Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Ringraziamo la struttura di Imaging di UBC Life Sciences Institute (LSI) per sostenere e mantenere il microscopio STED. Questo lavoro è stato finanziato da grant #68865 l'istituti canadesi di ricerca sanitaria (a M.R.G.). Ringraziamo il dottor Kozo Kaibuchi (Università di Nagoya, Nagoya, Giappone) per il plasmide CLIP-170-GFP.

Tutte le procedure di animali sono state approvate dall'Università della British Columbia Comitato di cura degli animali.
1. esprimere proteine di GFP-fusione in cellule di B-linfoma A20
<ol><li>Cellule di cultura A20 in completano medium RPMI (RPMI-1640 completati con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS), 50 µM 2-mercaptoetanolo, glutamina 2mm, piruvato di 1 mM, 50 U/mL di penicillina e 50 µ g/mL di streptomicina) a 37 ° C in un incubatore di coltura del tessuto con 5 % CO2.</li>
	<li>Preparare il reagente di transfezione (Vedi la Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore. Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato per i reagenti specifici e protocollo di transfezione descritto nella Tabella materiali. Altri reagenti di transfezione che abbiamo provato non hanno dato sufficiente efficienza di trasfezione.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando un emocitometro. Centrifuga 2,5 x 106 A20 cellule (per ogni trasfezione) per 5 min a x 525 g. Risospendere le cellule in 100 µ l di reagente di transfezione contenente 1-2,5 µ g di DNA plasmidico. Per il DNA codifica CLIP-170-GFP23, utilizzare 2,5 µ g per la transfezione. Mescolare delicatamente.</li>
	<li>Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e regolare il volume a 2 mL con terreno RPMI completo pre-riscaldato. Coltura delle cellule per 18 h a 37 ° C per consentire l'espressione della proteina.</li>
</ol>2. isolamento primario del Mouse B cellule e loro attivazione con LPS
<ol><li>Utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati per rimuovere la milza da un mouse, seguendo protocolli approvati dal comitato di cura degli animali dell'istituzione.</li>
	<li>Nella coltura del tessuto cappa, posizionare un colino di cella sterile 70 µm in un piatto di coltura del tessuto 35 mm contenente 3 mL di PBS sterile temperatura ambiente. Utilizzare la parte di gomma dello stantuffo da una siringa da 5 ml per schiacciare la milza attraverso il filtro delle cellule.</li>
	<li>Dispensare la sospensione unicellulare di splenoctyes in una provetta sterile da 15 mL e centrifugare a 525 x g per 5 min.</li>
	<li>Uso un isolamento magnetico basato su perlina B cellula kit (Vedi Tabella materiali) per ottenere una popolazione altamente arricchita delle cellule B.</li>
	<li>Risospendere le cellule di B di 3 x 106/ml in completa medium RPMI completate con 2,5 µ g/mL LPS più fattore (BAFF; una citochina di sopravvivenza) di attivazione delle cellule di B di 5 ng/mL.</li>
	<li>Le cellule della coltura per 6 ore a 37 ° C.</li>
</ol>3. rivestimento vetrini coprioggetti con gli anticorpi Anti-Ig
<ol><li>Preparare la soluzione di anticorpo per il rivestimento di lamelle. Diluire la soluzione madre di capra-anti-mouse Ig anticorpi nella temperatura ambiente PBS sterile per rendere un 12,5 µ g/mL di soluzione; 400 µ l di soluzione di anticorpo è richiesto per ogni vetrino coprioggetti. Nota: Utilizzare il anti-topo di capra IgG per celle A20; utilizzare anti-topo di capra IgM per cellule primarie di B. Gli anticorpi IgG di capra non si legano bene ai recettori Fc del mouse. Tuttavia, per evitare qualsiasi potenziale grippaggio del ricevitore di Fc, uno può usare F(ab) o punto2 frammenti di anti-IgG di topo o di anticorpi IgM anti-topo.</li>
	<li>Immergere un coprioggetto in vetro rotondo 18 mm #1.5 in 100% di metanolo e lasciarla asciugare completamente (~ 10 min).</li>
	<li>Usando il forcipe, porre il coprivetrino secco in una coltura del tessuto 12-pozzetti piastra e dispensare 400 µ l di 12,5 µ g/mL Anticorpo soluzione (5 µ g totale; 2 µ g/cm2) sul coprioggetto affinché si forma una bolla al centro del coprivetrino e si diffonde ai bordi.</li>
	<li>Essere attenti a coprire l'intero vetrino coprioggetti, ma non lasciare che la soluzione di anticorpo di estendere oltre il bordo del vetrino coprioggetti e sulla plastica di coltura del tessuto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Lavare i vetrini coprioggetto di pipettaggio 1 mL di PBS sterile nel bene e, successivamente, aspirare la soluzione. Ripetere altre due volte per rimuovere gli anticorpi non legati.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS sterile la ben contenente il coprioggetto anticorpo-rivestite fino a quando le cellule sono pronte per essere aggiunti. Nota: Lamelle possono essere conservate a temperatura ambiente, coperto con PBS, per l'uso sullo stesso giorno.</li>
</ol>4. diffusione sulle lamelle Anti-Ig-rivestito delle cellule B
<ol><li>Preparare per volta tamponata HEPES salino (mHBS): 25mm HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1mm Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, destrosio di 1 mg/mL, glutamina 2mm, piruvato di sodio di 1 mM e 50 µM 2-mercaptoetanolo). Filtro sterilizzare questa soluzione e conservare a 4 ° C.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, fare 50 mL di mHBS con 2% FBS (mHBS-FBS) aggiungendo 1 mL di FBS inattivati a 50 mL mHBS. Caldo mHBS-FBS a 37 ° C prima dell'uso.</li>
	<li>Centrifugare le cellule transfected A20 o le cellule di B primarie che erano state coltivate con BAFF plus LPS a 525 x g per 5 min.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1 mL di mHBS-FBS, contare le celle utilizzando un emocitometro e diluire le cellule a 2 x 105 cellule/mL in mHBS-FBS.</li>
	<li>Usando il forcipe, trasferire il coprioggetto dalla piastra di coltura del tessuto per un pezzo di pellicola di paraffina.</li>
	<li>Aggiungere 250 µ l di B cellule (5 x 104 ) per ogni vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Incubare i vetrini coprioggetti a 37 ° C per 15 min al buio per consentire le cellule B a diffondersi su tutta la superficie anti-IgG-rivestito.</li>
</ol>5. fissaggio e Immunostaining le cellule
<ol><li>Preparare la soluzione di fissazione diluendo la soluzione di riserva 16% paraformaldeide e la soluzione di riserva 50% glutaraldeide in acqua distillata a temperatura ambiente per produrre concentrazioni finali di 3% di paraformaldeide e 0,1% di glutaraldeide. Preparare la soluzione di fissazione del giorno che è di essere usato e scartare qualsiasi eccesso. Attenzione: Le soluzioni stock paraformaldeide e glutaraldeide devono essere utilizzate solo in una cappa chimica. Seguire le istruzioni della scheda di dati di sicurezza (MSDS).</li>
	<li>Preparare il tampone di permeabilizzazione/blocco (3% BSA e 0,1% Triton X-100 diluito in PBS). Filtro sterilizzare questa soluzione e conservare a 4 ° C. Il giorno dell'esperimento, calda la quantità necessaria a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il tampone di colorazione (saponina BSA e 0,1% 1% in PBS). Questa soluzione utilizzando un filtro di 0,2 µm di sterilizzare e conservare a 4 ° C. Il giorno dell'esperimento, calda la quantità necessaria a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pipettare 350 µ l della soluzione di fissaggio su ogni vetrino coprioggetti, assicurando che la superficie sia completamente coperta. Incubare a temperatura ambiente per 10 min al buio.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di fissaggio da coprivetrino aspirando attentamente dal bordo del coprivetrino utilizzando una micropipetta. Attenzione: La soluzione di fissaggio deve essere eliminata come rifiuti chimici pericolosi.</li>
	<li>Lavare i vetrini coprioggetti una volta con 500 µ l di tampone di permeabilizzazione/blocco. Dispensare il liquido.</li>
	<li>Permeabilize e bloccare le cellule aggiungendo 250 µ l di tampone di permeabilizzazione di blocco per ogni vetrino coprioggetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Diluire 1: 100 dell'anticorpo anti-tubulina coniglio nella macchiatura buffer.</li>
	<li>Aspirare il tampone permeabilizzazione/blocco da lamelle e aggiungere 50 µ l della soluzione diluita dell'anticorpo anti-tubulina ogni vetrino coprioggetti. Incubare a temperatura ambiente per 30 min al buio.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo secondario/actina macchia diluendo falloidina coniugati Alexa Fluor 568 1: 100 in buffer di colorazione sia l'anticorpo secondario coniugato con Alexa Fluor 532 capra anti-coniglio IgG.</li>
	<li>Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte per rimuovere l'anticorpo primario in eccesso aggiungendo 500 µ l di buffer di colorazione e quindi ad aspirazione e.</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l della soluzione macchia secondaria dell'anticorpo/actina ogni vetrino coprioggetto e incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte per rimuovere l'eccesso anticorpo secondario aggiungendo 500 µ l di buffer di colorazione e quindi ad aspirazione e.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di reagente di montaggio di un vetrino da microscopio. Montare il vetrino coprioggetto sulla diapositiva microscopio con il lato di cella verso il basso. Nota: Un mezzo di montaggio "anti-dissolvenza" (Vedi Tabella materiali) è fortemente consigliato per preservare l'intensità della fluorescenza delle proteine di fusione di GFP. Evitare l'uso di reagenti contenenti DAPI, che può interferire con l'imaging dei fluorophores quando si utilizza il laser STED di montaggio.</li>
	<li>Lasciare i vetrini per asciugare durante la notte al buio. Le diapositive di immagini il giorno successivo. Nota: Le diapositive di Imaging, non appena il coprioggetto è asciutto è fortemente consigliato, come la fluorescenza di GFP si riduce nel tempo.</li>
</ol>6. imaging mediante il microscopio STED
Nota: Si prega di notare che tutti i passaggi di software descritte di seguito sono specifici per il microscopio e il software che abbiamo usato (Vedi la Tabella materiali). I passaggi e le impostazioni dovrà essere regolato se imaging viene eseguita utilizzando un microscopio/software diversi.
<ol><li>Accendere il microscopio STED, attivare il laser e la lampada di illuminazione epifluorescenza e avviare il software di microscopio.</li>
	<li>Impostare i parametri per i laser di svuotamento STED. Nota: Questo dipenderà il microscopio specifico utilizzato e i laser che è dotato. Alcune consigliate sono le impostazioni di luce bianca (WLL) 70%; 592 nm laser 80%; 660 nm laser 80%.</li>
	<li>Attivare le impostazioni di STED e allineare i raggi laser STED utilizzando l'obiettivo 100x.</li>
	<li>Utilizzando l'oculare, concentrare il campione e selezionare una cella con espressione di GFP moderata. Nota: Espressione di GFP basso non sarà visibile perché STED riduce l'intensità di emissione. Al contrario, un'alta espressione di CLIP-170-GFP induce la formazione spontanea di cluster di grandi dimensioni, che non riflette il normale microtubule plus-fine proteina complessa morfologia e distribuzione. Selezionando una cella con espressione moderata GFP è essenziale per l'imaging con precisione le strutture citoscheletriche il contatto dell'antigene.</li>
	<li>Zoom nella cella selezionata e scegliere la regione di interesse per l'imaging. Regolare il fuoco in modo che il piano x-y della cellula B che è più vicino il coprioggetto è a fuoco.<ol>
<li>Per effettuare questa operazione, è possibile spostare progressivamente più vicino l'obiettivo al vetrino coprioggetti in modo che le strutture del citoscheletro delle cellule di B vengono messi a fuoco e poi andare fuori fuoco. Poi gradualmente spostare l'obiettivo nella direzione opposta fino a quando le strutture del citoscheletro delle cellule di B prima tornare a fuoco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ottimizzare le impostazioni tra cui la potenza del laser, fascio di eccitazione e gamma del rivelatore. Iniziare con le impostazioni consigliate dalle istruzioni del produttore. Quindi apportare modifiche necessarie per ottimizzare il segnale per i campioni. Tutti i campioni da confrontare a vicenda con le stesse impostazioni di immagine.</li>
	<li>Sotto la scheda "acquisire" del software, impostare l'acquisizione dell'immagine su acquisizione sequenziale fotogramma nel pannello inferiore sinistro "Scansione sequenziale" selezionando l'opzione "tra i frame".</li>
	<li>Impostare la sequenza di acquisizione. Nota: Acquisiamo la fluorescenza di GFP in primo luogo al fine di evitare la degradazione del segnale GFP. A seconda della combinazione di fluorofori utilizzati oltre a GFP, prima il segnale di fluorescenza di lunghezza d'onda più lungo di imaging può produrre risultati migliori. Tuttavia, l'ordine in cui i fluorofori o proteine fluorescenti sono sottoposti a svuotamento stimolato dell'emissione e imaged dovrebbe essere ottimizzato per ottenere i più forti segnali di fluorescenza e la migliore risoluzione.</li>
	<li>Selezionare e impostare la potenza del laser STED per ogni fluoroforo sotto la scheda "Acquire" del software e utilizzare la barra di scorrimento per il 592-nm o il laser STED 660 nm per regolare la potenza del laser. Regolare la potenza del laser lo svuotamento 592-nm per GFP e Alexa Fluor 532. Regolare la potenza del laser di svuotamento di 660 nm per Alexa Fluor 568.</li>
	<li>Per aumentare la risoluzione e ridurre il segnale di fondo, andare alle impostazioni "Acquisizione" sotto la scheda "Acquire" del software, aumentare la linea e/o il frame in media selezionando un valore maggiore di 1 utilizzando il menu a discesa per ogni opzione.</li>
	<li>Inoltre, acquisire il segnale fluorescente usando tempo-gated STED spuntando l'opzione gating per il fluoroforo sotto la scheda "Acquire", e specificando i valori per tempo-gating (Vedi nota sotto). Aumentare la potenza del laser STED per migliorare la risoluzione, anche se ciò aumenterà anche photobleaching di fluorophores. Nota: Il tempo di gating dovrà essere ottimizzato per il microscopio, il campione e fluorofori utilizzati. Un tempo gating da 0,3 a 6 ns è raccomandato. Dopo la fissazione, la GFP è particolarmente sensibile ad alta potenza laser. Per ridurre il photobleaching di GFP, deve essere applicato il tempo gating e la potenza del laser STED deve essere ridotta.</li>
	<li>Per catturare immagini in 3D STED, usare il cursore per modificare il punto diffusa funzione (PSF) in "3D STED".</li>
	<li>Acquisire manualmente immagini multiple per assicurare la riproducibilità. Deconvoluzione le immagini (Vedi Figura 1) utilizzando un software di deconvoluzione di confezionare41(Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Immagini dettagliate di strutture citoscheletriche possono essere ottenuti usando la microscopia STED super-risoluzione, che teoricamente può raggiungere una risoluzione di 50 nm, rispetto al convenzionale microscopia confocale, per cui la risoluzione di diffrazione limitata è ~ 200 nm 24. la capacità di risolvere strutture più fini è ulteriormente migliorata utilizzando software di deconvoluzione per calcolare la posizione più probabile della sorgente luminosa originale dal segnale di fluor...

Quando le cellule B associare polarizzati matrici di antigeni (ad es., visualizzato sulla superficie dell'antigene-presentare cellule (APC)), il recettore della B-cellula risultante (BCR) segnalazione unità la formazione di una struttura classica sinapsi immuni, che era prima descritto in T cellule1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Inizialmente, microclusters di form di BCRs antigene associato alla periferia del sito contatto B cellulare: APC. Questi microclusters quindi spostare verso il centro del sito contatto antigene, dove si fondono in un cluster centrale attivazione supramolecolari (cSMAC) che costituisce il nucleo della sinapsi immune. Formazione della sinapsi immuni ottimizza la segnalazione di BCR e facilita l'estrazione dell'antigene BCR-mediata dalla membrana APC14. Questa acquisizione di antigene, che è seguita da BCR-mediata antigene internalizzazione e l'elaborazione successiva dell'antigene, permette alle cellule di B di presentare i peptide: MHC II complessi alle cellule di T e suscitare la cellula T Guida14. Perché la formazione della sinapsi immunitaria promuove l'attivazione delle cellule B, chiarire i meccanismi che stabiliscono che questo modello funzionale dell'organizzazione del ricevitore può offrire nuove intuizioni in risposte immunitarie umorali come sono avviate e regolati.
Riorganizzazione dell'actina sia microtubule cytoskeletons è essenziale per la formazione della sinapsi immuni. Segnalazione stimolata da una matrice spazialmente polarizzato degli antigeni localizzati di BCR induce rapida e drammatica rimodellamento del citoscheletro dell'actina1,15. La formazione di strutture dendritiche actina alla periferia della cellula B esercita forze che spinge sulla membrana plasmatica e promuove la diffusione delle cellule di B. Questo permette alla cellula di B di acquisire una maggiore area di superficie del antigene-cuscinetto e aumenta il numero di BCRs che legano l'antigene e attivare vie di segnalazione di BCR. Allo stesso tempo, il MTOC e la rete dei microtubuli sono riorientati verso il sito di contatto dell'antigene. All'approssimarsi del contatto dell'antigene il MTOC, microtubuli che emana dal MTOC si estendono lungo la faccia interna della membrana del plasma all'interfaccia fra la cellula di B e l'antigene-cuscinetto superficie16,17. Questi microtubuli juxtamembrane possono quindi fungere da tracce per il movimento centripeto dineina-mediata di antigene associato BCR microclusters18, portando alla formazione di un cSMAC.
Il riorientamento e la polarizzazione del MTOC verso la sinapsi immunitaria richiede l'actina intatto e cytoskeletons dei microtubuli e spesso dipende dalle interazioni tra l'actina corticale rete e microtubuli16,17, 19,20. Proteine leganti l'actina corticale, come IQGAP1, possono catturare i microtubuli interagendo con complessi proteici che decorano il microtubulo plus-estremità21. Questi dinamici complessi delle proteine leganti plus-fine includono EB1 e CLIP-170, che vengono definiti collettivamente come microtubule plus-fine rilevamento delle proteine (+ puntali)21,22. + Suggerimenti alle estremità dei microtubuli possono associare alle proteine che sono associate con la membrana plasmatica o il citoscheletro di actina corticale. In questo modo i meccanismi di generazione di forza (ad es., il meno-end diretto movimento di dineina corticale ancorata lungo i microtubuli) per esercitare forze di trazione su microtubuli e quindi riposizionare il MTOC. CLIP-170 può legarsi alla proteina actina-collegati ponteggi IQGAP123, e abbiamo dimostrato che entrambi di queste proteine sono necessari per polarizzazione indotta da BCR MTOC verso il sistema immunitario sinapsi17. Questa interazione IQGAP1-CLIP-170 può giocare un ruolo chiave nel coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina con il riposizionamento della rete dei microtubuli alla sinapsi immune della B-cellula.
Microscopia a fluorescenza convenzionale ha rivelato la riorganizzazione drammatica della cytoskeletons actina e dei microtubuli durante la B-cellula immunitaria sinapsi formazione2. Tuttavia, questo approccio non può risolvere piccole strutture cellulari in dettaglio a causa del limite di diffrazione della luce, che, secondo la legge di Abbe, dipende dalla lunghezza d'onda della luce utilizzata per illuminare il campione e l'apertura del obiettivo24. Questo limite di diffrazione vincola la risoluzione dei microscopi ottici convenzionali a 200-300 nm in direzione laterale e 500-700 nm nella direzione assiale25. Di conseguenza, più piccole strutture subcellulari, come pure i dettagli degli cytoskeletons actina e dei microtubuli, potrebbero solo essere osservati usando la microscopia elettronica. Formazione immagine di microscopia elettronica del citoscheletro è che richiede tempo, richiede protocolli fissazione e preparazione del campione duro che possono alterare strutture biologiche ed è limitata alla rilevazione dell'anticorpo-mediata. La capacità di immunostain e contemporaneamente l'immagine più proteine o strutture cellulari è un vantaggio notevole di microscopia di fluorescenza. Inoltre, che esprimono le proteine di fusione fluorescenti in cellule permette l'imaging in tempo reale ed è utile quando gli anticorpi efficaci per immunostaining la proteina di interesse non sono disponibili.
I recenti progressi tecnologici nella microscopia di Super-risoluzione hanno superato i limiti di diffrazione della luce e ha permesso la visualizzazione di nanoscala strutture cellulari24. Una tale tecnica di microscopia di Super-risoluzione viene chiamato emissione stimolata svuotamento (STED) microscopia. STED impiega due laser, dove un laser eccita il fluoroforo e un secondo laser con un motivo a forma di ciambella selettivamente sopprime l'emissione di fluorescenza intorno il fluoroforo. Questo riduce la funzione di punto di diffusione (zona apparente) di una singola particella fluorescente e fornisce un limite di Sub-diffrazione immagine fluorescente25,26. Microscopia di stato fondamentale svuotamento impiega anche tecniche basate sulla fluorescenza per acquisire immagini di Super-risoluzione. Tuttavia, i tempi di acquisizione e ricostruzione di immagine sono lunghi, ci sono solo un numero limitato di fluorofori che possono essere utilizzato, e l'imaging ad alta risoluzione simultanea di più componenti citoscheletriche è tecnicamente impegnativo, perché mantenere strutture di actina e microtubuli richiede le procedure di fissaggio diversi. Di conseguenza, STED ha più vantaggi rispetto la microscopia elettronica e altre microscopia di Super-risoluzione si avvicina in quanto esso offre acquisizione rapida di immagini, ha i requisiti minimi di post-elaborazione e impiega la stessa fluorofori e tecniche di colorazione che vengono utilizzati per microscopia di fluorescenza convenzionale di campioni fissati26.
Microscopia di Super-risoluzione ora è stata utilizzata per visualizzare le strutture di actina alla sinapsi immune in cellule natural killer (NK) e T cellule26,27,28,29,30, 31. Tuttavia, la formazione immagine di Super-risoluzione del citoscheletro dei microtubuli, così come la riorganizzazione coordinata della cytoskeletons di actina e dei microtubuli durante la formazione della sinapsi immuni, solo recentemente è stato segnalato17. Abbiamo usato la microscopia STED per celle di immagine B che erano state lasciate a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che stimolano la segnalazione di BCR e avviare la riorganizzazione del citoscheletro. Quando placcato sugli anticorpi anti-Ig immobilizzati, le cellule B subiscono drammatica diffusione actina-dipendente, che ricapitola gli eventi iniziali durante la formazione della sinapsi immuni. D'importanza, microscopia STED ha rivelato i dettagli dell'anello dendritica di F-actina che forme alla periferia del sistema immunitario sinapsi e ha mostrato che il MTOC, come pure i microtubuli collegati ad esso, avevano spostato vicino l'antigene contatto sito17. Questi microtubuli esteso verso l'esterno verso l'anello periferico di F-actina. Inoltre, formazione immagine di STED multi-colore di varie combinazioni di F-actina, tubulina, IQGAP1 e GFP-etichettato CLIP-170 + suggerimenti ha indicato che microtubule plus-estremità segnata da CLIP-170-GFP erano strettamente associata con il reticolo di actina periferici e con IQGAP1, un corticale cattura proteina17.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'actina e microtubule cytoskeletons alla sinapsi immune usando la microscopia STED di imaging. Questi metodi sono stati ottimizzati utilizzando la linea A20 murino delle cellule di B, che è stato ampiamente impiegata per lo studio della segnalazione di BCR e immuni sinapsi formazione17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. perché gli anticorpi commerciali a CLIP-170 non hanno funzionato bene per immunostaining in precedenti esperimenti, descriviamo dettagliatamente l'espressione della GFP-etichettato CLIP-170 in cellule A20, con macchiatura dei protocolli per visualizzare contemporaneamente fino a tre componenti del citoscheletro o proteine associate al citoscheletro. Metodi per l'utilizzo di microscopia STED all'actina di immagine a livello delle sinapsi immune delle cellule NK sono stati descritti in precedenza40. Qui, estendiamo questo per l'acquisizione di immagini ad alta super-risoluzione multi-colore di actina sia microtubule cytoskeletons in cellule di B.
Una considerazione critica per microscopia di Super-risoluzione è utilizzando le procedure di fissazione appropriato per il mantenimento di strutture cellulari e prevenendo danni to le proteine fluorescenti. La fissazione e la macchiatura metodi presentati qui sono stati ottimizzati per conservare la fluorescenza di GFP e fornire imaging ad alta risoluzione delle reti di actina e dei microtubuli. Quando è necessario esprimere proteine fluorescenti, dovrebbe essere notato che le cellule B sono solitamente difficili a transfect. Usando questo protocollo, 20-50% di A20 cellule tipicamente esprimono la proteina di fusione GFP transfettata, e fra questa popolazione i livelli di espressione della proteina sono variabili. Tuttavia, super-resolution imaging di actina e i microtubuli utilizzando le procedure che descriviamo è abbastanza robusta e immagini di alta qualità sono facilmente ottenute. Nonostante le piccole dimensioni rispetto a cellule A20, mostriamo che queste procedure utilizzabile anche all'immagine della rete dei microtubuli in cellule primarie di B che sono stati attivati brevemente con il lipopolysaccharide (LPS). Abbiamo dimostrato che cellule di B primarie LPS-attivato possono trasfettate con siRNA a relativamente alta efficienza (cioè, tale che lo svuotamento della proteina può essere rilevato dall'immunoblotting), che li rende una buona alternativa all'uso di linee di cellule di B per alcuni studi 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 mouse B-lymphoma cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>Heat inactivate at 56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C for 30 min</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Liquid, 10,000 units</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional materials for primary B cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS from &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;0111:B4</td></tr><tr><td>B cell-activating factor (BAFF)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;Cell&lt;/strong&gt; 109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Recommended transfection reagents and equipment &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Follow the manufacturer&#039;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program L-013 used</td></tr><tr><td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coating coverslips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>Dissecting extra fine splinter forceps</td></tr><tr><td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>For A20 cells</td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>For primary mouse B cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Without DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution software</td><td>Scientific Voume Imaging</td><td></td><td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

Cellule di B che si legano agli antigeni di membrana-limiti (per esempio, sulla superficie di una cellula presentanti l'antigene) formano una sinapsi immuni, una struttura cellulare specializzata che ottimizza la segnalazione della B-cellula recettore (BCR) e acquisizione di antigene BCR-mediata. Il rimodellamento del citoscheletro di actina e il riorientamento della rete dei microtubuli verso il sito di contatto dell'antigene sono essenziali per la formazione della sinapsi immuni. Rimodellamento del citoscheletro in un denso anello periferico di F-actina è accompagnata dalla polarizzazione del centro di organizzazione dei microtubuli verso la sinapsi immune. Proteine leganti plus-fine dei microtubuli, come pure proteine corticale plus-fine acquisizione mediano interazioni fisiche tra il cytoskeletons actina e dei microtubuli, che consentono loro di essere riorganizzata in modo coordinato. Chiarire i meccanismi che questa riorganizzazione del citoscheletro, nonché a comprendere come queste strutture citoscheletriche forma formazione della sinapsi immuni e BCR di segnalazione, di controllo può fornire nuove intuizioni l'attivazione delle cellule B. Ciò è stata facilitata dallo sviluppo di approcci di microscopia di Super-risoluzione che rivelano nuovi dettagli di organizzazione della rete del citoscheletro. Descriviamo qui un metodo per l'utilizzo di microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine transfected GFP-etichettato microtubuli in cellule di B. Per modellare i primi eventi nella formazione della sinapsi immuni, permettiamo a cellule B a diffondersi sulle lamelle ricoperte di anticorpi (anti-Ig) anti-immunoglobulina, che avviano la segnalazione di BCR e rimodellamento del citoscheletro. Forniamo dettagliate protocolli per esprimere proteine di fusione di GFP in cellule di B-linfoma A20, per la diffusione di anti-Ig-indotta delle cellule e per la fissazione delle cellule successive, Immunostaining, acquisizione di immagini e passaggi di deconvoluzione di immagine. Le immagini ad alta risoluzione ottenute utilizzando queste procedure permettono di visualizzare contemporaneamente l'actina strutture, i microtubuli e proteine obbligatorie plus-fine dei microtubuli che possono collegare queste due reti del citoscheletro.

Per le cellule B diffusione su immobilizzato anti-Ig, microscopia STED utilizzata in combinazione con il software di deconvoluzione fornisce immagini ad alta risoluzione delle strutture citoscheletriche di microscopia confocale. Questo è evidente nella Figura 1, dove la rete di F-actina è stata visualizzata mediante il protocollo descritto sopra. Un confronto tra confocale e immagini ad alta super-risoluzione STED dello stesso esempio illustra che le immagi...

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Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di microscopia STED contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine dei microtubuli in cellule di B che si sono diffuse sulle lamelle rivestite con gli anticorpi per il recettore delle cellule B, un modello per la fase iniziale di formazione della sinapsi immuni.

Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

13.7K Views.  University of British Columbia. Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di microscopia STED contemporaneamente strutture di actina di immagine, microtubuli e proteine leganti plus-fine dei microtubuli in cellule di B che si sono diffuse sulle lamelle rivestite con gli anticorpi per il recettore delle cellule B, un modello per la fase iniziale di formazione della sinapsi immuni.

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Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualizzazione della immunologica Synapse da Dual Color Time-gated emissione stimolata Depletion (STED) Nanoscopia

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Corticale actina di flusso in cellule T quantificati da spazio-temporale Correlazione Immagine Spettroscopia di Structured Illuminazione Microscopia dati

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Immaginare la sinapsi immunologica umana

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

Source: Zheng, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52502">Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Imaging a super-risoluzione della formazione di sinapsi immunologiche delle cellule NK su un doppio strato lipidico supportato

1. Preparation of Liposomes

	Calculate the amount of chloroform-suspended stock solutions of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Source: Martinelli, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53288">An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Valutazione della topologia immunologica delle sinapsi attraverso l'imaging di cellule vive

1. Preparing Human CD4+&#160;Th1 Effector/Memory T Cells

	Apply a tourniquet to the arm of the donor, wipe the vein with alcohol, and insert a needle. ...

Visualizzando l'actina e Cytoskeletons dei microtubuli alla sinapsi della B-cellula Immune usando la microscopia di svuotamento (STED) emissione stimolata

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