Los anticuerpos monoclonales se conocen como anticuerpos monoespecíficos que se producen a partir de un único clon de linfocitos B y los anticuerpos monovalentes que se unen al mismo epítopo. Recientemente, el ELISA basado en anticuerpos monoclonales se ha convertido en nuestra plataforma emergente para el análisis cualitativo o cuantitativo de alimentos o productos naturales. Este método es un método preciso, sensible y eficaz sin pasos de pretratamiento tediosos.
Así que eso es lo esencial para las muestras biológicas y las futuras aplicaciones clínicas. La preparación de los mAR de la MTC es un paso vital en los estudios sobre las características complejas del sistema de la fórmula de la MTC. Hemos desarrollado un protocolo para generar mABs contra los pequeños compuestos moleculares, incluyendo la síntesis de antígenos artificiales, la inmunización con ratones y la fusión celular.
El hapten está conectado con la proteína portadora para sintetizar el antígeno artificial. El antígeno artificial y los adyuvantes completos se mezclan y emulsionan. El ratón fue inmunizado por inyección subcutánea.
Saque el bazo del ratón inmunizado y haga la suspensión de una sola célula. Mezclar las células del mieloma. Los splenocitos se aíslan y se fusionan con la línea celular de mieloma de ratón sensible al HAT por método PEG.
Seleccione una línea celular capaz de preparar anticuerpos mediante ELISA. Los hibridos que segregan anticuerpos monoclonales que son reactivos al antígeno se clonan. Establecer la línea celular de hibridoma es crioconservada.
Se utilizó un procedimiento de oxidación periodato para la síntesis de un conjugado de narigin BSA. En primer lugar, la narigina se disolvió a una concentración final de un miligramo por mililitro a 100 microlitros de solución de pariodato sódico recién preparada a cinco mililitros de la solución de narigin. Revuelva la mezcla a temperatura ambiente durante una hora.
En segundo lugar, añadir dos mililitros de proteína portadora a la mezcla de reacción periodoto de narigin sódico. Ajuste la mezcla a pH nueve solución y continúe reaccionando durante seis a ocho horas. En tercer lugar, el antígeno artificial fue purificado con el método de diálisis en PDS durante tres días para distanciar la CBS.
El adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto se utilizaron para la inmunización del ratón. Para la vacunación, mezclar 50 microgramos de conjugado con un volumen igual del adyuvante completo de Freund y emulsionar completamente. Administrar 100 microgramos de esta mezcla a cada ratón BALB/c mediante inyección subcutánea dorsal.
Proporcione una vacuna de refuerzo mediante inyección subcutánea dos semanas más tarde con la misma cantidad de conjugado mezclado con adyuvante incompleto. Para la inmunización primaria, el adyuvante completo y el inmunogen completos de Freund se utilizaron mediante inyección subdérmica. Para la inmunización de refuerzo, el adyuvante incompleto de Freund y el inmunogen se utilizaron mediante inyección subdérmica.
Para la inmunización de impacto sin adyuvante, sólo se utilizó inmunogen mediante inyección subdérmica o inyección intraperineal. Las células de la capa de alimentación se originaron principalmente a partir de células epiteliales abdominales o macrófagos. RPMI 1640 FBS y HAT se utilizaron para preparar el medio de pantalla HAT.
Suplemento de HAT se disolvió en 10 mililitros RPMI medio, luego añadido en 500 mililitros RPMI 1640 que contiene 20%FBS. Y el ratón ICR fue esterilizado por 75% alcohol etílico durante cinco minutos. Después de retirar el pelaje del abdomen con fórceps hemostáticos, desinfecte el área con 75% de etanol.
Corte la piel externa para exponer la cavidad abdominal. Inyecte tres mililitros de RPMI estéril 1640 medio en el abdomen. Luego masajee el abdomen para separar células adicionales en la solución.
Aspirar la suspensión de la célula fetal en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Después de centrifugar la suspensión celular durante 10 minutos a 1.000 g, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células fetales para obtener la suspensión de una sola célula. Después de este procedimiento, disuelva las células utilizando el medio HAT.
Cuente las células para que sean 100.000 por mililitro de los miembros de la célula. Transfiera las células a 96 placas de cultivo celular de pozo. Incubar las placas durante la noche a 37 grados, 5% dióxido de carbono.
El ratón inmunizado elegido fue esterilizado por 75% de alcohol etílico durante cinco minutos. Aspirar el medio RPMI 1640 como tampón de lavado. Retire la piel y el tejido muscular usando tijeras para exponer el bazo.
Aísle el bazo con cuidado de las pinzas. A continuación, lave el bazo en la RPMI 1640. Aísle el bazo y corte en pedazos.
Lentamente golpea el bazo. Luego se trató con un medio RMPI 1640 para disolver las células para preparar una suspensión de la célula del bazo. Después de eso, las celdas fueron filtradas por 800 cepas de celdas de malla.
Clava el bazo cuidadosamente para extirpar los tejidos grandes. Evitar grandes tejidos influye en la fusión de las células. Fue la suspensión de la célula del bazo con RPMI 1640 medio.
Luego se añadió la suspensión celular en el tubo de centrífuga. Cosecha las células del bazo por centrifugación a 1.000 g durante 10 minutos. Y luego desecha el sobrenadante.
Se suponía que las células del bazo estaban en la cantidad de mil millones a 10 mil millones. Retire las células de mieloma cultivadas y amplificadas de la incubadora y agite suavemente el matraz para obtener una suspensión celular. Fue la suspensión con RPMI dos veces.
Mezclar la suspensión de la célula del bazo y las células del mieloma. Cuente las células y ajuste la concentración. La ración final de las células del bazo a las células del mieloma debe ser de uno a cinco a uno a 10.
Centrifugar la mezcla celular y luego retirar el sobrenadante. Añadir un mililitro de 50% de solución de polietilenglicol a las células y agitar suavemente a 37 grados durante un minuto. De pie durante 30 segundos, añadir dos mililitros de RPMI 1640 medio e incubar a 37 grados durante dos minutos para terminar la reacción.
Añadir en dos mililitros RPMI por otro minuto. A continuación, agregue en 10 mililitros RPMI 1640. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos.
Descartando el sobrenadante, añadir la solución HAT y continuar cultivando las células durante siete días a 37 grados 5%dióxido de carbono. Después de siete días, los sobrenadantes celulares en 96 placas de pozo fueron aspirados después de la fusión celular y añadidos en placas ELISA pre-revestidas con antígeno de recubrimiento. Cultivado a 37 grados durante una hora, se añadió y cultivó anticuerpo secundario durante media hora.
Después de añadir 100 microlitros de solución de sustrato. Detengan la reacción. Para las placas ELISA en el lector de microplacas, se utilizó el método de punto final leer los datos a 450 nanómetros.
Medición de la absorbancia a 450 nanómetros y criba los hibridomas positivos. Utilice el método de dilución limitante para preparar los hibridomas monoclonales. Después de retirar el medio HD de los hibridos seleccionados, vuelva a suspender las células en RPMI 1640 y contarlas.
Diluir las células de una concentración de una célula, dos células y cuatro células por pozo por RPMI 1640 en una placa de 96 pozos y cultivo. Transfiera células de los hibridomas positivos a 24 placas de pozo, matraces de 25 y 75 centímetros cuadrados para el cultivo. Almacene los miodomas en una caja de enfriamiento de gradiente a menos 80 grados durante 24 horas.
A continuación, transfiera a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. El título de los antisueros fue determinado por ELISA indirecto. El ratón uno a cuatro fue inmunizado con el conjugado de narigin BSA fue significativamente más alto que el ratón de control sin vacunarse.
El título de uno a 5.000 es suficiente difusión. El peso molecular del conjugado hapten fue confirmado por el análisis MALDI-TOF. Como se muestra en la figura dos, como se conoce un peso molecular del estándar BSA y de narigin, podemos calcular y determinar que las moléculas de narigin se conjugaron con BSA.
Sólo el hibrido puede sobrevivir y crecer en los medios de selección HAT. Después de siete días de crecimiento, el cultivo celular puede ser probado por ELISA. Los hibridomas positivos fueron re-clonados y expandidos.
Estas imágenes muestran el resultado convencional para líneas celulares estables de hibridomo monoclonal y policlonal. El punto crítico de este experimento es el cribado de los mAbs específicos para el hapten, pero no la proteína portadora. La especificidad del mAb se examinó entonces en presencia de otros compuestos estructuralmente relacionados.
La reactividad cruzada se calculó para evaluar la especificidad de mAb para el antígeno. Se obtuvieron la curva de calibración de la naringina y el rango de revestimiento. Los hibridomas monoclonales específicos del antígeno se expandieron y crioconservaron en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
Después de ver este video, espero que tengas una buena comprensión de cómo generar anticuerpos monoclonales contra un pequeño compuesto molecular. Así que eso es todo. Gracias por su observación y buena suerte para sus experimentos.
