Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

אנו מודים המתקן הדמיה מכון מדעי החיים UBC (LSI) תמיכה ולשמירה על המיקרוסקופ STED. עבודה זו מומן על ידי מענק #68865 מן המכון הקנדי של בריאות המחקר (M.R.G.). אנו מודים Kozo Kaibuchi ד ר (אוניברסיטת נאגויה, נגויה, יפן) על פלסמיד הקליפ-170-GFP.

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת קולומביה הבריטית חיה טיפול הוועדה.
1. הבעת GFP-fusion חלבונים בתאים A20 B-לימפומה
<ol><li>התרבות התאים A20 ב להשלים RPMI בינוני (RPMI-1640 בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS), 50 מיקרומטר מרקפטואתנול, גלוטמין 2 מ מ, פירובט 1 מ מ, 50 פניצילין U/mL ו- 50 סטרפטומיצין µg/mL)-37 מעלות צלזיוס חממה תרביות רקמה עם 5 % CO2.</li>
	<li>הכנת תקנים הכימית (ראה את הטבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן. הערה: פרוטוקול זה הותאם מבחינת ריאגנטים ספציפיים, תרביות תאים פרוטוקול המתוארות בטבלה של חומרים. אחרים ריאגנטים תרביות תאים זה ניסינו לא הניבו מספיק תקנים יעילות.</li>
	<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה 2.5 x 10 תאים6 A20 (עבור כל תרביות תאים) עבור 5 דקות ב 525 x g... Resuspend תאי µL 100 של ריאגנט תרביות תאים המכיל 1-2.5 µg של פלסמיד ה-DNA. ה-dna קידוד הסרטון-170-GFP23להשתמש µg 2.5 לפי תקנים. מערבבים בעדינות.</li>
	<li>להעביר את התאים טוב של צלחת 6-ובכן, לכוונן את עוצמת הקול עד 2 מ"ל מראש ומחוממת בינונית RPMI מלאה. התרבות התאים עבור 18 h ב 37 ° C כדי לאפשר ביטוי חלבון.</li>
</ol>2. בידוד העכבר הראשי B תאים והפעלת אותם עם LPS
<ol><li>להשתמש בכלים סטיריליים כירורגי להסיר את הטחול עכבר, בעקבות פרוטוקולים אושרו על ידי ועדת אכפת לי חיה של המוסד.</li>
	<li>בשכונה תרביות רקמה, מניחים מסננת תא 70 סטרילי-מיקרומטר לתוך תבשיל תרביות רקמה 35 מ מ המכיל 3 מ"ל של PBS סטרילי בטמפרטורת החדר. להשתמש בחלק גומי הבוכנה של מזרק 5-ml לרסק את הטחול דרך מסננת התא.</li>
	<li>Pipet התליה תא בודד של splenoctyes לתוך צינור 15-mL סטרילי צנטריפוגה ב 525 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>שימוש בידוד תא B מגנטיים מבוססי חרוז קיט (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבל אוכלוסייה מועשר של תאי B.</li>
	<li>Resuspend תאי B כדי 3 x 106/mL בינוני RPMI מלאה בתוספת 2.5 µg/mL LPS פלוס 5 ng/mL תא B הפעלת פקטור (BAFF; של ציטוקין הישרדות).</li>
	<li>התרבות התאים במשך 6 שעות ב 37 º C.</li>
</ol>3. ציפוי coverslips זכוכית דקה עם נוגדנים Anti-Ig
<ol><li>היכונו ציפוי coverslips את הפתרון נוגדן. לדלל את הפתרון מניות של עז-נגד-עכבר נוגדנים Ig לתוך בטמפרטורת החדר PBS סטרילי כדי להפוך את פתרון µg/mL 12.5; µL 400 של נוגדן פתרון נדרש עבור כל coverslip. הערה: השתמש בעכבר נגד עז IgG על תאים A20; השתמש בעכבר נגד עז IgM על ראשי B תאים. נוגדנים עז אג מאגד טוב לקולטנים Fc העכבר. עם זאת, כדי למנוע כל איגוד קולטן Fc פוטנציאליים, אחד ניתן להשתמש F(ab) או F(ab')2 שברי העכבר אנטי איג או נוגדנים IgM anti-עכבר.</li>
	<li>לטבול coverslip 18 מ מ זכוכית עגול #1.5 ב- 100% מתנול והנח לו להתייבש לגמרי (~ 10 דקות).</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, המקום של coverslip מיובשים לתוך תרביות רקמה 12-ובכן צלחת, pipet 400 µL של 12.5 µg/mL נוגדן הפתרון (סה כ µg 5; µg/cm 22) על גבי coverslip כך זה טפסים בועה במרכז coverslip ומשרת את הקצוות.</li>
	<li>להקפיד לכסות את coverslip כולו, אך אינם מאפשרים את הפתרון נוגדן להרחיב מעבר לקצה של coverslip של זכוכית, על גבי הפלסטיק תרביות רקמה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.</li>
	<li>לשטוף את coverslips מאת pipetting 1 מ"ל של PBS סטרילי לתוך טוב ובעקבות כך כ רפה בעברית את הפתרון. חזור עוד פעמיים כדי להסיר נוגדנים לא מאוגד.</li>
	<li>להוסיף טוב המכיל את coverslip מצופים נוגדן עד תאים מוכן להוסיף 1 מ"ל של PBS סטרילי. הערה: coverslips ניתן לשמור בטמפרטורת החדר, מכוסה PBS, לשימוש באותו יום.</li>
</ol>4. תא B הפצת על Coverslips אנטי איג-מצופים
<ol><li>להכין ששינה באגירה HEPES מלוחים (mHBS): 25 מ מ HEPES, pH 7.2, 125 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 1 מ"מ CaCl2, 1 מ מ נה2HPO4, MgSO 0.5 מ מ4, 1 מ"ג/מ"ל דקסטרוז, גלוטמין 2 מ מ, 1 מ מ נתרן פירובט, ו- 50 מיקרומטר מרקפטואתנול). מסנן לעקר את פתרון זה ולאחסן ב 4 º C.</li>
	<li>ביום של הניסוי, להפוך 50 מ של mHBS עם 2% FBS (mHBS-FBS) על-ידי הוספת 1 מ"ל של חום-לא פעיל FBS mHBS 50 מ ל. לחמם את mHBS-FBS עד 37 ° C לפני השימוש.</li>
	<li>Centrifuge בתאים A20 transfected או בתאים B העיקרי היה כבר תרבותי BAFF בתוספת LPS ב 525 g x במשך 5 דקות.</li>
	<li>Resuspend תאי 1 מ"ל של mHBS-FBS, לספור את התאים באמצעות hemocytometer ו לדלל את התאים 2 x 105 תאים/מ ב- mHBS-FBS.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להעביר את coverslip מהצלחת תרביות רקמה חתיכת סרט פרפין.</li>
	<li>להוסיף 250 µL של תאים B (5 x 104 תאים) כל coverslip.</li>
	<li>דגירה על coverslips ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בחושך כדי לאפשר בתאי B להתפשט על-פני השטח נגד אג-מצופים.</li>
</ol>5. תיקון, Immunostaining התאים
<ol><li>להכין את הפתרון קיבעון על ידי דילול הפתרון מניות 16% paraformaldehyde הפתרון גלוטראלדהיד 50% מניות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר להניב הסופי ריכוזי גלוטראלדהיד 3% paraformaldehyde ו- 0.1%. הכינו את הפתרון קיבוע ביום שזה כדי לשמש ולמחוק כל עודף. התראה: paraformaldehyde ופתרונות מניות גלוטראלדהיד אמורה לשמש רק בשכונה fume כימי. בצע את ההוראות על גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS).</li>
	<li>הכנת המאגר חוסם/permeabilization (BSA 3% ו- 0.1% טריטון X-100 מדולל ב- PBS). מסנן לעקר את פתרון זה ולאחסן ב 4 º C. ביום של הניסוי, לחמם את הסכום הנדרש לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכנת המאגר מכתימים (1% BSA ו- 0.1% סאפונין ב- PBS). לעקר את הפתרון הזה באמצעות מסנן 0.2 µm ולאחסן ב 4 º C. ביום של הניסוי, לחמם את הסכום הנדרש לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>Pipet 350 µL של הפתרון קיבעון על כל coverslip, המבטיח כי השטח מכוסה לגמרי. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות בחושך.</li>
	<li>הסר הפתרון קיבוע coverslip על ידי בקפידה כ רפה בעברית מקצה coverslip באמצעות micropipet. התראה: הפתרון קיבוע צריכים להיות מושלך כפסולת כימיים מסוכנים.</li>
	<li>לשטוף את coverslips פעם אחת עם 500 µL permeabilization/חסימת המאגר. Pipet את הנוזל.</li>
	<li>Permeabilize וחסום את התאים על ידי הוספת µL 250 permeabilization/חסימת מאגר כל coverslip, המקננת 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לדלל את בטחונות נוגדן אנטי-טובולין ארנב ב מכתים מאגר.</li>
	<li>וארוקן את המאגר חוסם/permeabilization מ coverslips, ולהוסיף 50 µL של הפתרון מדולל נוגדן אנטי-טובולין כל coverslip. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.</li>
	<li>הכן הפתרון הכתם נוגדנים משניים/אקטין על ידי דילול עז מצומדת אלקסה עבור חיל הים 532 ארנב אנטי איג נוגדן משני והן phalloidin מצומדת אלקסה עבור חיל הים 568 בטחונות ב מכתים מאגר.</li>
	<li>לשטוף את coverslips 3 פעמים כדי להסיר את עודף נוגדן ראשוני על-ידי הוספת µL 500 של צביעת מאגר, ואז כ רפה בעברית.</li>
	<li>הוסף µL 50 של הפתרון הכתם נוגדנים משניים/אקטין coverslip כל ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>לשטוף את coverslips 3 פעמים כדי להסיר עודפי נוגדנים משניים על-ידי הוספת µL 500 של צביעת מאגר, ואז כ רפה בעברית.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של ריאגנט הרכבה שקופית מיקרוסקופ. לטעון את coverslip על גבי השקופית מיקרוסקופ עם הצד תא למטה. הערה: בינוני "אנטי לדעוך" הרכבה (ראה טבלה של חומרים) מומלץ מאוד כדי לשמר את עוצמת קרינה פלואורסצנטית GFP פיוז'ן חלבונים. הימנע משימוש גובר ריאגנטים המכיל דאפי, אשר עלולים להפריע ההדמיה של fluorophores כאשר באמצעות הלייזר STED.</li>
	<li>לאפשר שהשקופיות לילה יבש בחושך. תמונה של השקופיות למחרת. הערה: הדמיה של השקופיות, ברגע coverslip זה יבש מומלץ מאוד, כמו ידי קרינה פלואורסצנטית GFP יתמעטו עם הזמן.</li>
</ol>6. הדמיה באמצעות המיקרוסקופ STED
הערה: אנא שימו לב כי כל תוכנה השלבים המתוארים להלן ספיציפית המיקרוסקופ והתוכנה השתמשנו (ראה את הטבלה של חומרים). הצעדים ואת הגדרות יהיה עליך לכוונן אם דימות מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ/תוכנות שונות.
<ol><li>הפעל המיקרוסקופ STED, להפעיל את לייזרים, מנורה של תאורה epifluorescence, ולאחר הפעלת התוכנה מיקרוסקופ.</li>
	<li>להגדיר את הפרמטרים עבור לייזרים דלדול STED. הערה: זה תלוי המיקרוסקופ ספציפי בשימוש, לייזרים כי הוא מצויד. כמה מומלץ הגדרות הן אור לבן (יקלו) 70%; 592 ננומטר לייזר 80%; 660 ננומטר לייזר 80%.</li>
	<li>להפעיל את ההגדרות STED ויישר את STED של קרני לייזר באמצעות המטרה X 100.</li>
	<li>באמצעות העיינית של המצלמה, למקד את הדגימה ובחר תא עם ביטוי GFP מתונה. הערה: הביטוי GFP נמוך לא יהיו גלויים כי STED מקטין את עוצמת הפליטה. לעומת זאת, ביטוי גבוהה של קליפ-170-GFP גורם היווצרות ספונטנית של אשכולות גדולים, אשר אינה משקפת את microtubule נורמלי פלוס-end חלבונים מורכבים מורפולוגיה והפצה. בחירת תא עם ביטוי GFP מתונה חיוני במדויק הדמיה המבנים cytoskeletal באתר קשר אנטיגן.</li>
	<li>זום לתוך התא שנבחר ובחרו את האזור עניין לדימות. להתאים את המוקד כך מישור x-y של תא B הקרובה ביותר coverslip נמצא בפוקוס.<ol>
<li>כדי לעשות זאת, להעביר המטרה בהדרגתיות קרוב יותר coverslip כך המבנים cytoskeletal תא B להתמקד ולאחר מכן לצאת משליטה. לאחר מכן בהדרגה להזיז המטרה בכיוון ההפוך עד המבנים cytoskeletal תא B קודם לחזור להתמקד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למטב את ההגדרות כולל את עוצמת הלייזר, עירור קרן טווח הגלאי. להתחיל עם ההגדרות המומלצת לפי הוראות היצרן. ואז לבצע התאמות לפי הצורך כדי למטב את האות על הדגימות. תמונה כל דוגמאות לצורך השוואה אחד לשני את אותן הגדרות.</li>
	<li>תחת הלשונית "לרכוש" של התוכנה, להגדיר את רכישת התמונה רכישת מסגרת רציפים בחלונית התחתונה השמאלית "סרוק סדרתית" על ידי סימון האפשרות "בין מסגרות".</li>
	<li>להגדיר את רצף רכישה. הערה: אנו רוכשים את פלורסצנטיות GFP קודם כדי למנוע השפלה של אות ה-GFP. בהתאם לשילוב של fluorophores המשמשים בנוסף GFP, הדמיה האות פלורסצנטיות אורך גל ארוך יותר קודם, תניב תוצאות טובות יותר. עם זאת, הסדר בו fluorophores או חלבונים פלורסנט הם נתון דלדול פליטה מאולצת, עם תמונה צריך להיות מוטבת כדי לקבל את החזקה פלורסצנטיות אותות והרזולוציה הטובה ביותר.</li>
	<li>בחר, להגדיר את עוצמת הלייזר STED עבור כל fluorophore תחת הלשונית "רכוש" של התוכנה, והשתמש את פס המחוון עבור-592-nm או STED 660 ננומטר לייזר כדי לכוונן את עוצמת הלייזר. להתאים את הכוח הלייזר 592-nm דלדול עבור ה-GFP, אלקסה עבור חיל הים 532. להתאים את הכוח הלייזר דלדול 660 ננומטר על אלקסה עבור חיל הים 568.</li>
	<li>כדי להגדיל את הרזולוציה ולצמצם את האות רקע, עבור אל ההגדרות של "רכישת" תחת הלשונית "רכוש" של התוכנה, להגדיל את קו ו/או מסגרת בממוצע על-ידי בחירת ערך הגדול מ- 1 שימוש בתפריט הנפתח עבור כל אופציה.</li>
	<li>בנוסף, רוכשים את האות פלורסנט באמצעות ממותגת הזמן STED על-ידי בדיקת האפשרות של המגביל fluorophore תחת הלשונית "רכוש", תוך ציון ערכים עבור זמן-gating (ראה הערה להלן). להגביר את עוצמת הלייזר STED כדי לשפר את הפתרון, אבל זה יהיה גם להגדיל את photobleaching של fluorophores. הערה: הזמן המגביל יהיה צורך ניתן למטב את המיקרוסקופ, מדגם של fluorophores בשימוש. הזמן gating של 0.3 עד 6 ns מומלץ. לאחר קיבוע, GFP הוא רגישות גבוהה במיוחד עוצמת הלייזר גבוהה. כדי להפחית את photobleaching של ה-GFP, זמן gating צריך להיות מיושם, עוצמת הלייזר STED צריך להיות מופחת.</li>
	<li>כדי ללכוד תמונות STED תלת-ממד, השתמש במחוון כדי לשנות את הנקודה התפשט פונקציה (PSF) "3D STED".</li>
	<li>באופן ידני לרכוש תמונות מרובות כדי להבטיח הפארמצבטית. Deconvolve את התמונות (ראה איור 1) באמצעות תוכנה deconvolution חבילת41(ראה טבלה של חומרים).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+coordinates+the+early+events+of+B-cell+activation.">The cytoskeleton coordinates the early events of B-cell activation.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (2), a002360 (2011).</li><li>Batista, F. D., Treanor, B., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+a+role+for+the+actin+cytoskeleton+in+the+regulation+of+B-cell+activation.">Visualizing a role for the actin cytoskeleton in the regulation of B-cell activation.</a> Immunol Rev. 237 (1), 191-204 (2010).</li><li>Harwood, N. E., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+B+cell+activation.">Early events in B cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 28, 185-210 (2010).</li><li>Batista, F. D., Harwood, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+who,+how+and+where+of+antigen+presentation+to+B+cells.">The who, how and where of antigen presentation to B cells.</a> Nat Rev Immunol. 9 (1), 15-27 (2009).</li><li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+antigen+receptor+activation+and+actin+cytoskeleton+remodeling.">T cell antigen receptor activation and actin cytoskeleton remodeling.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (2), 546-556 (2014).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Cell-Cell+Interaction+Contacts:+Synapses+and+Kinapses.">Visualization of Cell-Cell Interaction Contacts: Synapses and Kinapses.</a> Self Nonself. 2 (2), 85-97 (2011).</li><li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Structure+and+Function+of+the+Immunological+Synapse.">Understanding the Structure and Function of the Immunological Synapse.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a002311 (2010).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+design+of+immunological+synapses+and+kinapses.">Modular design of immunological synapses and kinapses.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 1 (1), a002873 (2009).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+cell-cell+interaction+contacts-synapses+and+kinapses.">Visualization of cell-cell interaction contacts-synapses and kinapses.</a> Adv Exp Med Biol. 640, 164-182 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hunter+to+gatherer+and+back:+immunological+synapses+and+kinapses+as+variations+on+the+theme+of+amoeboid+locomotion.">Hunter to gatherer and back: immunological synapses and kinapses as variations on the theme of amoeboid locomotion.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 577-596 (2008).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses.">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunol Rev. 221, 77-89 (2008).</li><li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+synapse:+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation.">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li><li>Monks, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells.">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li><li>Yuseff, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+B+cells+capture,+process+and+present+antigens:+a+crucial+role+for+cell+polarity.">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (7), 475-486 (2013).</li><li>Mattila, P. K., Batista, F. D., Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+actin+cytoskeleton+mediates+receptor+cross+talk:+An+emerging+concept+in+tuning+receptor+signaling.">Dynamics of the actin cytoskeleton mediates receptor cross talk: An emerging concept in tuning receptor signaling.</a> J Cell Biol. 212 (3), 267-280 (2016).</li><li>Kuhn, J. R., Poenie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+polarization+of+the+microtubule+cytoskeleton+during+CTL-mediated+killing.">Dynamic polarization of the microtubule cytoskeleton during CTL-mediated killing.</a> Immunity. 16 (1), 111-121 (2002).</li><li>Wang, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap1-cofilin-1+pathway+coordinates+actin+reorganization+and+MTOC+polarization+at+the+B+cell+immune+synapse.">The Rap1-cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse.</a> J Cell Sci. 130 (6), 1094-1109 (2017).</li><li>Schnyder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+receptor-mediated+antigen+gathering+requires+ubiquitin+ligase+Cbl+and+adaptors+Grb2+and+Dok-3+to+recruit+dynein+to+the+signaling+microcluster.">B cell receptor-mediated antigen gathering requires ubiquitin ligase Cbl and adaptors Grb2 and Dok-3 to recruit dynein to the signaling microcluster.</a> Immunity. 34 (6), 905-918 (2011).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+Separately+Partners+with+NDE1+and+Dynactin+To+Orchestrate+T+Cell+Focused+Secretion.">Dynein Separately Partners with NDE1 and Dynactin To Orchestrate T Cell Focused Secretion.</a> J Immunol. 197 (6), 2090-2101 (2016).</li><li>Combs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+dynein+to+the+Jurkat+immunological+synapse.">Recruitment of dynein to the Jurkat immunological synapse.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14883-14888 (2006).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+microtubule+organization+and+dynamics:+two+ends+in+the+limelight.">Control of microtubule organization and dynamics: two ends in the limelight.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (12), 711-726 (2015).</li><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule++TIPs+at+a+glance.">Microtubule +TIPs at a glance.</a> J Cell Sci. 123 (20), 3415-3419 (2010).</li><li>Fukata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+and+Cdc42+capture+microtubules+through+IQGAP1+and+CLIP-170.">Rac1 and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170.</a> Cell. 109 (7), 873-885 (2002).</li><li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM,+STED+and+Localisation+Microscopy:+A+practical+comparison.">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Sci Rep. 6, 27290 (2016).</li><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+channel+STED+nanoscopy+of+lytic+granules+on+actin+filaments+in+natural+killer+cells.">Dual channel STED nanoscopy of lytic granules on actin filaments in natural killer cells.</a> Commun Integr Biol. 5 (2), 184-186 (2012).</li><li>Ritter, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+depletion+initiates+events+leading+to+granule+secretion+at+the+immunological+synapse.">Actin depletion initiates events leading to granule secretion at the immunological synapse.</a> Immunity. 42 (5), 864-876 (2015).</li><li>Tamarit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+microdomains+and+cytoskeleton+organization+shape+and+regulate+the+IL-7+receptor+signalosome+in+human+CD4+T-cells.">Membrane microdomains and cytoskeleton organization shape and regulate the IL-7 receptor signalosome in human CD4 T-cells.</a> J Biol Chem. 288 (12), 8691-8701 (2013).</li><li>Brown, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+remodeled+synaptic+actin+reveals+different+synergies+between+NK+cell+receptors+and+integrins.">Super-resolution imaging of remodeled synaptic actin reveals different synergies between NK cell receptors and integrins.</a> Blood. 120 (18), 3729-3740 (2012).</li><li>Dupre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Lymphocyte+Migration:+An+Action+Movie+Starring+the+Actin+and+Associated+Actors.">T Lymphocyte Migration: An Action Movie Starring the Actin and Associated Actors.</a> Front Immunol. 6, 586 (2015).</li><li>Rak, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+lytic+granule+secretion+occurs+through+a+pervasive+actin+network+at+the+immune+synapse.">Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse.</a> PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+the+migration,+invasiveness+and+in+vivo+dissemination+of+B-cell+lymphomas.">The Rap GTPases regulate the migration, invasiveness and in vivo dissemination of B-cell lymphomas.</a> Oncogene. 29 (4), 608-615 (2010).</li><li>Lin, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rap+GTPases+regulate+B+cell+morphology,+immune-synapse+formation,+and+signaling+by+particulate+B+cell+receptor+ligands.">The rap GTPases regulate B cell morphology, immune-synapse formation, and signaling by particulate B cell receptor ligands.</a> Immunity. 28 (1), 75-87 (2008).</li><li>McLeod, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rap+GTPases+regulate+integrin-mediated+adhesion,+cell+spreading,+actin+polymerization,+and+Pyk2+tyrosine+phosphorylation+in+B+lymphocytes.">The Rap GTPases regulate integrin-mediated adhesion, cell spreading, actin polymerization, and Pyk2 tyrosine phosphorylation in B lymphocytes.</a> J. Biol. Chem. 279 (13), 12009-12019 (2004).</li><li>Christian, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Rap+GTPases+in+B+lymphocytes+modulates+B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+Akt+but+has+no+effect+on+MAPK+activation.">Activation of the Rap GTPases in B lymphocytes modulates B cell antigen receptor-induced activation of Akt but has no effect on MAPK activation.</a> J Biol Chem. 278 (43), 41756-41767 (2003).</li><li>Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+acquire+antigen+from+target+cells+after+synapse+formation.">B cells acquire antigen from target cells after synapse formation.</a> Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).</li><li>Treanor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cortical+actin+remodeling+by+ERM+proteins+controls+BCR+microcluster+organization+and+integrity.">Dynamic cortical actin remodeling by ERM proteins controls BCR microcluster organization and integrity.</a> J Exp Med. 208 (5), 1055-1068 (2011).</li><li>Mattila, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+and+tetraspanin+networks+organize+receptor+nanoclusters+to+regulate+B+cell+receptor-mediated+signaling.">The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling.</a> Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).</li><li>Yuseff, M. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Secretion+of+Lysosomes+at+the+B+Cell+Synapse+Couples+Antigen+Extraction+to+Processing+and+Presentation.">Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation.</a> Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).</li><li>Mace, E. M., Orange, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+immunological+synapse+by+dual+color+time-gated+stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy.">Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Russ, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Image Processing Handbook, Sixth Edition. , (2011).</li><li>Stinchcombe, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+polarization+delivers+secretory+granules+to+the+immunological+synapse.">Centrosome polarization delivers secretory granules to the immunological synapse.</a> Nature. 443 (7110), 462-465 (2006).</li><li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharper+low-power+STED+nanoscopy+by+time+gating.">Sharper low-power STED nanoscopy by time gating.</a> Nat Methods. 8 (7), 571-573 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

תמונות מפורט של מבנים cytoskeletal יכולה להיות מושגת באמצעות מיקרוסקופ סופר רזולוציה STED, אשר באופן תיאורטי ניתן להשיג רזולוציה של 50 ננומטר, בהשוואה קונפוקלית קונבנציונאלי, אשר הינו הפתרון עקיפה-מוגבלת ~ 200 ננומטר 24. היכולת לפתור מבנים עדינה יותר בהמשך משופרת באמצעות deconvolution תוכנה ל?...

כאשר תאים B לאגד מקוטב מערכים של אנטיגנים (למשל, המוצג על פני השטח של אנטיגן תאים (נגמ שים)), וכתוצאה מכך B-cell הקולטן (BCR) איתות כוננים היווצרות של מבנה קלאסי סינפסה המערכת החיסונית, אשר היה הראשון המתואר T תאים1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. בתחילה, microclusters בצורה BCRs אנטיגן מכורך בפריפריה של התא B: APC פנה אל האתר. אלה microclusters לאחר מכן להזיז לכיוון המרכז של האתר קשר אנטיגן, איפה הם מזג לתוך אשכול מרכזי ההפעלה סופרא מולקולרית (cSMAC) המהווה הליבה של הסינפסה המערכת החיסונית. סינפסה המערכת החיסונית היווצרות מייעל BCR איתות ומקל אנטיגן בתיווך BCR החילוץ של קרום APC14. רכישה זו אנטיגן, שבעקבותיה באה אנטיגן בתיווך BCR הפנמה ועיבוד אנטיגן עוקבות, מאפשר תאי B להציג פפטיד: MHC II מתחמי לתאי T וירתקו את תא T עזרה14. כי המערכת החיסונית סינפסה היווצרות מקדם תא B הפעלה, שחקרתי את המנגנונים המקימים שזה דפוס פונקציונלי של קולטן הארגון יכול לספק חדש תובנות תגובות חיסוניות ההורמונאלית איך יזם, מוסדר.
ארגון מחדש של אקטין והן microtubule cytoskeletons חיוני עבור המערכת החיסונית סינפסה היווצרות. BCR מקומי איתות מגורה על ידי מערך מקוטב במרחב של אנטיגנים גורם מהירה ודרמטית שיפוץ של אקטין שלד התא1,15. היווצרות של אקטין דנדריטים מבנים בפריפריה של תא B מפעילה כוחות לדחוף על קרום פלזמה ומקדם תא B הפצת. זה מאפשר התא B לסרוק אזור רחב יותר מניבי אנטיגן פני השטח, מגדילה את מספר BCRs אשר מאגד אנטיגן ולהפעיל BCR מסלולי איתות. במקביל, MTOC את הרשת microtubule הם reoriented כלפי האתר של אנטיגן קשר. MTOC מתקרב האתר קשר אנטיגן, microtubules שמקורם MTOC להאריך לאורך הפנים הפנימי של קרום פלזמה על הממשק בין התא B לבין משטח אנטיגן מניבי16,ה-17. Microtubules juxtamembrane אלה יכולים לשמש ואז רצועות עבור תנועת צנטריפטלי בתיווך דינאין של אנטיגן מכורך BCR microclusters18, שמוביל היווצרות cSMAC.
ולהתפכחות קיטוב של MTOC לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית דורש אקטין שלם microtubule cytoskeletons ואת תלויים אינטראקציות בין אקטין קורטיקלית microtubules ורשת16,17, 19,20. החלבונים אקטין-איגוד בקליפת המוח, כגון IQGAP1, באפשרותך ללכוד microtubules על ידי אינטראקציה עם מתחמי חלבון המעטרים את קצות פלוס microtubule21. אלה מתחמי דינמי של פלוס-end מחייב חלבונים כוללים EB1, סרטון-170, אשר מתייחסים באופן קולקטיבי בתור microtubule פלוס-סוף מעקב חלבונים (+ טיפים)21,22. + טיפים בקצות microtubules ניתן לאגד חלבונים המקושרים עם קרום פלזמה או את שלד התא אקטין קורטיקלית. זה מאפשר מנגנונים ליצירת כוח (למשלהמינוס-הסוף ביים תנועת מעוגן cortically דינאין לאורך microtubules) כדי להפעיל כוחות מושך-microtubules, ובכך למקם מחדש את MTOC. קליפ-170 ניתן לאגד החלבון אקטין-הקשורים פיגומים IQGAP123, הראינו כי שני חלבונים אלה נדרשים עבור MTOC BCR-induced קיטוב לכיוון ה17-סינפסה המערכת החיסונית. אינטראקציה זו IQGAP1-קליפ-170 עשוי לשחק תפקיד מפתח בתיאום את הבנייה מחדש של שלד התא אקטין עם מיקום מחדש של הרשת microtubule על הסינפסה המערכת החיסונית B-cell.
קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופ חשף דרמטי לארגונו מחדש של cytoskeletons אקטין, microtubule במהלך B-cell סינפסה המערכת החיסונית היווצרות2. עם זאת, גישה זו אין אפשרות לפענח קטן מבנים הסלולר בפירוט עקב המגבלה עקיפה של אור, אשר, על פי החוק של אבה, היא תלויה אורך הגל של האור בשימוש כדי להאיר את הדגימה, את הצמצם של אובייקטיביות24. מגבלה זו עקיפה מאלץ את הרזולוציה של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי 200-300 ננומטר בכיוון לרוחב, 500-700 nm, כיוון צירית25. לכן, subcellular מבנים קטנים יותר, כמו גם את הפרטים הקטנים של אקטין, microtubule cytoskeletons, יכול רק להיות שנצפו באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים. מיקרוסקופ אלקטרונים הדמיה של שלד התא הוא זמן רב, דורש דגימה קשים קיבוע והכנות פרוטוקולים יכול לשנות מבנים ביולוגיים, ולא מוגבל לאיתור בתיווך נוגדנים. היכולת immunostain, בו זמנית תמונה מספר חלבונים או מבנים הסלולר הוא יתרון משמעותי של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. יתר על כן, ביטוי פיוז'ן פלורסנט חלבונים בתאים מאפשר הדמיה בזמן אמת והוא שימושי כאשר נוגדנים יעילים עבור immunostaining החלבון עניין אינם זמינים.
ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות במיקרוסקופ ברזולוציה סופר יש להתגבר על המגבלות עקיפה של אור והתירו את החזיית ננו-מבנים הסלולר24. אחד טכניקה מיקרוסקופית רזולוציה סופר כזה נקרא פליטה מאולצת מיקרוסקופ דלדול (STED). STED מעסיקה שני לייזרים, לייזר אחד מגרה את fluorophore ואיפה לייזר השני עם תבנית בצורת סופגנייה מעלימה באופן סלקטיבי את פליטת קרינה פלואורסצנטית סביב fluorophore. זה מפחית את פונקציית נקודת-התפשטות (אזור לכאורה) של חלקיק בודד פלורסנט ומספק25,26תמונות פלורסנט מגבלת עקיפה המשנה. מיקרוסקופ דלדול הקרקע-המדינה מעסיקה גם טכניקות מבוססות קרינה פלואורסצנטית לרכוש תמונות ברזולוציה-העל. עם זאת, התמונה רכישה ושחזור הפעמים ארוכות ישנם רק מספר מוגבל של fluorophores יכול לשמש, ההדמיה ברזולוציה גבוהה בו זמנית של מספר רכיבים cytoskeletal הוא טכנית מאתגר כי שמירה אקטין ומבני microtubule דורש הליכים קיבוע שונות. לכן, STED יש מספר יתרונות על פני מיקרוסקופ אלקטרונים, אחרים מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה גישות בכך שזה מציע ייבוא תמונות מהיר, יש דרישות מינימליות עיבוד דפוס, מעסיקה את fluorophores אותו והוא מכתים טכניקות זה משמשים פלורסצנטיות קונבנציונאלי מיקרוסקופיה של דגימות קבוע26.
מיקרוסקופ ברזולוציה סופר עכשיו נעשה שימוש כדי להמחיש אקטין מבנים ב הסינפסה מחוסן טבעית תאים (NK) רוצח ו T תאים26,27,28,29,30, 31. אולם, הדמיה ברזולוציה-העל של שלד התא microtubule, כמו גם מתואמת לארגונו מחדש של cytoskeletons אקטין, microtubule במהלך היווצרות סינפסה המערכת החיסונית, רק באחרונה דווח על17. השתמשנו STED במיקרוסקופ בתאים תמונה B שלא היו נותנים למרוח אותו על coverslips מצופים נוגדן אנטי (anti-Ig) נוגדנים, BCR איתות וליזום רה-ארגון שלד התא. כאשר מצופה על קיבוע נוגדנים anti-Ig, בתאי B עוברים דרמטי תלויי-אקטין המריחה, אשר recapitulates את האירועים הראשונית במהלך היווצרות מערכת החיסון סינפסה. חשוב לציין, מיקרוסקופ STED חשף את הפרטים הקטנים של הטבעת דנדריטים של F-אקטין סינפסה צורות בפריפריה של מערכת החיסון, הראה כי את MTOC, כמו גם את microtubules המצורף אליו, עברה ליד האתר קשר אנטיגן17. אלה microtubules מורחב החוצה לכיוון הטבעת ההיקפית של F-אקטין. יתר על כן, ההדמיה STED צבע רב של שילובים שונים של F-אקטין, טובולין, IQGAP1, ו מתויג GFP קליפ-170 + טיפים הראתה כי microtubule פלוס-מסתיים בסימן קליפ-170-GFP היו קשורים באופן הדוק meshwork של אקטין היקפיים, עם IQGAP1, לכידת קורטיקלית חלבון17.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט הדמיה cytoskeletons אקטין, microtubule על הסינפסה המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ STED. שיטות אלה מוטבו באמצעות קו תא B מאתר A20, אשר ננקטה נרחב ללמוד BCR איתות, סינפסה המערכת החיסונית היווצרות17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. בגלל נוגדנים מסחרי קליפ-170 לא פעלה היטב עבור immunostaining בניסויים הקודמים, נתאר בפירוט את הביטוי של מתויג GFP קליפ-170 בתאים A20, יחד עם צביעת פרוטוקולים להמחשת בו זמנית עד ל שלושה מרכיבים cytoskeletal או חלבונים הקשורים שלד התא. שיטות לשימוש STED מיקרוסקופ כדי התמונה אקטין-NK תאים חיסוניים הסינפסות היה שתואר לעיל40. כאן, אנו להרחיב זה רכישת תמונות ברזולוציה סופר צבע רב של אקטין והן microtubule cytoskeletons בתאי B.
שיקול מכריע עבור סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה היא באמצעות ההליכים קיבוע מתאים לשמירה על מבנים הסלולר ולמניעת נזק חלבונים פלורסנט. את הקיבעון, צביעת שיטות שהוצגו במסמך זה מוטבו שומרים על ידי קרינה פלואורסצנטית GFP ולספק דימות ברזולוציה של הרשתות אקטין, microtubule. כאשר המבטאים חלבונים פלורסנט, יצוין כי בתאי B הם בדרך כלל קשה transfect. באמצעות פרוטוקול זה, 20-50% של A20 תאים בדרך כלל לבטא את חלבון כימרי transfected GFP, בקרב אוכלוסייה זו רמות החלבון הביטוי משתנה. למרות זאת, הדמיה ברזולוציה-העל של אקטין, microtubules באמצעות ההליכים שנתאר די חזקים, תמונות באיכות גבוהה מתקבלים בקלות. למרות גודלם הזעיר יחסית בתאים A20, אנו מראים כי הליכים אלה גם יכול לשמש כדי תמונה ברשת microtubule בתאי B הראשי הופעלו בקצרה עם ליפופוליסכריד (LPS). הראינו כי מופעל LPS בתאי B ראשי יכול להיות transfected עם siRNAs יעילות גבוהה יחסית (כלומר, כאלה כי חלבון דלדול ניתן להבחין באמצעות immunoblotting), גורמים להם אלטרנטיבה טובה לשימוש של שורות תאים B עבור מחקרים 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 mouse B-lymphoma cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>Heat inactivate at 56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C for 30 min</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Liquid, 10,000 units</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional materials for primary B cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS from &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;0111:B4</td></tr><tr><td>B cell-activating factor (BAFF)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;Cell&lt;/strong&gt; 109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Recommended transfection reagents and equipment &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Follow the manufacturer&#039;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program L-013 used</td></tr><tr><td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coating coverslips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>Dissecting extra fine splinter forceps</td></tr><tr><td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>For A20 cells</td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>For primary mouse B cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Without DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution software</td><td>Scientific Voume Imaging</td><td></td><td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

תאי B לאגד ממברנה מכורך אנטיגנים (למשל, על פני השטח של תא אנטיגן) יוצרים סינפסה על המערכת החיסונית, מבנה הסלולר מיוחדים אשר מייעל B-cell קולטן (BCR) איתות ורכישה בתיווך BCR אנטיגן. שני את הבנייה מחדש של שלד התא של אקטין, את ולהתפכחות של הרשת microtubule כלפי האתר קשר אנטיגן חיוניים עבור המערכת החיסונית סינפסה היווצרות. שיפוץ של שלד התא אקטין לתוך טבעת היקפית צפופה של F-אקטין מלווה קיטוב של מרכז ארגון microtubule לכיוון הסינפסה המערכת החיסונית. Microtubule פלוס-end מחייב חלבונים, וכן לכידת פלוס-end קורטיקלית חלבונים מתווכים האינטראקציות פיזי בין cytoskeletons אקטין, microtubule, המאפשרים להם יהיו מאורגנות באופן מתואם. שחקרתי את מנגנוני הבקרה הארגון מחדש cytoskeletal, כמו גם הבנה איך אלה מבנים cytoskeletal לעצב מערכת החיסון סינפסה היווצרות והאיתות BCR, יכול לספק תובנות חדשות תא B הפעלה. זה נעזר בגילויים הפיתוח של גישות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר חושפים פרטים חדשים cytoskeletal רשת הארגון. נתאר כאן שיטה באמצעות פליטה מאולצת מיקרוסקופ דלדול (STED) בו זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של transfected microtubule מתויג GFP פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B. המודל האירועים בתחילת במבנה המערכת החיסונית סינפסה, אנו מאפשרים בתאי B למרוח אותו על coverslips מצופים נוגדן אנטי (anti-Ig) נוגדנים, ליזום BCR איתות ובניה שלד התא. אנו מספקים פרוטוקולים צעד אחר צעד לביטוי GFP פיוז'ן חלבונים בתאים A20 B-לימפומה, להפצת תא אנטי-Ig-induced, קיבוע תא עוקבות, Immunostaining, ייבוא תמונות של התמונה deconvolution צעדים. התמונות ברזולוציה גבוהה מושגת באמצעות הליכים אלה מאפשרים אחד בו זמנית להמחיש אקטין מבנים microtubules, החלבונים פלוס-קצה הכריכה microtubule עשויים לקשר אלה שתי רשתות cytoskeletal.

עבור תאים B הפצת על קיבוע אנטי-Ig, מיקרוסקופ STED בשילוב עם תוכנת deconvolution מספק תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים cytoskeletal מאשר מיקרוסקופיה קונפוקלית. זה מתבטא, איור 1, שם הרשת F-אקטין היה visualized באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל. השוואה של קונאפוקלית ו STED תמונות ברזולוצ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

visualizing-actin-microtubule-cytoskeletons-at-b-cell-immune-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

13.7K Views.  University of British Columbia. אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.

Video: Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

ויזואליזציה של סינפסה החיסונית על ידי פליטה מאולצת דלדול מגודרת בזמן צבע כפול (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

הדמיה ברזולוציה סופר של תא הרוצח הטבעי החיסונית סינפסה על מישורי שומנים bilayer נתמך-זכוכית

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

דגם תא האנדותל מישורי הדמיה החיסוני סינפסה Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

לומדת אורגל דינמיקה ב-B תאים במהלך היווצרות סינפסה החיסונית

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

הדמיה של הסינפסה החיסונית של האדם

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

Source: Zheng, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52502">Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

הדמיה ברזולוציית על של היווצרות סינפסה אימונולוגית של תאי NK על דו-שכבה ליפידית נתמכת

1. Preparation of Liposomes

	Calculate the amount of chloroform-suspended stock solutions of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Source: Martinelli, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53288">An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

הערכת טופולוגיית סינפסה אימונולוגית באמצעות דימות תאים חיים

1. Preparing Human CD4+&#160;Th1 Effector/Memory T Cells

	Apply a tourniquet to the arm of the donor, wipe the vein with alcohol, and insert a needle. ...

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST