Моноклональные антитела известны как моноспецифические антитела, которые вырабатываются из одного клона B-лимфоцитов и моновалентных антител, которые связываются с тем же эпитопом. В последнее время моноклональные антитела на основе ELISA стала нашей новой платформой для качественного или количественного анализа пищевых продуктов или натуральных продуктов. Этот метод является точным, чувствительным и эффективным методом без утомительных шагов предварительной обработки.
Так что это необходимо для биологических образцов и будущих клинических применений. Подготовка МАБ ТКМ является жизненно важным шагом в изучении сложных системных характеристик формулы ТКМ. Мы разработали протокол для генерации mABs против небольших молекулярных соединений, включая синтез искусственного антигена, иммунизацию мышей и слияние клеток.
Хаптен связан с белками носителя для синтеза искусственного антигена. Искусственный антиген и полные адъюванты смешиваются и эмульгируется. Мышь была иммунизирована подкожной инъекцией.
Вынюхив селезенку иммунизированной мыши и сделайте одноклеточную подвеску. Смешайте клетки миеломы. Спеноциты изолированы и сливаются с чувствительной к HAT линией клеток миеломы мыши методом PEG.
Выберите клеточную линию, способную подготовить антитела ELISA. Гибридомы, сеющие моноклональные антитела, которые реагируют на антиген, клонируются. Установить линию клеток гибридомы криоконсервировано.
Процедура окисления периодата была использована для синтеза narigin BSA конъюгации. Во-первых, наригин растворялся при конечной концентрации одного миллиграмма на миллилитр при 100 микролитров свежеприготовленного раствора натрия до пяти миллилитров наригинового раствора. Перемешать смесь при комнатной температуре в течение одного часа.
Во-вторых, добавьте два миллилитров белка носителя в смесь реакции наригина натрия. Отрегулируйте смесь до рН девять раствора и продолжать реагировать в течение шести-восьми часов. В-третьих, искусственный антиген был очищен методом диализа в PDS в течение трех дней, чтобы отлягтить CBS.
Полный адъювант и неполный адъювант Фрейнд были использованы для иммунизации мышей. Для вакцинации смешайте 50 микрограммов конъюгации с равным объемом полного адъюванта Фрейнд и полностью омитете. Администрирование 100 микрограммов этой смеси для каждого BALB / C мыши через спинной подкожной инъекции.
Доставка бустерной вакцинации с помощью подкожной инъекции две недели спустя с тем же количеством конъюгата, смешанного с неполным адъювантом. Для первичной иммунизации, Фрейнд полный адъювант и иммуноген были использованы с помощью поддермальной инъекции. Для бустерной иммунизации, неполный адъювант Фрейнд и иммуноген были использованы с помощью поддермальной инъекции.
Для ударной иммунизации без адъюванта использовались только иммуногены с помощью поддермальной инъекции или внутриперинальной инъекции. Клетки кормового слоя в основном возникли из брюшных эпителиальных клеток или макрофага. RPMI 1640 FBS и HAT были использованы для подготовки СРЕДы экрана HAT.
ДОПОЛНЕНИЕ HAT растворяется в 10 миллилитров RPMI среды, а затем добавил в 500 миллилитров RPMI 1640, содержащий 20%FBS. А мышь МЦР была стерилизована 75%-ным этиловый спирт в течение пяти минут. После удаления меха из брюшной полости с гемостатических типсов, дезинфицировать область с 75%этанола.
Вырежьте внешнюю кожу, чтобы разоблачить брюшную полость. Введать три миллилитров стерильных RPMI 1640 среды в живот. Затем массируйте живот, чтобы отделить дополнительные клетки в раствор.
Аспирировать подвеску клетки плода в 15 миллилитровую центрифугу. После центрифугирования клеточной суспензии в течение 10 минут при 1000г, отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки плода, чтобы получить одноклеточную суспензию. После этой процедуры растворите клетки с помощью среды HAT.
Подсчитайте клетки, чтобы сделать их 100 000 на миллилитр от членов ячейки. Передача клеток в 96 хорошо пластины культуры клеток. Инкубировать пластины на ночь при 37 градусах, 5%углекислого газа.
Выбранная иммунизированная мышь была стерилизована на 75% этилового спирта в течение пяти минут. Аспират RPMI 1640 среды в качестве стирального буфера. Удалите кожу и мышечную ткань с помощью ножниц, чтобы разоблачить селезенку.
Изолировать селезенку пинцетом тщательно. Затем мыть селезенку в RPMI 1640. Изолировать селезенку и разрезать на кусочки.
Медленно фунт селезенки. Затем он был обработан RMPI 1640 среды для растворения клеток для подготовки селезенки клеточной подвески. После этого клетки были отфильтрованы 800 сетчатым клеточным ситечком.
Ногти селезенки тщательно удалить большие ткани. Избежание больших тканей влияет на слияние клеток. Была подвеска клетки селезенки с RPMI 1640 среды.
Затем подвесной клетки был добавлен в центрифугу трубки. Урожай клеток селезенки путем центрифугации на 1000г в течение 10 минут. А потом отбросить супернатант.
Клетки селезенки должны были быть на сумму от одного миллиарда до 10 миллиардов. Удалите культивируемые и усиленные клетки миеломы из инкубатора и аккуратно встряхните колбу, чтобы получить подвес клетки. Была подвеска с RPMI дважды.
Смешайте подвеску клеток селезенки и клетки миеломы. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию. Окончательный рацион клеток селезенки к клеткам миеломы должен быть от одного до пяти к одному до 10.
Центрифуга клеточной смеси, а затем удалить супернатант. Добавьте в клетки один миллилитр 50%полиэтиленгликольного раствора и аккуратно перемешайте при 37 градусах в течение одной минуты. Стоя в течение 30 секунд, добавить два миллилитров RPMI 1640 среды и инкубировать при 37 градусов в течение двух минут, чтобы прекратить реакцию.
Добавить в два миллилитров RPMI еще на одну минуту. Затем добавьте в 10 миллилитров RPMI 1640. Центрифуга при 800г в течение 10 минут.
Отбрасывая супернатант, добавьте раствор HAT и продолжайте культивировать клетки в течение семи дней при 37 градусах 5%углекислого газа. После семи дней, клеточные супернатанты в 96 пластин хорошо были аспирированы после слияния клеток и добавлены в пластины ELISA предварительно покрыты покрытием антигена. Культивируемые при 37 градусах в течение одного часа, вторичные антитела были добавлены и культивированы в течение получаса.
После добавления 100 микролитров субстратного раствора. Остановите реакцию. Для пластин ELISA в считыватель микропластичек использовался метод конечной точки для чтения данных на 450 нанометров.
Измеренное поглощение на 450 нанометров и экран положительных гибридом. Используйте ограничивающий метод разбавления для подготовки моноклональных гибридом. После удаления HD среды из выбранных гибридом, повторно приостановить клетки в RPMI 1640 и считать их.
Разбавить клетки концентрации одной клетки, двух клеток и четырех клеток на колодец RPMI 1640 в 96 хорошо пластины и культуры. Передача клеток из гибридом, которые являются положительными для 24 пластин хорошо, 25 и 75 квадратных сантиметров колбы для выращивания. Храните миодомы в градиентной коробке охлаждения при температуре минус 80 градусов в течение 24 часов.
Затем перенесите на жидкий азот для длительного хранения. Titer антисерумов были определены косвенным ELISA. Мышь от одного до четырех была иммунизирована с narigin BSA конъюгат был значительно выше, чем мышь управления без иммунизации.
Рейтер от одного до 5000 является достаточным диффузии. Молекулярный вес конъюгата гаппена был подтвержден анализом MALDI-TOF. Как показано на рисунке два, как молекулярный вес стандарта BSA и наригин были известны, мы можем вычислить и определить, что молекулы наригина были спряжены с BSA.
Только гибридома может выжить и расти в HAT выбора средств массовой информации. После семи дней роста, культура клеток может быть проверена ELISA. Положительные гибридомы были повторно клонированы и расширены.
Эти изображения показывают обычный результат для стабильных моноклональных и поликлональных линий клеток гибридомы. Критическим моментом этого эксперимента является скрининг mAbs, специфичных для hapten, но не несущего белка. Специфика mAb затем были изучены в присутствии других структурно связанных соединений.
Перекрестная реактивность была рассчитана для оценки специфичности mAb для антигена. Получена кривая калибровки нарингин и диапазон лайнера. Антигенные моноклональные гибридомы были расширены и криоконсервированы в жидком азоте для длительного хранения.
После просмотра этого видео, я надеюсь, у вас есть хорошее понимание того, как генерировать моноклональные антитела против небольших молекулярных соединений. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачу в ваших экспериментах.
