Name: visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy
Uploaded: 2018-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy at JoVE.com

Wir bedanken uns bei den UBC Life Sciences Institute (LSI) Imaging Facility für Betreuung und Pflege der STED-Mikroskop. Diese Arbeit wurde durch #68865 von Canadian Institutes of Health Research (zu M.R.G) finanziert. Wir danken Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya University, Nagoya, Japan) für die CLIP-170-GFP-Plasmid.

Alle tierische Verfahren wurden von der University of British Columbia Animal Care Committee genehmigt.
(1) mit dem Ausdruck GFP-Fusionsproteinen in A20 B-Lymphom-Zellen
<ol><li>A20 Zellkulturen in komplette RPMI Medium (RPMI-1640 mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 50 µM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 1 mM Pyruvat, 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin ergänzt) bei 37 ° C in einer Gewebekultur Inkubator mit 5 % CO2.</li>
	<li>Vorbereiten des Transfection Reagens (siehe die Tabelle der Materialien) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Dieses Protokoll wurde für die spezifischen Reagenzien optimiert und Transfektion Protokoll beschrieben der Tabelle der Materialien. Anderen Transfektion Reagenzien, die wir versucht haben, haben nicht genügend Transfektion Effizienz geführt.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Zentrifuge 2,5 x 106 A20 Zellen (für jede Transfektion) für 5 min bei 525 X g. Aufschwemmen der Zellen in 100 µL Transfection Reagens, 1-2,5 µg von Plasmid DNA enthalten. Verwenden Sie für DNA Kodierung CLIP-170-GFP232,5 µg pro Transfektion. Mischen Sie vorsichtig.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen zu einem Brunnen von einem 6-Well-Platte zu, und stellen Sie die Lautstärke auf 2 mL mit vorgewärmten komplette RPMI Medium. Kulturzellen Sie 18 h bei 37 ° C Proteinexpression ermöglichen.</li>
</ol>2. primäre Maustaste B Zellen zu isolieren und aktivieren sie mit LPS
<ol><li>Verwenden Sie sterilisierte chirurgische Instrumente, eine Maus, Protokolle von der Instituts Animal Care Committee genehmigt die Milz entfernt.</li>
	<li>Legen Sie in der Gewebekultur-Haube ein steriles 70 µm Zelle Sieb in eine 35-mm-Gewebe-Kultur-Schale mit 3 mL sterile PBS Raumtemperatur. Verwenden Sie das Gummiteil des Kolbens aus einer 5-ml-Spritze, die Milz durch das Sieb der Zelle zerquetschen.</li>
	<li>Die einzelne Zelle Aussetzung der Splenoctyes in ein steriles 15-mL-Röhrchen und Zentrifuge bei 525 X g für 5 min pipettieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine magnetische Wulst-basierten B-Zell-Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien), um eine hoch angereicherte Population von B-Zellen zu erhalten.</li>
	<li>Aufschwemmen der B-Zellen, 3 x 106/mL in kompletten RPMI Medium mit 2,5 µg/mL LPS plus 5 ng/mL B Zelle Aktivierung Faktor (BAFF; ein Überleben Zytokin) ergänzt.</li>
	<li>Kultur der Zellen für 6 h bei 37 ° C.</li>
</ol>3. Beschichtung Glasdeckgläser mit Antikörpern Anti-Ig
<ol><li>Bereiten Sie die Antikörperlösung für die Beschichtung der Deckgläsern. Verdünnen der Stammlösung Ziege-Anti-Maus-Ig-Antikörper in Raumtemperatur sterile PBS eine 12,5 µg/mL Lösung zu machen; 400 µL Antikörper-Lösung ist erforderlich für jede Deckglas. Hinweis: Verwenden Sie Ziege Anti-Maus IgG für A20 Zellen; Maus: Ziege Anti-IgM für primäre B-Zellen. Ziege IgG Antikörper binden nicht gut auf Maus-Fc-Rezeptoren. Aber, um jede mögliche Fc Rezeptorbindung zu vermeiden, eine F(ab) oder F(ab')2 Fragmente von Anti-Maus IgG oder IgM-Antikörper Anti-Maus können.</li>
	<li>Tauchen Sie ein #1.5-18 mm Runde Glas-Deckglas in 100 % Methanol und vollständig trocknen lassen (ca. 10 min).</li>
	<li>Mit Pinzette, legen Sie die getrockneten Deckglas in einer Gewebekultur 12-Well Platte und pipettieren 400 µL die 12,5 µg/mL Antikörperlösung (5 µg insgesamt; 2 µg/cm2) auf das Deckglas, so dass es eine Blase in der Mitte des das Deckglas bildet und breitet sich bis an den Rand.</li>
	<li>Achten Sie darauf, die gesamte Deckglas abdecken, aber lassen Sie nicht die Antikörperlösung, vorbei an den Rand des Glas-Deckglas und auf der Gewebekultur Kunststoff zu verlängern. Bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläsern durch pipettieren 1 mL sterile PBS in der gut und anschließend absaugen, die Lösung. Wiederholen Sie zwei weitere Male, ungebundenen Antikörper zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL sterile PBS, die gut mit der Antikörper-beschichtete Deckglas bis Zellen hinzugefügt werden können. Hinweis: Die Deckgläsern können bei Raumtemperatur, bedeckt mit PBS, für den Einsatz am gleichen Tag gehalten werden.</li>
</ol>(4) B-Zellen auf Anti-Ig-beschichtete Deckgläsern
<ol><li>Bereiten Sie modifiziert HEPES gepufferten Kochsalzlösung (mHBS): 25 mM HEPES, pH 7,2, 125 mM NaCl, KCl, 1 mM CaCl25 mM, 1 mM Na2HPO4, 0,5 mM MgSO4, 1 mg/mL Dextrose, 2 mM Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat und 50 µM 2-Mercaptoethanol). Filter dieser Lösung zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	<li>Am Tag des Experiments machen 50 mL mHBS mit 2 % FBS (mHBS-FBS) durch Zugabe von 1 mL der Hitze-inaktivierten FBS, 50 mL mHBS. Der mHBS-FBS auf 37 ° C vor dem Gebrauch warm.</li>
	<li>Zentrifugieren der transfizierten Zellen A20 oder die primären B-Zellen, die mit BAFF plus LPS bei 525 X g für 5 min kultiviert worden war.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zellen in 1 mL der mHBS-FBS, zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer und verdünnen Sie die Zellen, die 2 x 105 Zellen/mL in mHBS-FBS.</li>
	<li>Mit Pinzette, das Deckglas aus der Gewebekultur-Platte auf ein Stück Paraffin Film übertragen.</li>
	<li>Jede Deckglas 250 µL der B-Zellen (5 x 104 Zellen) hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Deckgläsern bei 37 ° C für 15 Minuten im Dunkeln damit die B Zellen über die Anti-IgG-beschichtete Oberfläche verteilen.</li>
</ol>5. Befestigung und Immunostaining Zellen
<ol><li>Bereiten Sie die Fixierung Lösung durch Verdünnung der Stammlösung 16 % Paraformaldehyd und 50 % Glutaraldehyd Vorratslösung in Raumtemperatur destilliertes Wasser Endkonzentrationen von Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd 3 % Ausbeute. Bereiten Sie die Fixierung Lösung am Tag ist es verwendet zu werden und überschüssiges Öl zu verwerfen. Achtung: Die Paraformaldehyd und Glutaraldehyd Stammlösungen sollten nur in einem chemischen Abzug verwendet werden. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Sicherheitsdatenblatt (MSDS).</li>
	<li>Bereiten Sie die Permeabilisierung/blockieren-Puffer (3 % BSA und 0,1 % Triton x-100 verdünnt mit PBS-Puffer). Filter dieser Lösung zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Am Tag des Experiments wärmen Sie die benötigte Menge auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie die Färbung Puffer (1 % BSA und 0,1 % Saponin mit PBS-Puffer). Diese Lösung mit einem 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Am Tag des Experiments wärmen Sie die benötigte Menge auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Pipettieren 350 µL der Lösung Fixierung auf jeder Deckglas, um sicherzustellen, dass die Oberfläche vollständig bedeckt ist. Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min in der Dunkelheit.</li>
	<li>Entfernen Sie die Fixierung-Lösung aus dem Deckglas durch Absaugen vorsichtig vom Rand der das Deckglas mit einem Micropipet. Achtung: Die Fixierung-Lösung sollte als gefährlicher chemischer Abfall entsorgt werden.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläsern einmal mit 500 µL Puffer Permeabilisierung/blockieren. Pipettieren der Flüssigkeit.</li>
	<li>Permeabilize und die Zellen zu blockieren, indem jeder Deckglas 250 µL Puffer Permeabilisierung/blockieren hinzufügen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Kaninchen Anti-Tubulin Antikörper 1: 100 in der Färbung Puffer.</li>
	<li>Aspirieren aus Permeabilisierung/blockieren-Puffer von der Deckgläsern, und jeder Deckglas 50 µL der verdünnten Antikörper Anti-Tubulin-Lösung hinzu. Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min in der Dunkelheit.</li>
	<li>Bereiten Sie die sekundäre Antikörper/Aktin Fleck Lösung durch Verdünnung der Alexa Fluor 532 konjugiert Ziege-Anti-Kaninchen-IgG Sekundärantikörper und Alexa Fluor 568 konjugiert Phalloidin 1: 100 in der Färbung Puffer.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal um überschüssige Primärantikörper zu entfernen, durch Zugabe von 500 µL Puffer Färbung und dann Absaugen es.</li>
	<li>Jede Deckglas 50 µL der sekundären Antikörper/Aktin-Fleck-Lösung hinzu, und 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Deckgläsern 3 Mal um überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen, durch Zugabe von 500 µL Puffer Färbung und dann Absaugen es.</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL Reagenz Montage auf einen Objektträger. Montieren Sie das Deckglas auf den Objektträger mit der Zelle-Seite nach unten. Hinweis: Ein "Anti-Fade" Eindeckmedium (siehe Tabelle der Materialien) wird dringend empfohlen, die Fluoreszenzintensität der GFP Fusionsproteine zu bewahren. Vermeiden Sie die Verwendung der Montage Reagenzien mit DAPI, die mit der Abbildung von der Fluorophore stören können, wenn die STED-Laser verwenden.</li>
	<li>Lassen Sie über Nacht trocknen Sie die Folien im Dunkeln. Bild der Folien am nächsten Tag. Hinweis: Die Folien Imaging, sobald das Deckglas trocken ist wird dringend empfohlen wie die GFP Fluoreszenz im Laufe der Zeit sinkt.</li>
</ol>6. Bildgebung mit der STED-Mikroskop
Hinweis: Bitte beachten Sie, dass alle unten beschriebenen Software-Schritte sind spezifisch für das Mikroskop und die Software, die wir verwendet (siehe die Tabelle der Materialien). Die Schritte und Einstellungen müssen angepasst werden, wenn die Bildgebung mit einer anderen Mikroskop/Software ausgeführt wird.
<ol><li>Schalten Sie die STED-Mikroskop, aktivieren Sie Laser und Epifluoreszenz Beleuchtung und starten Sie die Mikroskop-Software.</li>
	<li>Legen Sie die Parameter für die STED-Erschöpfung-Laser. Hinweis: Dies hängt das spezifische Mikroskop verwendet wird und die Laser, denen es mit ausgestattet ist. Einige empfohlene Einstellungen Weißlicht (WLL) 70 %; 592 nm Laser 80 %; 660 nm Laser 80 %.</li>
	<li>Aktivieren Sie die STED-Einstellungen und richten Sie die STED-Laserstrahlen mit dem 100 X Objektiv.</li>
	<li>Verwenden das Okular, konzentrieren Sie sich die Probe und wählen Sie eine Zelle mit moderaten GFP Ausdruck. Hinweis: Niedrige GFP-Ausdruck wird nicht sichtbar, da STED die Emissionsintensität reduziert. Im Gegensatz dazu induziert hohe Expression von CLIP-170-GFP die spontane Bildung von großen Clustern, die nicht den normalen Mikrotubuli Plus-End Protein komplexe Morphologie und Verteilung widerspiegelt. Auswählen einer Zelle mit moderaten GFP Expression ist essentiell für die Bildgebung genau der Zellskelett Strukturen auf der Antigen-Kontakt-Seite.</li>
	<li>Zoom in der ausgewählten Zelle und wählen Sie die Region von Interesse für abgebildet werden. Stellen Sie den Fokus, so dass die X-y -Ebene der B-Zellen, die am nächsten an das Deckglas ist im Fokus.<ol>
<li>Um dies zu tun, stellen Sie das Ziel schrittweise näher auf das Deckglas, sodass B Zellskelett Zellstrukturen in den Mittelpunkt kommen und dann unscharf gehen. Dann bewegen allmählich das Ziel in die entgegengesetzte Richtung, bis die B Zellskelett Zellstrukturen zunächst wieder in den Fokus gerückt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimieren Sie die Einstellungen, einschließlich der Laserleistung, Erregung Strahl und detektorbereich. Beginnen Sie mit den Einstellungen von den Anweisungen des Herstellers empfohlen. Das Signal für die Proben zu optimieren Bedarf dann nehmen Sie Anpassungen vor. Bild alle Proben mit den gleichen Einstellungen miteinander verglichen werden.</li>
	<li>Auf der Registerkarte "acquire" der Software soll die Bildaufnahme sequentielle Frame Akquisition im unteren linken "Sequentieller Scan" durch die Option "zwischen Frames".</li>
	<li>Legt die Übernahme-Sequenz. Hinweis: Wir erwerben die GFP-Fluoreszenz zuerst zur Vermeidung der Verschlechterung des GFP-Signals. Abhängig von der Kombination des Fluorophore, die neben GFP verwendet werden, kann der längeren Wellenlänge Fluoreszenzsignal imaging zunächst bessere Ergebnisse. Jedoch sollte die Reihenfolge der Fluorophore oder fluoreszierende Proteine sind stimulierte Emission Depletion unterzogen und abgebildet optimiert werden, um die stärkste Fluoreszenz-Signale und beste Auflösung zu erhalten.</li>
	<li>Wählen Sie und setzen Sie die STED-Laserleistung für jedes Fluorophor unter dem Reiter "Acquire" der Software, und verwenden Sie den Schieberegler für die 592-nm oder 660 nm STED Laser um die Laserleistung anzupassen. Passen Sie die Kraft für die Erschöpfung 592-nm-Laser für GLP und Alexa Fluor 532. Stellen Sie den Strom für die Erschöpfung 660 nm-Laser für Alexa Fluor 568.</li>
	<li>Um die Auflösung zu erhöhen und das Hintergrundsignal, gehe zu den "Erwerb" Einstellungen auf der Registerkarte "Acquire" der Software, die Linie und/oder Rahmen, indem ein Wert größer als 1 verwenden die Drop-Down-Menü für jede Option Mittelwertbildung zu erhöhen.</li>
	<li>Auch das Fluoreszenzsignal mit Zeit-gated STED durch Überprüfung der gating Option für das Fluorophor auf der Registerkarte "Acquire" und Angabe von Werten für Zeit-gating zu erwerben (siehe Hinweis unten). Die STED-Laserleistung um die Auflösung zu erhöhen zu erhöhen, obwohl dies auch Immunofluoreszenz die Fluorophore erhöhen wird. Hinweis: Die gating Zeit müssen für das Mikroskop, Probe und Fluorophore verwendeten optimiert werden. Eine Zeit Anspritzung von 0,3 bis 6 ns wird empfohlen. Nach der Fixierung ist GFP besonders empfindlich auf hohe Laserleistung. Um die Immunofluoreszenz der GLP zu reduzieren, Zeit Anspritzung angewandt werden und die STED-Laserleistung reduziert werden sollte.</li>
	<li>Funktion (PSF) verteilt auf 3D-Bilder STED zu erfassen, verwenden Sie den Schieberegler, um den Punkt zu ändern auf "3D STED".</li>
	<li>Manuell erwerben Sie mehrere Bilder, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Deconvolve die Bilder (siehe Abbildung 1) mit einer Dekonvolution Software Paket41(siehe Tabelle der Materialien).</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Detaillierte Bilder des Zytoskeletts Strukturen erhalten Sie mit STED Höchstauflösung Mikroskopie, die theoretisch eine Auflösung von 50 erreichen nm, im Vergleich zu konventionellen konfokalen Mikroskopie, wofür die Beugung begrenzte Auflösung ~ 200 beträgt nm 24. die Möglichkeit, feinere Strukturen aufzulösen mithilfe Dekonvolution Software zur Berechnung der wahrscheinlichsten Position der ursprüngliche Lichtquelle aus dem beobachteten "verschwommen" Fluoreszenzsignal verstärkt wird. ...

Wenn B-Zellen zu binden polarisierten Arrays von Antigenen (z.B., angezeigt auf der Oberfläche von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs)), der daraus resultierenden B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung Laufwerke die Entstehung einer klassischen immun Synapse Struktur, die erstmals in beschrieben T Zellen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13. Zunächst Mikrokügelchen Antigen gebunden BCR Form an der Peripherie der B-Zelle: APC-Kontakt-Seite. Diese Mikrokügelchen bewegen sich dann in Richtung der Mitte der Antigen-Kontakt-Seite, wo sie verschmelzen zu einem zentralen supramolekularen Aktivierung-Cluster (cSMAC), die den Kern der immun Synapse bildet. Immun Synapse Bildung optimiert BCR Signalisierung und erleichtert die BCR-vermittelten Antigen-Extraktion aus der APC-Membran-14. Diese Antigen-Akquisition, die BCR-vermittelten Antigen Internalisierung und anschließende Antigen Verarbeitung folgt, kann B-Zellen zu präsentieren Peptid: MHC-II-komplexe, T-Zellen und T-Zell-Hilfe-14zu entlocken. Da immun Synapse Bildung fördert B-Zell-Aktivierung, Aufklärung der Mechanismen, die festlegen, dass diese funktionalen Muster der Rezeptor Organisation neu bieten kann sind Einblicke wie Humorale Immunantwort eingeleitet und geregelt.
Reorganisation der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons ist essentiell für immun Synapse Bildung. Lokalisierte BCR Signalisierung angeregt durch eine räumlich-polarisierten Arrays von Antigenen induziert rasche und drastische Umgestaltung der Aktin-Zytoskelett1,15. Die Bildung von dendritischen Aktin-Strukturen an der Peripherie der B-Zellen übt Druck Kräfte auf die Plasmamembran und fördert die Verbreitung von B-Zellen. Dies ermöglicht die B Zelle, einen größeren Bereich des Antigen-Auflagefläche zu scannen, und erhöht die Anzahl der BCR, die Antigen binden und BCR Signalwege aktivieren. Zur gleichen Zeit sind die MTOC und Mikrotubuli-Netzwerk neu ausgerichtet auf dem Gelände der Antigen-Kontakt. Während die MTOC der Antigen-Kontakt-Seite nähert, verlängern Mikrotubuli, die aus der MTOC entlang der Innenseite der Plasmamembran an der Schnittstelle zwischen der B-Zelle und Antigen tragenden Fläche16,17. Diese Juxtamembrane Mikrotubuli können dann als Titel für die dynien-vermittelten zentripetalen Bewegung der Antigen-gebundenen BCR Mikrokügelchen18, was zur Bildung einer cSMAC handeln.
Die Neuausrichtung und die Polarisation des MTOC gegenüber immun Synapse erfordert intakte Actin und Mikrotubuli Cytoskeletons und hängt oft von Wechselwirkungen zwischen der kortikalen Aktin Netzwerk und Mikrotubuli16,17, 19,20. Kortikale Actin-bindende Proteine, wie IQGAP1, können Mikrotubuli erfassen, durch die Interaktion mit Proteinkomplexe, die Mikrotubuli Plus-enden21schmücken. Diese dynamische komplexe Plus-Ende-bindende Proteine gehören EB1 und CLIP-170, die gemeinsam als Mikrotubuli Plus-tracking-Proteine (+ Tipps)21,22End bezeichnet werden. + Spitzen an den Enden der Mikrotubuli können Proteine binden, die die Plasmamembran oder der kortikalen Aktin-cytoskelett zugeordnet sind. Dies ermöglicht Kraft erzeugenden Mechanismen (z.B.Minus-Ende gerichtet Bewegung des cortically verankert dynien entlang der Mikrotubuli) Zugkräfte auf Mikrotubuli ausüben, und positionieren dabei die MTOC. CLIP-170 kann binden an das Protein Aktin-assoziierten Gerüst IQGAP123, und wir haben gezeigt, dass beide dieser Proteine für MTOC BCR-Induzierte Polarisation in Richtung immun Synapse17erforderlich sind. Diese IQGAP1-CLIP-170-Interaktion kann eine wichtige Rolle bei der Koordinierung der Umbau des Aktin-Zytoskeletts mit der Neupositionierung des Mikrotubuli-Netzwerks an der B-Zelle immun Synapse spielen.
Konventionelle Fluoreszenzmikroskopie hat die dramatische Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons während B-Cell immun Synapse Bildung2ergeben. Dieser Ansatz kann nicht jedoch kleine zelluläre Strukturen im Detail durch die Beugungsgrenze des Lichts, aufgelöst, die nach dem Abbeschen Gesetz abhängig von der Wellenlänge des Lichts verwendet ist, um die Probe und die Blende der Objektive24beleuchten. Diese Beugungsgrenze schränkt die Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopen, 200-300 nm in seitlicher Richtung und 500-700 nm in axialer Richtung25. Daher kleinere subzellulären Strukturen, sowie die feinen Details der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons konnten nur beobachtet werden mit Elektronenmikroskopie. Elektronenmikroskopie-Bildgebung des Zytoskeletts ist zeitaufwendig, erfordert harte Probe Fixierung und Vorbereitung Protokolle, die biologische Strukturen zu verändern, und beschränkt sich auf Antikörper-vermittelten Erkennung. Die Fähigkeit, Immunostain und gleichzeitig Bild mehrere Proteine oder zelluläre Strukturen stellt einen wesentlichen Vorteil der Fluoreszenz-Mikroskopie. Darüber hinaus mit dem Ausdruck fluoreszierende Schmelzverfahren Proteine in den Zellen ermöglicht Echtzeit-Bildgebung und ist nützlich, wenn wirksame Antikörper für Immunostaining Protein des Interesses nicht verfügbar sind.
Jüngsten technologischen Fortschritte in der Super-Auflösung Mikroskopie überwinden Sie die Grenzen der Beugung des Lichts und erlaubt die Visualisierung von nanoskaligen Zellstrukturen24. Eine solche super-Resolution-Mikroskopie-Technik heißt stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie. STED beschäftigt zwei Lasern, wo ein Laser regt das Fluorophor und ein zweiten Lasers mit einem Donut-förmigen Muster gezielt unterdrückt die Fluoreszenz-Emission um das Fluorophor. Dies reduziert die Point-Spread Funktion (scheinbare Bereich) ein einzelnes fluoreszierende Partikel und bietet ein Sub Beugung Begrenzung fluoreszierende Bild25,26. Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie beschäftigt auch Fluoreszenz-basierte Techniken zu Super-Auflösung erwerben. Aber die Bild-Erwerb und Wiederaufbau-Zeiten sind längst gibt es nur eine begrenzte Anzahl von Fluorophore, die verwendet werden können und die gleichzeitige hochauflösende Bildgebung des Zytoskeletts mehrere Komponenten ist technisch anspruchsvoll, da die Verwaltung Aktin und Mikrotubuli Strukturen erfordert unterschiedliche Fixierung Verfahren. Daher STED hat mehrere Vorteile gegenüber der Elektronenmikroskopie und anderen Super-Auflösung Mikroskopie nähert sich, dass es schnelle Bildakquisition bietet, minimale Nachbearbeitung Anforderungen hat und setzt die gleichen Fluorophore und Färbetechniken für konventionelle Fluoreszenzmikroskopie von örtlich festgelegten Proben26genutzt werden.
Super-Auflösung Mikroskopie wurde jetzt verwendet, um Aktin-Strukturen an der immun Synapse in natürlichen killer (NK)-Zellen und T Zellen26,27,28,29,30, visualisieren 31. jedoch Höchstauflösung Bildgebung des Mikrotubuli-Zytoskeletts sowie die koordinierte Reorganisation von Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons bei immun Synapse Bildung, wurde erst vor kurzem berichteten17. B-Bildzellen, die verteilt auf Deckgläsern beschichtet mit Anti-Immunglobulinen (Anti-Ig) Antikörper, die stimulieren, BCR Signalisierung und initiieren Zytoskelett Reorganisation durfte früher STED-Mikroskopie. Wenn auf immobilisierten Antikörper Anti-Ig verchromt, durchlaufen B-Zellen dramatische Aktin-abhängige verbreiten, die rekapituliert die ursprünglichen Ereignisse während immun Synapse Bildung. Wichtig ist, offenbart STED-Mikroskopie die feinen Details der dendritischen Ring der F-Aktin, die Formen an der Peripherie des Immunsystems synapse und zeigte, dass die MTOC sowie die Mikrotubuli befestigt ist, in der Nähe der Antigen-Kontakt-Seite17bewegt hatte. Diese Mikrotubuli verlängert nach außen in Richtung der Peripherie Ring des F-Aktin. Multi-Color STED Bildgebung verschiedener Kombinationen von F-Actin, Tubulin, IQGAP1, und GFP-markierten CLIP-170 + Tipps Ferner ergab, dass Mikrotubuli Plus-enden gekennzeichnet durch CLIP-170-GFP eng verbunden mit der peripheren Aktin-Geflecht und IQGAP1, waren ein kortikale Erfassung Protein17.
Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für imaging-Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der immun Synapse mit STED-Mikroskopie. Diese Methoden wurden optimiert mit der A20 murinen B-Zell-Linie, die am meisten beschäftigt war, für das Studium BCR Signal- und immun Synapse Bildung17,32,33,34,35 , 36 , 37 , 38 , 39. weil kommerzielle Antikörper auf CLIP-170 gut für Immunostaining in früheren Experimenten nicht funktioniert, beschreiben wir ausführlich die Expression von GFP-markierten CLIP-170 in A20 Zellen zusammen mit Färbung Protokolle zur Visualisierung von gleichzeitig bis zu drei Zellskelett Komponenten oder Zytoskelett-assoziierte Proteine. Methoden für die Verwendung von STED-Mikroskopie, Bild Aktin an NK Zelle immun Synapsen wurden40beschrieben. Hier reichen wir dies Höchstauflösung multi-Color-Bilder von der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons in B-Zellen zu erwerben.
Eine kritische Betrachtung für die Höchstauflösung Mikroskopie nutzt die entsprechende Fixierung-Verfahren für die Aufrechterhaltung der Zellstrukturen und vermeiden von Schäden an fluoreszierenden Proteinen. Die Fixierung und Färbung hierin vorgestellten Methoden wurden optimiert, um GFP Fluoreszenz zu behalten und bieten hochauflösende Bildgebung der Aktin und Mikrotubuli. Wenn fluoreszierende Proteine zum Ausdruck zu bringen, sollte angemerkt werden, dass B-Zellen in der Regel schwer zu transfizieren. Mithilfe dieses Protokolls 20-50 % von A20 express Zellen in der Regel den transfizierten GFP Fusionsprotein, und unter dieser Bevölkerungsgruppe sind die Ebenen der Proteinexpression variabel. Trotzdem super-Resolution Imaging von Aktin und Mikrotubuli, die mit den Verfahren, die wir beschreiben ist recht robust und qualitativ hochwertige Bilder sind leicht erhältlich. Trotz ihrer geringen Größe im Verhältnis zu A20 Zellen zeigen wir, dass diese Verfahren auch verwendet werden können, zum Bild der Mikrotubuli-Netzwerk im primären B-Zellen, die kurz mit Lipopolysaccharid (LPS) aktiviert wurden. Wir haben gezeigt, dass LPS aktiviert primäre B-Zellen mit siRNA mit relativ hohem Wirkungsgrad (d. h.so, dass Protein Erschöpfung durch Immunoblotting nachgewiesen werden kann), transfiziert werden können so dass sie eine gute Alternative zu der Verwendung von B-Zell-Linien für einige Studien 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Cell culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A20 mouse B-lymphoma cells</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;R0883</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td>Heat inactivate at 56 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C for 30 min</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Millipore Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Liquid, 10,000 units</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional materials for primary B cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70-&amp;micro;m cell strainer</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bead-based B cell isolation kit</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19854</td><td>EasySep Mouse B cell Isolation kit</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS from &lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;0111:B4</td></tr><tr><td>B cell-activating factor (BAFF)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2106-BF-010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Transfection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid encoding CLIP-170-GFP</td><td></td><td></td><td>Gift from Dr. Kozo Kaibuchi (Nagoya Univ., Nagoya, Japan); described in Fukata &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;Cell&lt;/strong&gt; 109:873-885, 2002</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Recommended transfection reagents and equipment &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofection kit V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Follow the manufacturer&#039;s directions for mixing the transfection reagents with the DNA</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector model 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program L-013 used</td></tr><tr><td>Falcon 6-well plates, TC treated, sterile</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coating coverslips&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18-mm diameter round #1.5 cover glasses</td><td>Thomas Scientific</td><td>1217N81</td><td>Similar product: Marienfield-Superior catalogue #117580</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>1381242</td><td>Dissecting extra fine splinter forceps</td></tr><tr><td>Falcon 12-well sterile tissue polystyrene tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-008</td><td>For A20 cells</td></tr><tr><td>Goat-anti-mouse IgM antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-005-020</td><td>For primary mouse B cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (16% stock solution)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde (50% stock solution)</td><td>Millipore Sigma</td><td>340855</td><td>Dilute with PBS to working concentration</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Millipore Sigma</td><td>S2149</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), Fraction V</td><td>Millipore Sigma</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-tubulin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab52866</td><td>1:250 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 532-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11009</td><td>1:100 dilution recommended but should be optimized</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjugated phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td>1:100 dilution recommneded but should be optimized</td></tr><tr><td>Prolong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36970</td><td>Without DAPI</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>P1150-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Microscopy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS STED microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Huygens deconvolution software</td><td>Scientific Voume Imaging</td><td></td><td>See https://svi.nl/HuygensProducts</td></tr></tbody></table>

visualizing the actin and microtubule cytoskeletons at the b-cell immune synapse using stimulated emission depletion (sted) microscopy

B-Zellen, die an Membran-gebundene Antigene (z.B.auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle) binden bilden eine immun Synapse, eine spezielle Zellstruktur, die B-Zell Rezeptor (BCR) Signalisierung optimiert und BCR-vermittelten Antigen Erwerb. Der Umbau des Aktin-Zytoskeletts und die Neuausrichtung des Mikrotubuli-Netzwerkes gegenüber der Antigen-Kontakt-Seite sind für immun Synapse Bildung unerlässlich. Umbau des Aktin-Zytoskeletts in einem dichten peripheren Ring des F-Aktin wird begleitet von Polarisation des Mikrotubuli-organizing Centers gegenüber immun Synapse. Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine, sowie kortikalen Plus-End Capture Proteine vermitteln physikalische Wechselwirkungen zwischen den Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons, die ihnen ermöglichen, in koordinierter Weise reorganisiert werden. Aufklärung der Mechanismen, Kontrolle, die das Zellskelett Reorganisation sowie verstehen wie diese Zellskelett Strukturen immun Synapse Bildung und BCR-Signalisierung, gestalten bieten neue Einblicke in die B-Zell-Aktivierung. Dies hat durch die Entwicklung von Super-Auflösung Mikroskopie Ansätzen unterstützt worden, die neue des Zytoskeletts Netzwerkorganisation Details. Wir beschreiben hier eine Methode für die Verwendung von stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und transfizierten GFP-Tags Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen. Um die frühen Ereignisse immun Synapse Bildung zu modellieren, ermöglichen wir den B-Zellen zu verbreiten auf Deckgläsern beschichtet mit Anti-Immunglobulinen (Anti-Ig) Antikörper, die BCR-Signalisierung und cytoskelett Umbau zu initiieren. Wir bieten detaillierte Protokolle für den Ausdruck von GFP Fusionsproteine in A20 B-Lymphom-Zellen, für die Verbreitung von Anti-Ig-induzierte Zelle und für nachfolgende Zelle Fixierung, Immunostaining, Bildaufnahme und Bild Dekonvolution Schritte. Die hochauflösenden Bilder mithilfe dieser Verfahren erlauben es, gleichzeitig visualisieren Aktin Strukturen, Mikrotubuli und die Mikrotubuli Plus-Ende bindende Proteine, die diese beiden Zellskelett Netzwerke verbinden können.

Für B-Zellen auf immobilisierte Anti-Ig zu verbreiten bietet STED-Mikroskopie, die in Verbindung mit Dekonvolution Software verwendet Bilder mit höherer Auflösung des Zytoskeletts Strukturen als konfokalen Mikroskopie. Dies zeigt sich in Abbildung 1, wo F-Aktin-Netzwerk mit dem oben beschriebenen Protokoll visualisiert wurde. Ein Vergleich der konfokalen und STED Höchstauflösung Bilder von der gleichen Probe zeigt, dass die STED-Bilder einer höheren Auf...

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Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Verwendung von STED-Mikroskopie, gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen, die auf Deckgläsern beschichtet mit Antikörpern gegen den B-Zell-Rezeptor, ein Modell für die Anfangsphase verbreitet haben der immun Synapse Formation.

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

B cells that bind to membrane-bound antigens (e.g., on the surface of an antigen-presenting cell) form an immune synapse, a specialized cellular structure ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy

13.7K Aufrufe.  University of British Columbia. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Verwendung von STED-Mikroskopie, gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen, die auf Deckgläsern beschichtet mit Antikörpern gegen den B-Zell-Rezeptor, ein Modell für die Anfangsphase verbreitet haben der immun Synapse Formation.

Serie: Visualizing the Actin and Microtubule Cytoskeletons at the B-cell Immune Synapse Using Stimulated Emission Depletion STED Microscopy

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoscopy

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic actin reorganization is critical to the function of NK cells and the formation of the IS. Imaging of F-actin at the synapse has traditionally utilized confocal microscopy, however the diffraction limit of light restricts resolution of fluorescence microscopy, including confocal, to approximately 200 nm. Recent advances in imaging technology have enabled the development of subdiffraction limited super-resolution imaging. In order to visualize F-actin architecture at the IS we recapitulate the NK cell cytotoxic synapse by adhering NK cells to activating receptor on glass. We then image proteins of interest using two-color stimulated emission depletion microscopy (STED). This results in &#60;80 nm resolution at the synapse. Herein we describe the steps of sample preparation and the acquisition of images using dual color STED nanoscopy to visualize F-actin at the NK IS. We also illustrate optimization of sample acquisition using Leica SP8 software and time-gated STED. Finally, we utilize Huygens software for post-processing deconvolution of images.

Visualization of the Immunological Synapse by Dual Color Time-gated Stimulated Emission Depletion STED Nanoscopy

Here we illustrate the protocol for imaging by two-color STED nanoscopy the cytotoxic immune synapse of NK cells recapitulated on glass. Using this method we obtain sub-100 nm resolution of synapse proteins and the cytoskeleton.

Visualisierung der immunologischen Synapse von Dual Color Zeitgesteuerte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie

Natural killer cells form tightly regulated, finely tuned immunological synapses (IS) in order to lyse virally infected or tumorigenic cells. Dynamic ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Hochaufgelöste Intravitalmikroskopie Striped-Beleuchtung von Keimzentren

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Ein Endothelial Planar Zellmodell für Imaging immunologischen Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Imaging the Human Immunological Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) and an effector helper T lymphocyte (Th) cell, and to record the images corresponding to the first stages of the IS formation and the subsequent trafficking events (occurring both in the APC and in the Th cell). These events will eventually lead to polarized secretion at the IS. In this protocol, Jurkat cells challenged with Staphylococcus enterotoxin E (SEE)-pulsed Raji cells as a cell synapse model was used, because of the closeness of this experimental system to the biological reality (Th cell-APC synaptic conjugates). The approach presented here involves cell-to-cell conjugation, time-lapse acquisition, wide-field fluorescence microscopy (WFFM) followed by image processing (post-acquisition deconvolution). This improves the signal-to-noise ratio (SNR) of the images, enhances the temporal resolution, allows the synchronized acquisition of several fluorochromes in emerging synaptic conjugates and decreases fluorescence bleaching. In addition, the protocol is well matched with the end point cell fixation protocols (paraformaldehyde, acetone or methanol), which would allow further immunofluorescence staining and analyses. This protocol is also compatible with laser scanning confocal microscopy (LSCM) and other state-of-the-art microscopy techniques. As a main caveat, only those T cell-APC boundaries (called IS interfaces) that were at the right 90&#176; angle to the focus plane along the Z-axis could be properly imaged and analyzed. Other experimental models exist that simplify imaging in the Z dimension and the following image analyses, but these approaches do not emulate the complex, irregular surface of an APC, and may promote non-physiological interactions in the IS. Thus, the experimental approach used here is suitable to reproduce and to confront some biological complexities occurring at the IS.

This protocol images both the immunological synapse formation and the subsequent polarized secretory traffic towards the immunological synapse. Cellular conjugates were formed between a superantigen-pulsed Raji cell (acting as an antigen-presenting cell) and a Jurkat clone (acting as an effector helper T lymphocyte).

Bildgebung der humanen immunologischen Synapse

The purpose of the method is to generate an immunological synapse (IS), an example of cell-to-cell conjugation formed by an antigen-presenting cell (APC) ...

Super-Resolution Imaging of NK Cell Immunological Synapse Formation on a Supported Lipid Bilayer

Source: Zheng, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/52502">Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for visualizing the formation of the immunological synapse in natural killer (NK) cells on a supported lipid bilayer (SLB). The SLB is first labeled with a fluorophore-tagged NK cell activating receptor ligand, followed by incubation with NK cells. Subsequently, the cells are stained for polymerized actin and perforin-positive lytic granules. This approach enables the visualization of synapse formation using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

Super-Resolution-Bildgebung der immunologischen Synapsenbildung von NK-Zellen auf einer gestützten Lipiddoppelschicht

1. Preparation of Liposomes

	Calculate the amount of chloroform-suspended stock solutions of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Source: Martinelli, R. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53288">An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Beurteilung der immunologischen Synapsentopologie durch Lebendzell-Bildgebung

1. Preparing Human CD4+&#160;Th1 Effector/Memory T Cells

	Apply a tourniquet to the arm of the donor, wipe the vein with alcohol, and insert a needle. ...

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

Zusammenfassung

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