The authors acknowledge the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF, Grant No: 03IPT7030X, 03IPT703A, and 03IP703) for funding our projects, "Artificial immune reactions," "Camelid antibodies," and "Antibody technologies." We thank Prof. Burkhard Micheel for proofreading the manuscript and for the helpful comments.

Balb / c o ratones NMRI (Mus musculus) de nuestra colonia de cría de la Universidad de Potsdam (Potsdam, Alemania) se utilizaron para la producción de anticuerpos monoclonales. El trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes. El estudio fue aprobado por el Ministerio de Medio Ambiente Brandenburg, salud y protección del consumidor (número de referencia V3-2347-A16-4-2012). 1. Preparación de inmunoconjugados <ol><li> Para el acoplamiento del antígeno a un vehículo, utilizar los protocolos estándar de acoplamiento a través de amino-, carboxi, sulfo o grupos, tales como por glutaraldehído, N - (3-dimetilaminopropil) - N etilcarbodiimida (EDC), o N - [y-maleimidobutiriloxi éster succinimida] (sulfo-GMBS). </li><li> Para el acoplamiento (por ejemplo, con glutaraldehído) 13, utilizar la proteína diana o péptido y el portador (ovoalbúmina, albúmina de suero bovino, o hemocianina de lapa de ojo de cerradura) en una proporción de 1: 1. Se diluye el objetivo prOtein o péptido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y la proteína portadora en NaHCO mM tampón 3 50. Adaptar el volumen y la concentración de la cantidad necesaria para las inmunizaciones. <ol><li> Mezclar las dos soluciones y añadir 1,25% de glutaraldehído. Mezclar e incubar la muestra durante 4 h a temperatura ambiente (RT). Para seleccionar las células de hibridoma, que el mismo inmunoconjugado, pero con otro vehículo, a fin de evitar la selección de ligantes portadores inespecíficos. </li></ol></li><li> Se dializa la muestra de acoplamiento mediante la realización de una diálisis rápida con resina comercial grueso (por ejemplo, Sephadex G25). <ol><li> Perforar el fondo de un vial de reacción de 1,5 ml con una aguja hueca y colocarlo en un tubo de 15 ml. Poner la lana de vidrio en la parte inferior para el sellado y se cubre con 300 mg de resina gruesa (hasta la marca de calibración de 0,5 ml). </li><li> Con cuidado, ponga 1 ml de PBS gota a gota en un tubo de reacción de 1,5 ml y asegúrese de que la lana de vidrio todavía está sellando la perforación. Dejar que la resina s gruesabien y se centrifuga la columna a 500 xg durante 2 min. Un tal columna se puede utilizar para dializar 200 l de la muestra de acoplamiento. Para volúmenes mayores, hacer más columnas. </li><li> Cambiar el tubo y dejar caer la solución de acoplamiento sobre la resina gruesa hinchado. Centrifugar de nuevo a 500 xg durante 2 min. Retire el eluyente desde el tubo y lo utilizan para la inmunización. </li></ol></li></ol> 2. Inmunización de Animales <ol><li> Elija ratones dos o tres de 6 a 12 semanas de edad Balb / c para la inmunización. </li><li> Para un animal, preparar 150 - 200 mg del inmunoconjugado en 200 l de PBS y se mezcla con 100 l de adyuvante completo Freund&#39;s (CFA). Mezclar la solución 3 veces con una aguja corta y delgada (0,6 mm de diámetro) en una jeringa de 1 ml. Se inyecta la solución por vía intraperitoneal en el ratón. </li><li> Dar una inyección de refuerzo 6 semanas más tarde con la misma cantidad de inmunoconjugado, pero sin CFA. Tomar la sangre 7 días más tarde (fuera del seno retroorbital) y la AEEre el suero mediante la incubación de la sangre durante 3 - 4 h a temperatura ambiente (RT). <ol><li> Centrifugar la mezcla a 3000 xg durante 5 min. Tomar el sobrenadante en el suero y la transfiere a un nuevo tubo. Almacenarlo a -20 ° C. Se desecha el precipitado. </li></ol></li><li> Analizar el suero mediante ELISA, tal como se describe en el paso 3. Para la fusión, elegir el ratón con el título más elevado en suero. </li><li> En preparación para la fusión celular, aumentar el ratón con 150 a 200 mg del inmunoconjugado en 300 l de PBS sin adyuvante sólo 4 días antes de la fusión. </li></ol> 3. ELISA <ol><li> Preparar una solución de antígeno con una concentración de 5 mg / ml en PBS y transferir 50 l en cada ELISA pocillo de una placa de 96 pocillos. </li><li> Incubar la placa durante 2 horas a 37 ° C o durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. </li><li> Lavar la placa 3 veces con agua del grifo. Bloquear los pocillos con 80 l de suero de ternera neonatal PBS / 5% (NCS) por pocillo durante 1 h a TA en un ch húmedoámbar. Preparar las diluciones de suero en una proporción 1: 5 series empezando por 1:50. Para el análisis del cultivo celular, utilizar el sobrenadante de cultivo sin diluir. </li><li> Lavar la placa 3 veces con agua del grifo. Pipeta de 50 l de la muestra por pocillo y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda. Preparar la solución de anticuerpo secundario en una dilución 1: 5000 de un anticuerpo anti-ratón IgG de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP). </li><li> Lavar la placa 3 veces con agua del grifo y se añaden 50 l de la solución de anticuerpo secundario por pocillo. Incubar durante 45 min a TA en una cámara húmeda. </li><li> Preparar una solución de sustrato fresco. Hacer las soluciones madre de M NaH 2 PO 4 peróxido de hidrógeno al 0,1 y 0,1%. Tome 5 partes NaH 2 PO 4, 4 partes de peróxido de hidrógeno y 1 parte de tetrametilbencidina para la solución de sustrato fresco. <ol><li> Lavar la placa 10 veces con agua del grifo. Pipetear 50 l de solución de sustrato fresco en los pocillos e incubar durante 5 a 10 min en eloscuro. </li></ol></li><li> Detener la reacción con 50 l 1 MH 2 SO 4 por pocillo. El uso de un lector de placas, se mide la densidad óptica a 450 nm con una longitud de onda de referencia a 630 nm. </li></ol> 4. Preparación de cultivos celulares de mieloma <ol><li> A partir de ahora, lleve a cabo todo el trabajo en condiciones estériles. </li><li> Preparar un nuevo medio de cultivo para el cultivo celular. Suplemento 500 ml de RPMI1640 con 10% de suero fetal de ternera (50 ml), 2 mM L-glutamina (5 ml), y 50 mM mercaptoetanol (5 ml). Sustituir la glutamina cada 7 días. </li><li> Descongelar un vial de 0 murinos células SP2 / en agua tibia. Transferir la solución de células en 10 ml de medio de cultivo fresco y se centrifuga durante 10 min a 200 x g. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de medio de cultivo fresco. </li><li> La transferencia de las células en un 25-cm 2 matraz y se incuban a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora. Expandir las células para dos de 75 m 2 frascos befde fusión de mineral. Conserve alícuotas para almacenamiento a largo plazo, como se describe en el Paso 7. </li></ol> 5. Preparación de células alimentadoras <ol><li> Sacrificar un ratón de 12 semanas de edad NMRI (de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales, por ejemplo, mediante inhalación de CO2). Retire la piel y el limpiar el abdomen con un 70% de etanol. </li><li> Inyectar 5 ml de medio RPMI enfriado con hielo en el abdomen, un masaje en el abdomen con una pinza, y aspirar la suspensión de células de alimentación. Colocar las células en un tubo de vacío de 50 ml. Realice este paso una vez más. 7 a 10 ml de la suspensión de células de alimentación deben ser recuperados. </li><li> Preparar una suspensión de células de alimentación de 100 ml mediante la adición de 90 ml de medio de cultivo celular completo (RPMI 1640, 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, y 50 mM mercaptoetanol). Mezclar y transferir 100 l / pocillo en placas de cultivo celular de 10 x 96 pocillos. Se incuban las placas durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2 en una incubadora. </li></ol> 6. Fusión Celular<ol><li> Sacrificar el ratón inmunizado por dislocación cervical o inhalación de CO2 y extirpar el bazo 14. Tomar la sangre adicional desde el corazón y preparar el suero, como se describe en el paso 2.3, como control positivo en el ELISA. </li><li> Preparar una suspensión de células de bazo presionando el bazo a través de un filtro de células. Llenar hasta 20 ml con medio de cultivo celular completo. Recoger las células en tubos de 50 ml por centrifugación (200 xg, 10 min, y 4 ° C). Descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar el matraz de cultivo de células y recoger las células de mieloma por centrifugación (200 xg, 10 min, y 4 ° C) y descartar el sobrenadante. </li><li> Resuspender los sedimentos celulares en 20 ml de tampón de sal equilibrada (BSS) (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, 4 mM CaCl 2, 2,5 mM MgCl 2, y mM Tris-HCl 5; pH 7,4) y se centrifuga de nuevo. Repita los pasos del lavado tres veces. </li><li> Para ajustar el esplenocitos: proporción de células de mieloma, contar las células después de la segunda etapa de lavado de abetosst resuspender el sedimento en 1 ml de tampón BSS. Hacer una dilución 1:10 y transferir 10 l a una cámara de recuento celular. Contar las células y determinar la concentración de células en 1 ml. </li><li> Ajustar el número de células en el tampón de BSS a tres piezas de esplenocitos y células de mieloma de una sola parte en un volumen final de 1 ml. Tomar 200 l de la suspensión celular y se mezcla con 200 l de PEG8000 (1 g en 4 ml de tampón BSS). Transferir los 400 l en una cubeta de electroporación con un diámetro de 2 mm y establecer el impulso (600 a 650 V y 25 ms). <ol><li> Después del pulso, se incuban las células a temperatura ambiente durante 3 min en la cubeta. Eliminar las células y los pusieron gota a gota en un matraz Erlenmeyer con 100 ml de HAT Medio (RPMI 1640, 10% FCS, glutamina 2 mM, mercaptoetanol 50 mM, 100 mM hipoxantina, 5,8 M azaserina, y 16 mM timidina). </li><li> Repita la fusión 4 veces hasta que se gasta el lote de 1 ml. Incubar el matraz Erlenmeyer durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2en una incubadora. </li></ol></li><li> Complementar la suspensión celular de nuevo con hipoxantina, azaserina, y timidina antes en placas las células en la capa alimentadora. Añadir 100 ml de la suspensión celular por pocillo a las placas de capa de alimentación y se incuban las placas a 37 ° C y 5% de CO 2 (en una incubadora). La concentración final dentro del pozo debe ser de 100 hipoxantina M, 5,8 M azaserina, y 16 mM de timidina. </li><li> Realizar un análisis microscópico (ampliación: lente objetivo de 10X, 10X ocular) para el crecimiento clonal en cada pocillo de la placa después de 7 días con el fin de determinar si los pozos son mono- o policlonal. células monoclonales son un grupo de células que se originan a partir de una sola célula. células policlonales son múltiples grupos de células en un pocillo. Cambiar el medio completo después de 7 días y se incuba de nuevo durante 7 días en un medio HAT. </li><li> Cambiar el medio HAT y cultivar las células en medio de cultivo celular completo. Utilice el sobrenadante para realizar un ELISA, como se describe en el paso 3. Las células de hibridoma positivas debe ser ampliado en placas de 24 pocillos de acuerdo a las pruebas para la producción de anticuerpos específicos. Si las células son policlonales, una dilución limitada se tiene que realizar (que se describe en el paso 8). </li></ol> 7. La crioconservación de hibridomas <ol><li> Cryoconservé mono- positivo y hibridomas policlonales para el almacenamiento a largo plazo. Recoger las células de una placa de 24 pocillos con una confluencia de&gt; 60% mediante centrifugación (200 xg, 10 min, y 4 ° C). </li><li> Resuspender el precipitado en 500 l de medio de cultivo celular completo y la transfiere en un tubo criogénico. Añadir 500 l de medio de congelación (RPMI 1640, FCS al 20%, y 15% de dimetilsulfóxido), se mezcla, y lo puso en una caja de espuma de poliestireno en una caja de congelación o especial. Almacenar a -80 ° C durante 3 días. Después de 3 días, el criotubo se puede transferir a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol> 8. dilución limitante de anticuerpos policlonales Los hibridomas <ol><li> Makea cultura capa de alimentación, como se describe en el paso 5. Cosecha células policlonales positivos, como se describe en el paso 7.1. Contar las células, como se describe en el paso 6.5, y ajustar el número de células a 10 células / ml, con un volumen final de 10 ml para una placa de 96 pocillos. Añadir 100 ml / pocillo a la capa de alimentación. </li><li> Incubar durante 7 días a 37 ° C y analizar el crecimiento clonal microscopio (ampliación: 10X lente objetivo, 10X ocular). Hacer un ELISA del sobrenadante del cultivo, como se describe en el paso 3, e identificar los hibridomas monoclonales apropiados para la cultura de masas. </li></ol> 9. Cultura de Masas y purificación de anticuerpos monoclonales <ol><li> La transferencia de los hibridomas monoclonales con las señales de ELISA apropiadas para 25 cm 2 o matraces de 75 cm2 y obtener hasta 500 ml del sobrenadante del cultivo. Prueba de la semana de cultivo para la producción de anticuerpos específicos y conservar 3 - 5 alícuotas por hibridoma para el almacenamiento a largo plazo, tal como se describe en el paso 7. </li><li&gt; Centrifugar el sobrenadante de cultivo a 4.900 xg y 4 ° C durante 15 min y filtrar a través de un filtro de 0,45-micras. Mezclar el sobrenadante con tampón (4 M NaCl y 2 M de glicina NaOH, pH 8,9) de unión en una proporción de 3: 1. </li><li> Preparar una columna de proteína mediante el lavado con tampón de lavado (diluir el tampón de unión 1: 3 en dH 2 O). Pasar el sobrenadante de la Etapa 9.2 sobre la columna y se recoge el flujo a través. Eluir el anticuerpo unido con 0,1 M de citrato, pH 3,5 y neutralizar el pH inmediatamente con 500 l de Tris-HCl, pH 9,0. </li><li> Caracterizar el anticuerpo eluido por SDS-PAGE, Western Blot y ELISA, y validarlo para la aplicación final. <ol><li> Para el SDS PAGE, tome 3 - 5 de g de solución de anticuerpo purificado por carril (una muestra de 20 l), añadir 5 l de tampón de carga de muestra 4x SDS (SDS al 8%, 20% de 2-mercaptoetanol, 40% de glicerina, y 0,015 % de bromofenol, reducida), y calentar las sondas en 95 ° C durante 5 min. Como control, utilizar la misma muestra con un una purificadontibody del mismo isotipo pero especificidad irrelevante. </li><li> Cargar las muestras en un gel de SDS 12,5%, coloque 5 l de una escalera de proteína sin teñir en un carril adicional, y separarlos por electroforesis. Teñir el gel con azul brillante de Coomassie y documentar los resultados. Un protocolo básico SDS fue establecido por Laemmli en 1970 15. </li></ol></li></ol>

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The authors Pamela Holzl&#246;hner and Katja Hanack are the co-founders of new/era/mabs GmbH, a company that offers the customized generation of monoclonal antibodies.

La generación de anticuerpos monoclonales mediante tecnología de hibridoma requiere un análisis intenso y detallado epítopo, especialmente con respecto a la aplicación final, cuando el anticuerpo debería reconocer el objetivo. Esto es a menudo subestimada por los usuarios y conduce a los anticuerpos con los pobres resultados. El proceso de fusión es siempre aleatorio, lo que significa que el resultado de hibridomas específicos es altamente dependiente de la relación de células y la vitalidad en este punto. Des...

La tecnología de hibridomas se presenta en este protocolo fue descrito por primera vez por Köhler y Milstein 1 en 1975 y, a excepción de algunas mejoras técnicas, el procedimiento principal no ha cambiado drásticamente durante los últimos 40 años 2. El objetivo de este protocolo es para explicar una estrategia más apropiada inmunización, un método estándar para la generación de anticuerpos monoclonales, y un ejemplo de un método de validación (ELISA). Los anticuerpos son herramientas increíbles y contribuyen a una amplia gama de enfoques tecnológicos, tales como citometría de flujo, clasificación de células magnético, o de inmunofluorescencia, así como a las opciones diagnósticas y terapéuticas para el seguimiento y tratamiento 3 enfermedad. La disponibilidad comercial de anticuerpos monoclonales para los objetivos deseados se demuestra por la presencia de más de 24 diferentes bases de datos web con casi innumerables cantidades de anticuerpos o productos relacionados con anticuerpos 4. En 2015, unantibody moléculas eran parte de una discusión internacional 5-7 debido a serios problemas en la validación y caracterización de anticuerpos disponibles comercialmente correcta. Puede ser difícil y costoso para encontrar anticuerpos específicos para un antígeno específico, y, a menudo, no tienen la afinidad o especificidad necesaria. A pesar de generar un anticuerpo es todavía mucho tiempo y requiere de personal capacitado para desarrollar y validar el anticuerpo, que produce un anticuerpo individualmente puedan mejor que comprar uno. Debido al hecho de que la producción de anticuerpos es mucho tiempo y requiere experiencia, se han desarrollado métodos alternativos para la producción de moléculas de unión para superar estos problemas. El método alternativo más comúnmente utilizada es la producción recombinante de anticuerpos de cadena única a través de presentación en fagos. Los genes de la región variable de unión se extraen de las células y se combinan con la proteína de revestimiento de un fago. los scadena ingle se expresa entonces en la superficie de un bacteriófago y se tamiza en varios pasos paneo 8. La producción de anticuerpos de cadena única es un poco más rápido, pero también requiere un experimentador experto. Las desventajas de algunos anticuerpos de cadena simple recombinantes son una mala estabilidad y una falta de idoneidad para el diagnóstico in vitro. En la mayoría de las pruebas de diagnóstico, un Fc-receptor para la detección es necesario, que debe ser añadido a un anticuerpo de cadena sencilla recombinante después. De nuevo, esto es mucho tiempo y es aún más compleja que la técnica de hibridoma. En el diagnóstico in vitro, los anticuerpos monoclonales de ratón de longitud completa y de conejo se han demostrado ser la mejor opción. Uno de los pasos más importantes en la generación de anticuerpos monoclonales se debe hacer antes de que el trabajo en el laboratorio a partir: el diseño del inmunoconjugado. Las preguntas que deben abordarse son: ¿Cuál es la composición física del objetivo en el último applicationes, y cuyas matrices están presentes? Cuya concentración será el objetivo de tener en la aplicación? ¿Cuál es la aplicación final, y cuáles son los requisitos que debe cumplir el anticuerpo? Siempre tener en cuenta que si se utiliza un fragmento de péptido lineal, sino que también tiene que ser lineal en el epítopo final en la diana de elección; de lo contrario, el anticuerpo no se unirá. Por supuesto, independiente del método de selección, los anticuerpos podrían ser seleccionados para reconocer diferentes formatos antigénicos en diferentes aplicaciones, pero esto deben ser validados con mucha precisión. Estas son las razones por las cuales el desarrollo de anticuerpos y la validación son tales procesos ambiciosos. La elección del formato antigénico para la inmunización es fundamental para el desarrollo de anticuerpos y determina el éxito o el fracaso de este proceso. Una vez que los ratones expresan un título de anticuerpos relevantes, se aíslan las células del bazo y se fusionan con células de mieloma. Las líneas celulares de mieloma más comunes parael desarrollo de anticuerpos monoclonales murinos son X63-Ag 8.653 9 y Sp2 / 0-Ag 14 10 de un / c cepa de ratón Balb. Las células descienden de un linfoma de células B malignas y se seleccionaron debido a que no secretan cualquiera de sus propias cadenas pesadas o ligeras. Las células pueden adaptarse a una relación de entre 1:10 y 10: 1 (esplenocitos frente a las células de mieloma). En este protocolo, las células se adaptan a una proporción de 3: 1 y se fusionan por polietilenglicol (PEG) y electrofusión, de acuerdo con Stoicheva y Hui 11. La fusión de las células B y las células de mieloma es un proceso aleatorio. Por lo tanto, los híbridos de dos B linfocitos o dos células de mieloma se podrían generar, pero los híbridos que no serían capaces de sobrevivir durante un largo tiempo en cultivo. Las células se someten a una selección de hipoxantina, aminopterina, y timidina (HAT), mediante el cual sólo las células de hibridoma fusionadas pueden sobrevivir debido a la posibilidad de utilizar la vía de novo de la síntesis de pirimidina. Para la generación de lunoclonal anticuerpos, es necesario obtener una línea celular procedente de una célula madre. El monoclonalidad se garantiza mediante la limitación de las técnicas de dilución y el análisis microscópico de crecimiento celular. Los sobrenadantes del cultivo de hibridoma se criban para la producción de anticuerpos específicos, principalmente por ELISA o citometría de flujo, y los mejores aglutinantes se seleccionan. Después de la cultura de masas y la purificación, la molécula de anticuerpo, finalmente, se puede caracterizar y validado para la aplicación deseada.

<table><tbody><tr><td>glutaraldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(3-dimethylaminopropyl)-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-ethylcarbodiimide (EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-GMBS</td><td>Perbio Science Germany</td><td>22324</td><td></td></tr><tr><td>ovalbumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>bovine serum albumin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>keyhole limpet hemocyanin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8283</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91015</td><td></td></tr><tr><td>reaction vials, 1.5 mL</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>CNT2.1</td><td></td></tr><tr><td>hollow needle</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>glass wool</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6574.1</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 coarse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GE-17-0034-02</td><td></td></tr><tr><td>Freund&amp;acute;s adjuvant, complete</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F5881-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ELISA plates, 96 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>neonatal calf serum</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S1025</td><td></td></tr><tr><td>TipOne Tips 1,000 &amp;micro;L</td><td>Starlab</td><td>S1111-2021</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips 200 &amp;micro;L</td><td>Greiner bio-one</td><td>739291</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td><td>Dianova</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>tetramethylbenzidine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>6350.2</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdihydrogenphosphat</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>peroxide/urea</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sulphuric acid</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4623.3</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies GmbH</td><td>31870074</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>HN08.2</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V025</td><td></td></tr><tr><td>TC-flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Peske GmbH</td><td>86-V075</td><td></td></tr><tr><td>ethanol, 96%</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>P075.1</td><td></td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>VWR international</td><td>734-0002</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P91050</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>electroporation cuvette, 2 mm</td><td>Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K.</td><td>EKL2,25</td><td></td></tr><tr><td>hypoxanthine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H9636-25G</td><td></td></tr><tr><td>azaserine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4142</td><td></td></tr><tr><td>thymidine</td><td>USB Europa GmbH</td><td>22305 1 GM</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 96 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92696</td><td></td></tr><tr><td>TC-plates 24 well</td><td>Biochrom GmbH</td><td>P92424</td><td></td></tr><tr><td>cryotubes, 1 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V7384-1CS</td><td></td></tr><tr><td>dimethylsulfoxide</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>4720.1</td><td></td></tr><tr><td>protein A sepharose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3391-1G</td><td></td></tr><tr><td>SDS sample loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; C0.KG</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>unstained protein ladder</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0363</td><td></td></tr><tr><td>comassie brilliant blue R-250</td><td>BioRad Laboratories</td><td>161-0406</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of murine monoclonal antibodies by hybridoma technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

La figura 1 muestra un ejemplo de la titulación de suero específico de antígeno para una inmunización realizada en el laboratorio. En esta figura, los sueros inmunes A y B se titularon de 1:50 a 1: 5.000.000 en comparación con un suero de un ratón ingenuo. El antígeno se recubre sobre la fase sólida, y los anticuerpos específicos se detectaron con un anticuerpo anti-Ig de ratón de cabra conjugado con POD. Ambos sueros de los ratones inmunizados mostraron un tí...

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Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

41.5K vistas.  University of Potsdam. An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening. 

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Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating histoplasmosis caused by the fungus Histoplasma capsulatum and 2) to examine the role of virulence factors as target for therapy. To generate mAbs, mice are immunized, the immune responses are assessed using a solid phase ELISA system developed in our laboratory, and the best responder mice are selected for isolation of splenocytes for fusion with hybridoma cells. C57BL/6 mice have been extensively used to study H. capsulatum pathogenesis and provide the best model for obtaining the data required. In order to assess the role of the mAbs in infection, mice are intraperitoneally administered with either mAb to H. capsulatum or isotype matched control mAb and then infected by either intravenous (i.v.), intraperitoneal (i.p.), or intranasal (i.n.) routes. In the scientific literature, efficacy of mAbs for fungal infections in mice relies on mortality as an end point, in conjunction with colony formin units (CFU) assessments at earlier time points. Survival (time to death) studies are necessary as they best represent human disease. Thus, efficacy of our intervention would not adequately be established without survival curves. This is also true for establishing efficacy of vaccine or testing of mutants for virulence. With histoplasmosis, the mice often go from being energetic to dead over several hours. The capacity of an intervention such as the administration of a mAb may initially protect an animal from disease, but the disease can relapse which would not be realized in short CFU experiments. In addition to survival and fungal burden assays, we examine the inflammatory responses to infection (histology, cellular recruitment, cytokine responses). For survival/time to death experiments, the mice are infected and monitored at least twice daily for signs of morbidity. To assess fungal burden, histopathology, and cytokine responses, the mice are euthanized at various times after infection. Animal experiments are performed according to the guidelines of the Institute for Animal Studies of the Albert Einstein College of Medicine.

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

C57BL/6 mice have been used to study Hc pathogenesis and provide the best model. We are exploring the potential benefits of humoral immunity against this fungus and generated several mAbs [to histone H2B and a heat shock protein 60kDa] that we tested for their protective efficacy after intraperitoneal administration.

Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Investigación

Inmunología e Infección

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response without any interference such as low protein expression, enzyme inactivity, or structural changes. This makes APN an attractive candidate in the development of vaccines that selectively target the mucosal epithelium. Previous studies have shown that APN is a receptor protein for both enterotoxigenic Escherichia coli (E. coli) F4 and transmissible gastroenteritis virus. Thus, APN shows promise in the development of antibody-drug conjugates or novel vaccines based on APN-specific antibodies. In this study, we compared production of APN-specific monoclonal antibodies (mAbs) using traditional hybridoma technology and recombinant antibody expression method. We also established a stably transfected Chinese hamster ovary (CHO) cell line using pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN and an E. coli expression BL21(DE3) strain harboring the pET28a (+)-rAbs-APN vector. The results show that antibodies expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and mAbs produced using hybridomas could recognize and bind to the APN protein. This provides the basis for further elucidation of the APN receptor function for the development of therapeutics targeting different APN-specific epitopes.

The recombinant antibody protein expressed in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO cells and monoclonal antibodies produced using traditional hybridoma technology can recognize and bind to the porcine aminopeptidase N (APN) protein.

Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Antibody Generation: Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Polyclonal antibodies are defined as a collection of antibodies directed against different antigenic determinants of an antigen or several antigens (1). While polyclonal antibodies are powerful tools for identifying biological molecules, there is one important limitation - they are unable to distinguish between antigens that share antigenic determinants. For example, when bovine serum albumin is used to immunize an animal, B cells with different surface Ig will respond to different antigenic determinants on bovine serum albumin. The result is a mixture of antibodies in the antiserum. Because bovine serum albumin shares some epitopes with human serum albumin in evolutionarily conserved regions of the protein, this anti-bovine serum albumin antiserum will also react with human serum albumin. Therefore, this antiserum will not be useful for distinguishing between bovine and human serum albumins.
Several approaches have been taken to overcome the specificity issue of polyclonal antisera. One is by absorbing the unwanted antibodies by passing the antiserum through a chromatography column of immobilized antigens (2). This method is tedious and frequently unable to completely remove the unwanted antibodies. Another approach is to isolate individual antibody-producing B cells and expand them in culture. However, like most normal untransformed cells, B cells do not survive in long-term culture.
To overcome the inability of B cells to survive in culture, one approach is to prepare a myeloma-B cell hybridoma. In 1847, Henry Bence-Jones discovered that patients with multiple myeloma, a lymphoid tumor, produced a large quantity of antibodies (3). B cells in these patients have become malignant and grow uncontrollably. Since the malignant B cells are derived from a single clone, they are identical and produce only a single type of antibody (i.e., a monoclonal antibody, or mAb). However, most of these myeloma cells produce antibodies of unknown specificities. In 1975, by fusing a myeloma cell to a B cell, Cesar Milstein and Georges Kohler succeeded in producing a hybridoma that can be cultured indefinitely in vitro and produces an unlimited number of monoclonal antibodies of known antigenic specificity (4). The rationale behind their approach is to combine the immortal properties of the myeloma cell and the antibody producing properties of the B cell. Their technique revolutionized antibody production and provides a powerful means for identification and purification of biological molecules using monoclonal antibodies.
Generally, preparing a monoclonal antibody requires several months. The general procedure includes the following steps:
<ol>
	<li>Immunization and screening of antibody titer</li>
	<li>Fusion of antibody-producing B cells and myeloma cells</li>
	<li>Selective growth of the hybridoma</li>
	<li>Screening the hybridomas for producing the desired monoclonal antibody</li>
	<li>Cloning by limiting dilution - a process whereby cells are diluted to a concentration to statistically allow for less than 1 cell to be added to the wells of a 96-well plate. Some wells will end up with 0 cells and some will have 1 cell. The wells with seeded with 1 cell will eventually grow into a monoclonal population of cells.</li>
	<li>Growth of the hybridoma and preparation of monoclonal antibody</li>
</ol>
This protocol focuses on the last step - growth of the hybridoma and preparation of the monoclonal antibody. The antibody is purified from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation (often referred to as salting out) - a commonly used method of removing proteins from a solution. Proteins in solution form hydrogen bonds, along with other hydrophilic interactions, with water through their exposed polar and ionic groups. When concentrations of small, highly charged ions (such as ammonium or sulfate) are added, these groups compete with the proteins for binding to water. This removes the water molecules from the protein and decreases its solubility, resulting in precipitation of the protein.

Producing Monoclonal Antibodies Using Hybridomas

Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridomas

Source: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, ...

Educación

JoVE Science Education

Biología avanzada

Inmunología

Generating Recombinant Monoclonal Antibodies From Mammalian Cell Cultures

Source: Nogales-Gadea, G. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52830">Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)
This video demonstrates a method of antibody generation from mammalian cells by introducing plasmid vectors with heavy and light chain genes. These vectors interact with polyethylenimine and enter the cells by forming polyplexes; later, they are translated into individual proteins and assembled into complete antibodies, which are secreted into the extracellular medium.

Generación de anticuerpos monoclonales recombinantes a partir de cultivos de células de mamíferos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation of Peripheral Blood ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Production and Purification

A Hybridoma Technology for Producing Monoclonal Antibodies against a Metallopeptidase

Source: Xia, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62437">Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates an assay to produce monoclonal antibodies against porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase, using a traditional hybridoma technology. Upon immunizing a mouse with APN, the spleen cells are harvested and fused with immortal myeloma cells to produce hybridomas. The hybridomas are then selected and proliferated using the HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) medium to produce monoclonal antibodies specific to different APN epitopes.

Una tecnología de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales contra una metalopéptidasa

All animal model procedures have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. Animal ...

A Technique to Generate Monoclonal Antibodies from Antigen-Specific B Cells

Source: Devilder, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56508">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.</a> J. Vis. Exp. (2018).
The video demonstrates a technique for generating monoclonal antibodies from antigen-specific B cells. Eukaryotic expression vectors encoding the heavy and light chains of antibodies, cloned from isolated antigen-specific B cells, are introduced into mammalian cells using polyplexes. Once inside the cells, these vectors undergo translation, and the resulting heavy and light chain peptides assemble into antibodies, which are subsequently secreted by the cells.

Una técnica para generar anticuerpos monoclonales a partir de células B específicas de antígeno

1. Production of mAbs

	The day before the transfection, seed 15,000 Human embryonic kidney 293A (HEK 293A) cells in 200 &#181;L of Dulbecco&#39;s ...

Hybridoma Technology

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or epitope. Such antibodies are used in research, diagnostics, and disease therapy. The hybridoma technology established in 1975 by Georges K&#246;hler and Cesar Milstein was awarded the Nobel Prize in Medicine in 1984 for revolutionizing research and therapy.
Hybridoma Selection
Commonly used fusion techniques &#8212; electroporation, polyethylene glycol (PEG) mediated fusion, and the use of fusogenic viruses &#8212; generally produce hybridomas at a very low frequency. Fusion products thus have a high ratio of self-fused B-cells and myeloma cells, or unfused cells, with a low number of hybrid cells.
The hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) medium is used to select hybridomas by selectively allowing their growth. The aminopterin blocks the default nucleotide synthesis in cells. However, cells can utilize hypoxanthine and thymidine from the medium to synthesize nucleotides via the salvage pathway.
Myeloma cells deficient in the HGPRT enzyme cannot synthesize nucleotides via this pathway and thus, do not grow in HAT medium. Although B-cells produce functional HGPRT enzymes, they cannot divide indefinitely. Thus, only the hybrid cells with functional HGPT from the B-cells and immortality from the myeloma line can grow on the HAT selection medium. Such a culture of hybrid cells is called a hybridoma, which can be screened for monoclonal antibody production.
Hybridoma Screening
Hybridoma cultures from the HAT selection are plated onto a 96-well plate; each well containing only one cell. Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), each cell is screened for the production of antibodies specific to the epitope of interest. Cells that test positive are then selected and grown in a larger culture vessel to establish hybridoma cell lines. These cell lines are a permanent source of unlimited monoclonal antibodies. Thus hybridoma technology is a convenient and cost-effective method for mass production of monoclonal antibodies.

Tecnología de hibridoma

Hybridoma technology is used for the large-scale production of monoclonal antibodies. Monoclonal antibodies bind to only a single antigenic determinant or ...