Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Nous remercions l’UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging Facility pour soutenir et maintenir le microscope STED. Ce travail a été financé par subvention #68865 de l’instituts de recherche en santé du Canada (de M.R.G.). Nous remercions m. Kozo Kaibuchi (Université de Nagoya, Nagoya, Japon) pour le plasmide CLIP-170-GFP.

Toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’University of British Columbia Animal Care Committee.
1. exprimant des protéines de GFP-fusion dans les cellules A20 B-lymphome
<ol><li>Toutes les cellules A20 en culture en milieu RPMI (RPMI 1640, additionné de 10 % inactivés par la chaleur bovine sérum fœtal (SVF), 50 µM 2-mercaptoéthanol, 2 mM de glutamine, pyruvate de 1 mM, 50 U/mL de pénicilline et 50 µg/mL de streptomycine) à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire avec 5 % De CO2.</li>
	<li>Préparer le réactif de transfection (voir la Table des matières) selon les instructions du fabricant. Remarque : Ce protocole a été optimisé pour les réactifs spécifiques et de protocole de transfection décrit dans la Table des matières. Les autres réactifs de transfection que nous avons essayé n’ont pas donné suffisamment efficacité de transfection.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugeuse 2,5 x 106 A20 cellules (pour chaque transfection) pendant 5 min à 525 x g. remettre en suspension les cellules dans 100 µL de réactif de transfection contenant de 1 à 2,5 µg d’ADN plasmidique. Pour l’ADN codant la GFP-170-CLIP23, utilisez 2,5 µg par transfection. Mélanger doucement.</li>
	<li>Les cellules de transfert vers un puits d’une plaque 6 puits, puis réglez le volume à 2 mL avec préchauffé milieu RPMI complet. La culture des cellules pendant 18 heures à 37 ° C, afin de permettre l’expression de la protéine.</li>
</ol>2. isoler les cellules de souris primaire B et leur activation au LPS
<ol><li>Utiliser des outils chirurgicaux stérilisés pour retirer la rate de souris, suivant les protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux de l’institution.</li>
	<li>Dans la hotte de culture tissulaire, placer une passoire de cellule stérile 70 µm dans une boite de culture de tissus de 35 mm contenant 3 mL de PBS stérile de la température ambiante. Utilisez la partie en caoutchouc du piston d’une seringue de 5 ml pour écraser la rate à travers la crépine de la cellule.</li>
	<li>Pipette la suspension monocellulaire de splenoctyes dans un tube stérile de 15 mL et centrifuger à 525 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Utiliser une isolation magnétique base perle B cell kit (voir Table des matières) pour obtenir une population fortement enrichie des cellules B.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules B à 3 x 10,6/ml en milieu RPMI complet complété avec 2,5 µg/mL LPS plus facteur (BAFF ; une cytokine de survie) d’activation de cellules de B de 5 ng/mL.</li>
	<li>Culture des cellules de 6 heures à 37 ° C.</li>
</ol>3. revêtement couvre-objet en verre avec des anticorps Anti-Ig
<ol><li>Préparer la solution d’anticorps pour enduire les lamelles couvre-objet. Diluer la solution mère d’anticorps Ig anti-chèvre-souris en température ambiante de PBS stérile pour préparer une solution à 12,5 µg/mL ; 400 µL de solution d’anticorps est requis pour chaque lamelle couvre-objet. Remarque : Utilisez la anti-souris IgG de chèvre pour cellules A20 ; Utilisez chèvre anti-souris IgM pour les cellules de B primaires. Les anticorps IgG de chèvre ne lient pas bien aux récepteurs de Fc de souris. Toutefois, pour éviter toute éventuelle liaison aux récepteurs Fc, on peut utiliser F(ab) ou f2 fragments de anti-souris IgG ou des anticorps IgM anti-souris.</li>
	<li>Tremper une lamelle de verre rond 18 mm #1.5 à 100 % de méthanol et laissez-le sécher complètement (~ 10 min).</li>
	<li>Avec une pincette, placer la lamelle séchée dans une culture de tissu de 12 puits plaque et pipette 400 µL de 12,5 µg/mL anticorps solution (5 µg total ; 2 µg/cm2) sur la lamelle couvre-objet pour qu’il forme une bulle au centre de la lamelle et s’étend jusqu’aux bords.</li>
	<li>Veillez à couvrir la lamelle entière, mais ne permettent pas la solution d’anticorps pour s’étendre au delà du bord de la lamelle de verre et sur le plastique de culture de tissus. Incuber à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Laver les lamelles de pipetage 1 mL de PBS stérile dans le bien et par la suite aspirer la solution. Répéter deux fois plus d’enlever les anticorps non fixés.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de PBS stérile dans la cupule contenant la lamelle revêtus d’anticorps jusqu'à ce que les cellules soient prêts à être ajoutés. Remarque : Les lamelles peuvent être conservés à température ambiante, couvert avec du PBS, pour une utilisation sur le même jour.</li>
</ol>4. les lymphocytes B épandage sur Anti-Ig-Coated lamelles couvre-objet
<ol><li>Préparer modifiée HEPES-buffered saline (mHBS) : 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, KCl, 1 mM CaCl2à 5 mM, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, dextrose de 1 mg/mL, 2 mM de glutamine, pyruvate de sodium 1 mM et 50 µM 2-mercaptoéthanol). Filtre stériliser cette solution et conserver à 4 ° C.</li>
	<li>Le jour de l’expérience, faire 50 mL de mHBS avec 2 % SVF (mHBS-BF) en ajoutant 1 mL de FBS inactivés par la chaleur à 50 mL mHBS. Réchauffer le mHBS-FBS à 37 ° C avant utilisation.</li>
	<li>Centrifuger l’A20 transfectées ou les cellules de B primaires qui avaient été cultivées avec BAFF plus LPS à 525 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de mHBS-FBS, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et diluer les cellules à 2 x 105 cellules/mL dans le mHBS-FBS.</li>
	<li>Avec une pincette, transférer la lamelle de la plaque de culture tissulaire sur un morceau de pellicule de paraffine.</li>
	<li>Ajouter 250 µL de cellules de B (5 x 104 cellules) à chaque lamelle couvre-objet.</li>
	<li>Incuber les lamelles à 37 ° C pendant 15 minutes dans l’obscurité pour permettre les cellules B à étaler sur la surface anti-IgG-enduit.</li>
</ol>5. fixation et immunomarquage des cellules
<ol><li>Préparer la solution de fixation par dilution de la solution mère de paraformaldéhyde à 16 % et la solution mère de glutaraldéhyde à 50 % dans de l’eau distillée à température ambiante pour donner une concentration finale de glutaraldéhyde paraformaldéhyde et 0,1 % à 3 %. Préparer la solution de fixation sur la journée que c’est de servir et d’ignorer tout excès. ATTENTION : Les solutions mères paraformaldéhyde et glutaraldéhyde ne doivent servir dans une hotte chimique. Suivez les instructions sur la fiche signalétique (FS).</li>
	<li>Préparer le tampon perméabilisation/blocage (3 % de BSA et 0,1 % Triton X-100 dilué dans du PBS). Filtre stériliser cette solution et conserver à 4 ° C. Le jour de l’expérience, réchauffer la quantité requise à la température ambiante.</li>
	<li>Préparer le tampon de coloration (1 % de BSA et 0,1 % de saponine dans du PBS). Stériliser cette solution filtre 0,2 µm et conserver à 4 ° C. Le jour de l’expérience, réchauffer la quantité requise à la température ambiante.</li>
	<li>Pipette 350 µL de la solution de fixation sur chaque lamelle, veiller à ce que la surface soit entièrement recouverte. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.</li>
	<li>Enlever la solution de fixation de la lamelle couvre-objet en aspirant soigneusement le bord de la lamelle couvre-objet à l’aide d’une micropipette. ATTENTION : La solution de fixation doit être jetée comme des déchets chimiques dangereux.</li>
	<li>Laver les lamelles couvre-objet avec 500 µL de tampon de perméabilisation/blocage. Ajouter le liquide.</li>
	<li>Permeabilize et bloque les cellules en ajoutant 250 µL de tampon de perméabilisation/blocage à chaque lamelle et en incubant pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Diluer l’anticorps anti-tubuline lapin au 1/100 en souillant la mémoire tampon.</li>
	<li>Aspirer au large de la mémoire tampon de perméabilisation/blocage de le lamelles et ajouter 50 µL de la solution d’anticorps anti-tubuline dilué dans chaque lamelle couvre-objet. Incuber à température ambiante pendant 30 min à l’obscurité.</li>
	<li>Préparer la solution de tache d’anticorps secondaire/actine en diluant l’anticorps secondaire IgG anti-lapin de chèvre conjugué Alexa Fluor 532 et la phalloïdine conjugué Alexa Fluor 568 au 1/100 en souillant la mémoire tampon.</li>
	<li>Laver les lamelles 3 fois pour enlever l’excès d’anticorps primaire en ajoutant 500 µL de tampon de coloration et aspirant puis il.</li>
	<li>Ajouter 50 µL de la solution de tache d’anticorps secondaire/actine dans chaque lamelle et incuber 30 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Laver les lamelles 3 fois pour enlever l’excès anticorps secondaire en ajoutant 500 µL de tampon de coloration et aspirant puis il.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de réactif de montage d’une lame de microscope. Monter la lamelle sur la lame de microscope avec le côté de la cellule vers le bas. Remarque : Un support de montage « anti-fade » (voir Table des matières) est fortement recommandé de conserver l’intensité de la fluorescence des protéines de fusion de GFP. Éviter l’utilisation de réactifs contenant DAPI, qui peut interférer avec l’imagerie des fluorophores lors de l’utilisation du laser STED de montage.</li>
	<li>Laisser les lames sécher pendant la nuit dans l’obscurité. L’image de la glisse le lendemain. Remarque : Les diapositives d’imagerie dès que la lamelle est sec est fortement recommandé, comme la fluorescence GFP va diminuer au fil du temps.</li>
</ol>6. l’imagerie utilisant le Microscope STED
Remarque : Veuillez noter que toutes les étapes de logiciel décrites ci-dessous sont spécifiques au microscope et logiciel, nous avons utilisé (voir la Table des matières). Les étapes et paramètres devront être ajustées si l’imagerie est réalisée à l’aide d’un microscope/logiciel différent.
<ol><li>Allumez le microscope STED, activer les lasers et la lampe d’éclairage épifluorescence et lancer le logiciel de microscope.</li>
	<li>Définissez les paramètres pour les lasers de déplétion STED. Remarque : Cela dépendra du microscope spécifique utilisé et les lasers qui elle est équipée. Certains ont recommandé les paramètres sont lumière blanche (WLL) 70 % ; 592 nm laser 80 % ; 660 nm laser 80 %.</li>
	<li>Activer les paramètres STED et aligner les faisceaux laser STED utilisant l’objectif X 100.</li>
	<li>À l’aide de l’oculaire, l’accent de l’échantillon et sélectionnez une cellule avec l’expression de la GFP modérée. NOTE : Expression de la GFP faible sera pas visible car STED réduit l’intensité des émissions. À l’inverse, forte expression de CLIP-170-GFP induit la formation spontanée de grands groupes, qui ne reflète pas la morphologie complexe de protéine plus-fin normale microtubule et la distribution. En sélectionnant une cellule avec l’expression de la GFP modérée est essentiel pour l’imagerie avec précision les structures du cytosquelette sur le site de contact de l’antigène.</li>
	<li>Zoomer dans la cellule sélectionnée et choisissez la région d’intérêt à être photographié. Ajuster le focus pour que le plan x-y de la cellule B qui est plus proche de la lamelle est au point.<ol>
<li>Pour ce faire, placer l’objectif progressivement de la lamelle couvre-objet pour que les structures du cytosquelette cellulaire B puis aller hors du foyer et venir dans le foyer. Puis déplacer progressivement l’objectif dans le sens inverse jusqu'à ce que les structures du cytosquelette cellulaire B tout d’abord revenir dans le foyer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimiser les paramètres, y compris la puissance du laser et faisceau d’excitation détecteur de portée. Commencez avec les paramètres recommandés par le fabricant. Puis faire des ajustements selon les besoins afin d’optimiser le signal pour les échantillons. Tous les échantillons à comparer les uns aux autres avec les mêmes paramètres de l’image.</li>
	<li>Sous l’onglet « acquérir » du logiciel, affectez l’acquisition d’image acquisition de trame séquentielle dans le panneau inférieur gauche « Scan séquentiels » en cochant l’option « entre cadres ».</li>
	<li>Définir la séquence d’acquisition. Remarque : Nous acquérons la fluorescence GFP tout d’abord afin d’éviter la dégradation du signal GFP. Selon la combinaison des fluorophores utilisés en plus de la GFP, le signal de fluorescence plus longs longueur d’onde d’imagerie tout d’abord peut donner de meilleurs résultats. Toutefois, l’ordre dans lequel les fluorophores ou protéines fluorescentes sont soumis à l’épuisement de l’émission stimulée et imagés doit être optimisé pour obtenir les plus forts signaux de fluorescence et la meilleure résolution.</li>
	<li>Sélectionner et régler la puissance de laser STED pour chaque fluorophore sous l’onglet « Acquérir » du logiciel et utilisez la barre de défilement pour le 592 nm ou le laser STED de 660 nm pour ajuster la puissance du laser. Régler la puissance du laser de déplétion 592 nm pour GFP et Alexa Fluor 532. Régler la puissance du laser de déplétion de 660 nm pour Alexa Fluor 568.</li>
	<li>Pour augmenter la résolution et réduire le signal de fond, allez dans les paramètres « Acquisition » sous l’onglet « Acquire » du logiciel, augmenter la ligne et/ou la trame en moyenne en sélectionnant une valeur supérieure à 1 en utilisant le menu déroulant pour chaque option.</li>
	<li>En outre, acquérir le signal fluorescent utilisant STED temps-dépendants en cochant l’option de blocage pour le fluorophore sous l’onglet « Acquérir », en indiquant les valeurs pour cloisonnement temps (voir note ci-dessous). Augmenter la puissance du laser STED pour améliorer la résolution, mais cela augmentera également le photoblanchiment des fluorophores. Remarque : Le temps de blocage devra être optimisé pour le microscope, échantillon et fluorophores utilisés. Un blocage de temps de 0,3 à 6 ns est recommandé. Après fixation, GFP est particulièrement sensible aux laser haute puissance. Pour réduire le photoblanchiment de GFP, temps de déclenchement doit être appliquée et la puissance du laser STED devrait être réduite.</li>
	<li>Pour capturer des images 3D de STED, utilisez le curseur pour modifier le point de fonction (PSF) d’étalement pour « STED 3D ».</li>
	<li>Manuellement l’acquisition des images multiples pour assurer la reproductibilité. Donne les images (voir Figure 1) en utilisant un logiciel de déconvolution paquet41(voir Table des matières).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation.">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).</li><li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation.">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+B+cell+activation.">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling.">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts:+Synapses+and+Kinapses.">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse.">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses.">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses.">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunter+to+gatherer+and+back:+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion.">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk:+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling.">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li><li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing.">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster.">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion.">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li><li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse.">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+organization+and+dynamics:+two+ends+in+the+limelight.">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule++TIPs+at+a+glance.">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li><li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170.">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity.">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li><li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des images détaillées des structures du cytosquelette peuvent être obtenus à l’aide de la microscopie STED Super-résolution, qui peut théoriquement atteindre une résolution de 50 nm, par rapport à la microscopie confocale classique, pour lequel la résolution diffraction-limited est ~ 200 nm 24. la capacité de résoudre des structures plus fines est encore améliorée en utilisant un logiciel de déconvolution pour calculer la position très probablement de la source lumineuse originale...

Quand les cellules B lient à polarisé tableaux d’antigènes (p. ex., affichés sur l’aire des présentatrices d’antigène cellules (CPA)), le récepteur des cellules B (BCR) qui en résulte la formation d’une structure classique de synapse immunitaire, qui a été décrit dans les disques de signalisation T les cellules1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Au départ, amas de forme de RCO antigène liée à la périphérie de la cellule B : APC Contactez le site. Ces amas se déplacent ensuite vers le centre du site contact de l’antigène, où ils se fondre en une grappe d’activation supramoléculaire central (cSMAC) qui constitue le noyau de la synapse immunitaire. La formation des synapses immunitaire optimise la signalisation de la BCR et facilite l’extraction induite par la BCR l’antigène de la membrane APC14. Cette acquisition d’antigène, qui est suivie de l’internalisation médiée par BCR antigène et du traitement subséquent de l’antigène, permet aux cellules de B de présenter peptide : MHC complexes II aux cellules T et susciter des lymphocytes T aide14. Parce que la formation des synapses immunitaire favorise l’activation des lymphocytes B, élucider les mécanismes qui établissent que ce schéma fonctionnel de l’organisme récepteur peut fournir de nouveaux aperçus de comment d’immunité humorale sont initiées ou réglementés.
Réorganisation de l’actine et microtubules cytosquelettes est essentielle pour la formation des synapses immunitaire. BCR localisé signalisation stimulée par un tableau polarisé dans l’espace des antigènes induit rapide et spectaculaire de remodelage de l’actine cytosquelette1,15. La formation de structures dendritiques actine à la périphérie de la cellule B exerce des forces poussant sur la membrane plasmique et favorise la propagation des cellules B. Cela permet à la cellule B balayer une surface plus grande de la surface de l’antigène-roulement et augmente le nombre des RCO qui se lient à l’antigène et activer la BCR, voies de signalisation. Dans le même temps, la MTOC et le réseau de microtubules sont réorientés vers le site de contact de l’antigène. La MTOC approche le site contact de l’antigène, les microtubules émanant de la MTOC s’étendent le long de la face interne de la membrane plasmique à l’interface entre la cellule de B et de l’antigène-roulement surface16,17. Ces microtubules juxtamembrane peuvent alors servir de pistes pour le mouvement centripète dynéine-mediated de liaison antigène BCR amas18, conduisant à la formation d’un cSMAC.
La réorientation et la polarisation de la MTOC vers la synapse immunitaire nécessite l’actine intact et cytosquelettes des microtubules et dépend souvent des interactions entre l’actine corticale réseau et les microtubules16,17, 19,20. Protéines actine corticales, tels que IQGAP1, peuvent capturer des microtubules en interagissant avec des complexes protéiques qui décorent les microtubules plus-extrémités21. Ces dynamiques complexes de protéines liant le bout plus incluent EB1 et CLIP-170, qui sont collectivement désignés comme les microtubules plus-fin suivi de protéines (+ conseils)21,22. + Conseils aux extrémités des microtubules peuvent se lier aux protéines qui sont associées à la membrane plasmique ou le cytosquelette d’actine corticale. Cela permet les mécanismes générateurs de force (par exemple, la fin du moins de mouvement de dynéine corticalement ancrés le long des microtubules dirigé) pour exercer une force de traction sur les microtubules et ainsi replacer la MTOC. CLIP-170 peut se lier à la protéine d’échafaudage associées à l’actine IQGAP123, et nous avons montré que tous les deux de ces protéines sont nécessaires pour la polarisation induite par le BCR MTOC vers la synapse immunitaire17. Cette interaction IQGAP1-CLIP-170 peut jouer un rôle clé dans le remodelage du cytosquelette d’actine avec le repositionnement de la réseau de microtubules à la synapse immunitaire de B-cellule de coordination.
La microscopie en fluorescence conventionnelle a révélé la réorganisation dramatique de l’actine et des microtubules cytosquelettes lors de B-cellule immunitaire synapse formation2. Toutefois, cette approche ne peut pas résoudre les petites structures cellulaires en détail en raison de la limite de diffraction de la lumière, qui, conformément à la Loi de l’Abbe, dépend de la longueur d’onde de la lumière utilisée pour éclairer l’échantillon et l’ouverture de l' objectif24. Cette limite de diffraction limite la résolution des microscopes à lumière conventionnelles à 200-300 nm dans le sens latéral et de 500 à 700 nm dans le sens axial25. Par conséquent, plus petites structures subcellulaires, ainsi que les détails fins de l’actine et des microtubules cytosquelettes, pourraient être observées seulement au microscope électronique. Microscopie imagerie du cytosquelette prend du temps, nécessite des protocoles de fixation et préparation de témoin sévères qui peuvent altérer les structures biologiques et sont limite à médiée par les anticorps de détection. La capacité de réagissent et simultanément plusieurs protéines d’image ou de structures cellulaires est un avantage considérable de la microscopie de fluorescence. Par ailleurs, exprimant des protéines de fusion fluorescent dans des cellules permet une imagerie en temps réel et est utile lorsque des anticorps efficaces pour immunostaining la protéine d’intérêt ne sont pas disponibles.
Les progrès technologiques récents en microscopie de Super-résolution ont dépasser les limites de la diffraction de la lumière et a permis la visualisation des nano structures cellulaires24. Une telle technique de microscopie de Super-résolution est appelée émission stimulée épuisement (STED) microscopie. STED emploie deux lasers, où un seul laser excite le fluorophore et un deuxième laser avec un motif en forme de beignet sélectivement supprime l’émission de fluorescence autour le fluorophore. Ceci réduit la fonction de point-propagation (zone apparente) d’une seule particule fluorescente et fournit une diffraction sous limite image fluorescente25,26. Microscopie de l’appauvrissement de l’état fondamental emploie également basés sur la fluorescence des techniques d’acquisition d’images de Super-résolution. Cependant, les temps d’acquisition et de la reconstruction image sont longs, il y a seulement un nombre limité de fluorophores qui peut être utilisés, et l’imagerie haute résolution simultanée de plusieurs composants du cytosquelette est techniquement difficile parce qu’il est maintenant structures d’actine et les microtubules nécessite des procédures différentes de fixation. Par conséquent, STED a plusieurs avantages par rapport à la microscopie électronique et autre microscopie Super-résolution s’approche car elle offre d’acquisition d’images rapide, a des exigences minimales de post-traitement et emploie les mêmes fluorophores et techniques de coloration qui sont utilisés pour la microscopie de fluorescence conventionnels d’échantillons fixe26.
Super-résolution microscopie a maintenant été utilisée pour visualiser des structures de l’actine à la synapse immunitaire aux cellules tueuses naturelles de (NK) et T cellules26,27,28,29,30, 31. Toutefois, imagerie de Super-résolution du cytosquelette de microtubules, ainsi que la réorganisation coordonnée de l’actine et des microtubules cytosquelettes au cours de la formation des synapses immune, a seulement récemment rapporté17. Nous avons utilisé la microscopie STED pour les cellules d’image B qui avaient été autorisées à diffuser sur les lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui stimulent la BCR de signalisation et de lancer la réorganisation du cytosquelette. Quand plaqué sur les anticorps anti-Ig immobilisés, les cellules B subissent dramatique s’étalant actine-dépendante, qui récapitule les événements initiaux au cours de la formation des synapses immunitaire. Ce qui est important, la microscopie STED a révélé les détails de l’anneau dendritique d’actine-F qui se forme à la périphérie du système immunitaire font synapse et a montré que la MTOC, ainsi que les microtubules attachées à elle, avaient déménagé à proximité de l’antigène contact site17. Ces microtubules étendu vers l’extérieur vers l’anneau périphérique d’actine-F. En outre, imagerie STED multicolore de diverses combinaisons de F-actine, tubuline, IQGAP1 et GFP-étiquetée CLIP-170 + conseils ont montré que les microtubules plus-extrémités marquées par CLIP-170-GFP étaient étroitement liés avec le réseau d’actine périphérique et IQGAP1, un corticale capture protéines17.
Nous présentons ici un protocole détaillé d’imagerie de l’actine et des microtubules cytosquelettes à la synapse immunitaire à l’aide de la microscopie STED. Ces méthodes ont été optimisées en utilisant la ligne de murin B cellule A20, qui a été largement utilisée pour l’étude de signalisation de la BCR et synapse immunitaire formation17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. parce que les anticorps commerciaux à CLIP-170 ne fonctionnent pas bien pour l’immunomarquage dans des expériences antérieures, nous décrivons en détail l’expression de la GFP-étiquetée CLIP-170 dans les cellules A20, ainsi que de protocoles pour visualiser simultanément jusqu'à la coloration trois éléments du cytosquelette ou protéines associées au cytosquelette. Méthodes pour l’utilisation de la microscopie STED à l’actine image aux synapses immunitaires de cellules NK ont été décrits précédemment40. Ici, nous étendre cela à acquérir des images de Super-résolution multicolore de cytosquelettes fois l’actine et les microtubules dans les cellules de B.
Un facteur critique pour la microscopie de Super-résolution est en utilisant les procédures de fixation appropriés pour le maintien des structures cellulaires et prévenant les dommages aux protéines fluorescentes. La fixation et coloration des méthodes présentées ici ont été optimisés afin de conserver la fluorescence GFP et fournir une imagerie des réseaux actine et les microtubules. En exprimant des protéines fluorescentes, il convient de noter que les cellules B sont généralement difficiles à transfecter. Utilisant ce protocole, 20-50 % de l’A20, cellules expriment généralement la protéine de fusion de GFP transfectée, et parmi cette population, les niveaux d’expression de protéine sont variables. Néanmoins, l’imagerie Super-résolution d’actine et les microtubules en utilisant les procédures que nous décrivons est assez robuste et sont facilement obtenir des images de haute qualité. Malgré leur petite taille par rapport aux cellules A20, nous montrons que ces procédures peuvent également servir à l’image du réseau de microtubules dans les cellules de B primaires qui ont été brièvement activés avec le lipopolysaccharide (LPS). Nous avons montré qu’activés par le LPS des cellules de B primaires peuvent être transfectées avec siARN à relativement haute efficacité (c.-à-d., tels que l’appauvrissement de protéine peut être détectée par immunoblotting), ce qui les rend une bonne alternative à l’utilisation de lignées cellulaires B pour certaines études 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 mouse B-lymphoma cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>Heat inactivate at 56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C for 30 min</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Liquid, 10,000 units</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional materials for primary B cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS from &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;0111:B4</td></tr><tr><td>B cell-activating factor (BAFF)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;Cell&lt;/strong&gt; 109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Recommended transfection reagents and equipment &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Follow the manufacturer&#039;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program L-013 used</td></tr><tr><td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coating coverslips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>Dissecting extra fine splinter forceps</td></tr><tr><td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>For A20 cells</td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>For primary mouse B cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Without DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution software</td><td>Scientific Voume Imaging</td><td></td><td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

Les lymphocytes B qui se lient aux antigènes membranaires (par exemple, sur la surface d’une cellule de présentatrices) forment une synapse immunitaire, une structure cellulaire spécialisée qui optimise la signalisation de cellules B récepteur (BCR) et acquisition d’antigène induite par la BCR. Le remodelage du cytosquelette d’actine et de la réorientation de la réseau de microtubules vers le site de contact de l’antigène sont essentiels pour la formation des synapses immunitaire. Remodelage du cytosquelette d’actine dans un anneau périphérique dense d’actine-F est accompagnée par la polarisation du pôle Organisation des microtubules vers la synapse immunitaire. Protéines microtubule bout plus contraignantes, ainsi que les protéines corticale plus-fin capture la médiation des interactions physiques entre l’actine et des microtubules cytosquelettes, qui leur permettent d’être réorganisé de manière coordonnée. Élucider les mécanismes que cette réorganisation du cytosquelette, mais aussi comprendre comment ces structures du cytosquelette façonner la formation des synapses immunitaire et BCR de signalisation, de contrôle peuvent apporter un nouvel éclairage sur l’activation des lymphocytes B. Cela a été favorisé par l’élaboration de méthodes de microscopie de Super-résolution qui révèlent de nouveaux détails de l’organisation en réseau du cytosquelette. Nous décrivons ici une méthode pour microscope émission stimulée épuisement (STED) simultanément les structures image actine, microtubules et plus-fin transfectées GFP-étiquetée microtubule protéines dans les cellules de B. Pour modéliser les événements précoces dans la formation des synapses immunitaire, nous laisser diffuser sur lamelles enduites d’anticorps de anti-l’immunoglobuline (anti-Ig), qui déclenchent la BCR de signalisation et de remodelage du cytosquelette des cellules B. Nous fournissons des protocoles étape par étape pour exprimer les protéines de fusion de GFP dans des cellules A20 B-lymphome, pour la diffusion cellulaire induite par l’anti-Ig et pour la fixation ultérieure de cellule, immunomarquage, acquisition d’images et image déconvolution étapes. Les images haute résolution obtenues à l’aide de ces procédures permettent de visualiser simultanément les structures de l’actine, les microtubules et les protéines de liaison de plus en bout de microtubules qui peuvent lier ces deux réseaux du cytosquelette.

Pour les cellules de B épandage sur immobilisé anti-Ig, microscopie STED utilisée en conjonction avec le logiciel de déconvolution fournit des images de résolution supérieure des structures du cytosquelette de microscopie confocale. Cela est évident dans la Figure 1, où le réseau d’actine F a été visualisé en utilisant le protocole décrit ci-dessus. Une comparaison des confocale et STED Super-résolution images du même échantillon montre que ...

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Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

visualizing-actin-microtubule-cytoskeletons-at-b-cell-immune-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

13.7K vues.  University of British Columbia. Nous présentons un protocole pour microscopie STED simultanément les structures image actine, microtubules et protéines microtubule bout plus contraignantes dans les cellules de B qui se sont propagés sur lamelles recouvertes d’anticorps dirigés contre le récepteur des cellules B, un modèle pour la phase initiale de formation de la synapse immunitaire.

Vidéo: Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualisation du immunologique Synapse par double couleur Temps-dépendants émission stimulée épuisement (STED) nanoscopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Recherche

Immunologie et infection

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-résolution de l&#39;imagerie cellulaire Synapse immunologique Natural Killer sur un verre soutenu par Planar lipidique en deux couches

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Une cellule endothéliale Planar Modèle for Imaging Dynamics Synapse immunologique

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Actine corticale Débit en cellules T quantifiée par spatio-temporelle image spectroscopie par corrélation de Structured Illumination Microscopy données

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analyse qualitative et Quantitative de la Synapse immunitaire dans le système humain à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Étudier la dynamique d'Organelle dans les cellules B pendant la formation immunitaire de synapse

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Imagerie de la synapse immunologique humaine

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

Source: Zheng, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52502">Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Imagerie à super-résolution de la formation de synapses immunologiques de cellules NK sur une bicouche lipidique supportée

1. Preparation of Liposomes

	Calculate the amount of chloroform-suspended stock solutions of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Source: Martinelli, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53288">An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Évaluation de la topologie immunologique des synapses par l’imagerie de cellules vivantes

1. Preparing Human CD4+&#160;Th1 Effector/Memory T Cells

	Apply a tourniquet to the arm of the donor, wipe the vein with alcohol, and insert a needle. ...

Visualisation de l’actine et microtubules cytosquelettes à la Synapse immunitaire de B-cellule émission stimulée par épuisement (STED) microscopie

Résumé

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