>
	<li>Manualmente adquirir múltiples imágenes para asegurar reproducibilidad. Deconvolve las imágenes (ver figura 1) utilizando un software de deconvolución paquete41(véase Tabla de materiales).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation.">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).</li><li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation.">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+B+cell+activation.">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling.">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts:+Synapses+and+Kinapses.">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse.">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses.">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses.">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunter+to+gatherer+and+back:+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion.">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk:+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling.">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li><li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing.">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster.">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion.">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li><li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse.">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+organization+and+dynamics:+two+ends+in+the+limelight.">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule++TIPs+at+a+glance.">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li><li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170.">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity.">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li><li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Imágenes detalladas de estructuras citoesqueléticas pueden obtenerse usando microscopia de STED súper resolución, que teóricamente puede alcanzar una resolución de 50 nm, en comparación con microscopia confocal convencional, para que la resolución de la difracción limitada es de ~ 200 nm 24. la capacidad para resolver las estructuras más finas es aún mayor utilizando software de deconvolución para calcular la posición más probable de la fuente de luz original de la señal observada f...

Cuando las células B se unen a polarizado matrices de antígenos (por ejemplo, aparece en la superficie del antígeno que presenta las células (APCs)), el resultante receptor de células B (BCR) la formación de una estructura de la sinapsis inmune clásico, que era el primer descrita en las unidades de señalización T las células1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inicialmente, micromasas de forma de BCR antígeno-limita en la periferia del sitio contacto B celular: APC. Estas micromasas luego moverse hacia el centro del sitio contacto antígeno, donde ellos se fusionan en un grupo central de activación supramolecular (cSMAC) que forma la base de la sinapsis inmune. Formación de sinapsis inmune optimiza el BCR señalización y facilita la extracción de antígeno mediada por BCR de membrana APC14. Esta adquisición de antígeno, que es seguida por internalización mediada por BCR antígeno y el antígeno subsecuente procesamiento, permite a las células B presentan péptido: MHC complejos II a las células T y obtener ayuda de la célula de T14. Porque promueve la formación de sinapsis inmune activación de células B, elucidar los mecanismos que establecen que este patrón funcional de la organización del receptor puede proporcionar nuevas penetraciones en la respuesta inmune humoral cómo se inició y regulados.
Reorganización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos es esencial para la formación de la sinapsis inmune. BCR localizado señalización estimulada por una variedad espacial polarizado de antígenos induce la rápida y espectacular remodelación del citoesqueleto actina1,15. La formación de estructuras dendríticas de la actina en la periferia de la célula de B ejerce fuerzas de empuje en la membrana plasmática y promueve la difusión de la célula de B. Esto permite a la célula de B explorar un área mayor de la superficie de cojinete de antígeno y aumenta el número de BCR que se unen antígeno y activar vías de señalización del BCR. Al mismo tiempo, la COMT y la red de microtúbulos son reorientados hacia el sitio de contacto del antígeno. Como el MTOC aproxima el sitio de contacto del antígeno, los microtúbulos que emanan de la COMT se extienden a lo largo de la cara interna de la membrana plasmática en la interfase entre la célula de B y la superficie de cojinete de antígeno16,17. Estos microtúbulos juxtamembrane pueden entonces actuar como vías para el movimiento centrípeto de antígeno-limita BCR micromasas18, conduciendo a la formación de un cSMAC mediado por dineína.
La reorientación y la polarización de la COMT hacia la sinapsis inmune requiere actina intacto y citoesqueletos de microtúbulos y a menudo depende de las interacciones entre la actina cortical red y microtúbulos16,17, 19,20. Proteínas de unión a actina corticales, como IQGAP1, pueden capturar microtúbulos interactúan con complejos proteínicos que decoran los microtúbulos más extremos21. Estos dinámicos complejos de proteínas final plus incluyen EB1 y CLIP-170, que se refieren colectivamente como microtúbulos plus-final seguimiento de proteínas (+ consejos)21,22. + Puntas en los extremos de los microtúbulos pueden atar a las proteínas que están asociadas con la membrana plasmática o con el citoesqueleto de actina cortical. Esto permite mecanismos de generación de fuerza (p. ej., al final menos dirigió movimiento de dineína cortical anclados a lo largo de los microtúbulos) ejercen fuerzas de tracción en microtúbulos, y así reposicionar el MTOC. CLIP-170 puede unir a la proteína de andamiaje de actina asociados IQGAP123, y hemos demostrado que ambas de estas proteínas son necesarios para la polarización inducida por el BCR MTOC hacia la sinapsis inmune17. Esta interacción IQGAP1-CLIP-170 puede jugar un papel clave en la coordinación de la remodelación del citoesqueleto de actina con la reposición de la red de microtúbulos en la sinapsis inmune de células B.
Microscopía de fluorescencia convencional ha puesto de manifiesto la dramática reorganización de los citoesqueletos de actina y microtúbulos en células B sinapsis inmune formación2. Sin embargo, este enfoque no puede resolver estructuras celulares pequeños detalles debido al límite de difracción de la luz, que, conforme a la ley de Abbe, depende de la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar la muestra y la abertura del objetivo24. Este límite de difracción limita la resolución de los microscopios de luz convencionales a 200-300 nm en la dirección lateral y 500-700 nm en la dirección axial25. Por lo tanto, pequeñas estructuras subcelulares, así como los detalles de los citoesqueletos de actina y microtúbulos, sólo se pudieran observar mediante microscopía electrónica. Proyección de imagen de microscopia electrónica del citoesqueleto es lento, requiere protocolos de fijación y preparación muestra áspero que pueden alterar las estructuras biológicas y se limita a la detección de anticuerpo-mediada. La habilidad de immunostain y simultáneamente imagen múltiples proteínas o estructuras celulares es una ventaja sustancial de microscopía de fluorescencia. Además, la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en las células permite la proyección de imagen en tiempo real y es útil cuando no hay anticuerpos efectivos para la inmunotinción de la proteína de interés.
Recientes avances tecnológicos en microscopía de superresolución superar los límites de la difracción de la luz y permite la visualización de las estructuras celulares de nanoescala24. Una tal técnica de microscopía de resolución súper se llama estimulante de la emisión (STED) agotamiento de la microscopia. STED utiliza dos rayos láser, donde un láser excita el fluoróforo y un segundo láser con un patrón en forma de dona suprime selectivamente la emisión de fluorescencia en el fluoróforo. Esto reduce la función de punto de extensión (área aparente) de una sola partícula fluorescente y proporciona una secundario-difracción límite imagen fluorescente25,26. Microscopía-estado de agotamiento también emplea técnicas basadas en fluorescencia para adquirir imágenes de súper resolución. Sin embargo, los tiempos de adquisición y reconstrucción de imágenes largos, hay sólo un número limitado de fluoróforos que pueden utilizarse y la proyección de imagen alta resolución simultánea de múltiples componentes citoesqueléticos técnicamente es difícil porque mantener estructuras de actina y microtúbulos requiere fijación diferentes procedimientos. Por lo tanto, STED tiene múltiples ventajas sobre la microscopía electrónica y otra microscopía de superresolución enfoques que ofrece la adquisición de imágenes rápido, tiene requisitos mínimos del post-processing y emplea el mismo fluoróforos y técnicas de tinción se utilizan para microscopía de fluorescencia convencional de muestras fijadas26.
Microscopia de la estupendo-resolución ya ha sido utilizada para visualizar estructuras de actina en la sinapsis inmune en células de naturales del asesinas (NK) y26,de las células de T27,de29,de28,30, 31. sin embargo, la proyección de imagen de súper-resolución del citoesqueleto de microtúbulos, así como la reorganización coordinada de los citoesqueletos de actina y microtúbulos durante la formación de la sinapsis inmune, sólo recientemente ha sido reportado17. Se utilizó la microscopia de STED a imagen B células que habían sido autorizadas a difundir en cubreobjetos recubierto con anticuerpos de anti-inmunoglobulinas (anti-Ig), que estimulan el BCR señalización e inician la reorganización del citoesqueleto. Cuando plateado en anticuerpos anti-Ig inmovilizados, las células de B se someten a dramático dependiente de actina que se separa, que recapitula los acontecimientos iniciales durante la formación de la sinapsis inmune. Lo importante, microscopia de STED reveló los detalles del anillo dendrítico de la F-actina que forma en la periferia de la inmune sinapsis y demostró que la COMT, como los microtúbulos Unidos a él, se habían movido cerca el contacto antígeno del17. Estos microtúbulos se extendieron hacia fuera hacia el anillo periférico de la F-actina. Por otra parte, la proyección de imagen de STED multicolor de varias combinaciones de F-actina, tubulina, IQGAP1 y GFP-tagged CLIP-170 + consejos demostraron que microtúbulos plus-extremos marcados por CLIP-170-GFP eran estrechamente relacionados con la red de actina periférica y IQGAP1, un captura de cortical proteína17.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para la proyección de imagen los citoesqueletos de actina y microtúbulos en la sinapsis inmune usando microscopia de STED. Estos métodos han sido optimizados utilizando la línea A20 de células B murinas, que ha sido ampliamente empleada para el estudio de BCR señalización y formación de sinapsis inmune17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. porque anticuerpos comerciales para CLIP-170 no funcionó bien para la inmunotinción en experimentos anteriores, describimos en detalle la expresión de GFP-tagged CLIP-170 en celdas A20, junto con protocolos para visualizar simultáneamente hasta la coloración tres componentes citoesqueléticos o proteínas citoesqueleto asociadas. Métodos para el uso de microscopia de STED a actina imagen en sinapsis inmunes de la célula NK han sido descritos40. Aquí, nosotros extendemos esta adquisición de imágenes de múltiples colores súper resolución de citoesqueletos la actina y los microtúbulos en las células de B.
Una consideración crítica para microscopía de superresolución está utilizando los procedimientos de fijación adecuado para mantener las estructuras celulares y prevenir el daño a las proteínas fluorescentes. La fijación y tinción métodos presentados en este documento han sido optimizados para retener la fluorescencia de GFP y proporcionar imágenes de alta resolución de las redes de actina y microtúbulos. Cuando la expresión de proteínas fluorescentes, debe señalarse que las células B son generalmente difíciles de transfectar. Mediante este protocolo, 20-50% de A20 células típicamente expresan la proteína de la fusión de GFP transfected, y entre esta población los niveles de expresión de la proteína son variables. Sin embargo, la proyección de imagen de súper-resolución de actina y microtúbulos mediante los procedimientos que describimos es bastante robusta y fácilmente se obtienen imágenes de alta calidad. A pesar de su pequeño tamaño en relación con las células de la A20, nos muestran que estos procedimientos también pueden utilizarse para la red de microtúbulos en las células B primarias que han sido activados brevemente con lipopolisacárido (LPS) de la imagen. Hemos demostrado que las células primarias de LPS activa B pueden ser transfectadas con siRNAs con relativamente alta eficiencia (es decir, tal que agotamiento de proteínas se puede detectar por immunoblotting), haciendo que una buena alternativa a la utilización de líneas de células B para algunos estudios 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 mouse B-lymphoma cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>Heat inactivate at 56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C for 30 min</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Liquid, 10,000 units</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional materials for primary B cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS from &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;0111:B4</td></tr><tr><td>B cell-activating factor (BAFF)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;Cell&lt;/strong&gt; 109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Recommended transfection reagents and equipment &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Follow the manufacturer&#039;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program L-013 used</td></tr><tr><td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coating coverslips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>Dissecting extra fine splinter forceps</td></tr><tr><td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>For A20 cells</td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>For primary mouse B cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Without DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution software</td><td>Scientific Voume Imaging</td><td></td><td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

Las células de B que se unen a los antígenos de membrana (p. ej., en la superficie de una célula presentadora de antígeno) forman una sinapsis inmune, una estructura celular especializada que optimiza la señalización de receptores (BCR) de células B y adquisición de antígeno mediada por BCR. La remodelación del citoesqueleto de la actinia y la reorientación de la red de microtúbulos hacia el sitio de contacto del antígeno son esenciales para la formación de la sinapsis inmune. Remodelación del citoesqueleto de actina en un anillo denso periférico de la F-actina se acompaña de polarización del centro organizador de microtúbulos hacia la sinapsis inmune. Proteínas de microtúbulos plus final, así como proteínas cortical final plus captura median interacciones físicas entre los citoesqueletos de actina y microtúbulos, que permitan reorganizar de manera coordinada. Elucidar los mecanismos que esta reorganización del citoesqueleto, así como entender cómo estas estructuras citoesqueléticas forma formación de sinapsis inmune BCR de señalización, de control pueden proporcionar nuevas visiones en la activación de la célula de B. Esto ha sido ayudado por el desarrollo de enfoques de microscopía de superresolución que revelan nuevos detalles de organización en red citoesquelética. Aquí describimos un método para el uso de microscopia de agotamiento (STED) emisión estimulada simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y transfected microtúbulos tagged GFP plus final proteínas en las células de B. Para modelar los acontecimientos tempranos en la formación de sinapsis inmune, permitimos que las células de B untar en cubreobjetos recubierto con anticuerpos de anti-inmunoglobulinas (anti-Ig), que inician BCR señalización y remodelación del citoesqueleto. Ofrecemos protocolos paso a paso para expresar proteínas de la fusión de GFP en células de linfoma B de A20, para la difusión de anti-Ig-inducida de la célula y para la fijación posterior de la célula, Immunostaining, adquisición de imágenes y pasos de deconvolución de imagen. Las imágenes de alta resolución obtenidas mediante estos procedimientos permiten visualizar simultáneamente estructuras de actina, microtúbulos y las microtúbulos plus final proteínas que pueden vincular estas dos redes citoesqueléticas.

Para las células B separarse en inmovilizado anti-Ig, microscopia de STED utilizada en conjunción con el software de deconvolución proporciona imágenes de resolución más alta de estructuras citoesqueléticas de microscopía confocal. Esto es evidente en la figura 1, donde la red de F-actina se visualizó utilizando el protocolo descrito anteriormente. Una comparación de confocal y STED super-resolución imágenes de la misma muestra demuestra que las i...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Presentamos un protocolo para el uso de microscopia de STED simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y proteínas microtubule plus final en las células de B que se han diseminado en cubreobjetos recubierto con anticuerpos contra el receptor de células B, un modelo para la fase inicial de formación de la sinapsis inmune.

Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

visualizing-actin-microtubule-cytoskeletons-at-b-cell-immune-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

13.7K vistas.  University of British Columbia. Presentamos un protocolo para el uso de microscopia de STED simultáneamente las estructuras de actina imagen, microtúbulos y proteínas microtubule plus final en las células de B que se han diseminado en cubreobjetos recubierto con anticuerpos contra el receptor de células B, un modelo para la fase inicial de formación de la sinapsis inmune.

Video: Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

La visualización de la sinapsis inmunológica mediante gated-Tiempo color dual Emisión Estimulada de Agotamiento (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Investigación

Inmunología e Infección

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Estudio de la dinámica de los organelos en células B durante la formación de la sinapsis inmune

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Imagen de la Sinapsis Inmunológica Humana

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

Source: Zheng, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52502">Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

1. Preparation of Liposomes

	Calculate the amount of chloroform-suspended stock solutions of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Source: Martinelli, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53288">An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Evaluación de la topología de la sinapsis inmunológica a través de imágenes de células vivas

1. Preparing Human CD4+&#160;Th1 Effector/Memory T Cells

	Apply a tourniquet to the arm of the donor, wipe the vein with alcohol, and insert a needle. ...

Visualización de la actina y los microtúbulos citoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento

Resumen

Explorar más videos

PLAYLIST