Anticorpos monoclonais são conhecidos como anticorpos monoespecículos que são produzidos a partir de um único clone de linfócito B e os anticorpos monovalentes que se ligam ao mesmo epítope. Recentemente, a ELISA baseada em anticorpos monoclonais tornou-se nossa plataforma emergente para a análise qualitativa ou quantitativa de alimentos ou produtos naturais. Este método é um método preciso, sensível e eficaz sem passos tediosos de pré-tratamento.
Então esse é o essencial para amostras biológicas e futuras aplicações clínicas. A preparação dos mABs de TCM é um passo vital nos estudos sobre características complexas do sistema da fórmula TCM. Desenvolvemos um protocolo para gerar mABs contra os pequenos compostos moleculares, incluindo síntese de antígenos artificiais, imunização de camundongos e fusão celular.
O hapten está conectado com a proteína portadora para sintetizar o antígeno artificial. Antígeno artificial e adjuvantes completos são misturados e emulsionados. O rato foi imunizado por injeção subcutânea.
Tire o baço do rato imunizado e faça suspensão unicelular. Misture as células do mieloma. Esplenócitos são isolados e fundidos com linha celular de mieloma de camundongo sensível ao CHAPÉU pelo método PEG.
Selecione uma linha celular capaz de preparar anticorpos pela ELISA. Hybridomas secretando anticorpos monoclonais que são reativos ao antígeno são clonados. Estabeleça que a linha celular hybridoma é criopreservada.
O procedimento de oxidação periodato foi utilizado para a síntese de um conjugado BSA de narigina. Em primeiro lugar, a narigina foi dissolvida em uma concentração final de um miligrama por mililitro a 100 microliters de solução de pariodato de sódio recém-preparada para cinco mililitros da solução de narigina. Mexa a mistura em temperatura ambiente por uma hora.
Em segundo lugar, adicione dois mililitros de proteína portadora à mistura de reação periodato de sódio narigina. Ajuste a mistura para a solução pH nove e continue reagindo por seis a oito horas. Em terceiro lugar, o antígeno artificial foi purificado com o método de diálise em PDS por três dias para afastar o CBS.
O adjuvante completo de Freund e o adjuvante incompleto foram utilizados para a imunização do camundongo. Para a vacinação, misture 50 microgramas de conjugado com um volume igual do adjuvante completo de Freund e emulsione completamente. Administrar 100 microgramas desta mistura a cada rato BALB/c através de injeção subcutânea dorsal.
Entregue uma vacina de reforço através de injeção subcutânea duas semanas depois com a mesma quantidade de conjugado misturado com adjuvante incompleto. Para a imunização primária, o adjuvante completo de Freund e o imunogênio foram usados por injeção subdérmica. Para a imunização do reforço, o adjuvante incompleto de Freund e o imunogênio foram usados por injeção subdérmica.
Para a imunização de impacto sem adjuvante, apenas o imunogênio foi utilizado por injeção subdérmica ou injeção intraperineal. As células da camada alimentar originaram-se principalmente de células epiteliais abdominais ou macrófagos. RPMI 1640 FBS e HAT foram usados para preparar o meio de tela HAT.
O suplemento HAT foi dissolvido em 10 mililitros RPMI, depois adicionado em 500 mililitros RPMI 1640 contendo 20% de FBS. E o rato ICR foi esterilizado por 75% de álcool etílico por cinco minutos. Depois de remover a pele do abdômen com fórceps hemostáticos, desinfete a área com 75% de etanol.
Corte a pele externa para expor a cavidade abdominal. Injete três mililitros de meio RPMI 1640 estéreis no abdômen. Em seguida, massageie o abdômen para desprender células adicionais na solução.
Aspire a suspensão da célula fetal em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Depois de centrifugar a suspensão celular por 10 minutos a 1.000g, descarte o supernasce e suspenda as células fetais para obter suspensão de célula única. Após este procedimento, dissolva as células usando o meio HAT.
Conte as células para fazer 100.000 por mililitro de membros da célula. Transfira as células para 96 placas de cultura celular. Incubar as placas durante a noite a 37 graus, 5% de dióxido de carbono.
O camundongo imunizado escolhido foi esterilizado por 75% de álcool etílico por cinco minutos. Aspirar RPMI 1640 médio como o tampão de lavagem. Remova a pele e o tecido muscular usando uma tesoura para expor o baço.
Isole o baço pelas pinças com cuidado. Em seguida, lave o baço no RPMI 1640. Isole o baço e corte em pedaços.
Bata lentamente o baço. Em seguida, foi tratado com um meio RMPI 1640 para dissolver as células para preparar uma suspensão de células de baço. Depois disso, as células foram filtradas por 800 coador de células de malha.
Pregue o baço cuidadosamente para remover os tecidos grandes. Evitar grandes tecidos influenciam a fusão das células. Foi a suspensão da célula do baço com meio RPMI 1640.
Em seguida, a suspensão celular foi adicionada no tubo centrífuga. Colher as células do baço por centrífugação a 1.000g por 10 minutos. E depois descarte o supernatante.
As células do baço deveriam estar no valor de um bilhão a 10 bilhões. Remova as células de mieloma cultivadas e amplificadas da incubadora e agite suavemente o frasco para obter uma suspensão celular. Foi a suspensão com RPMI duas vezes.
Misture a suspensão da célula do baço e as células de mieloma. Conte as células e ajuste a concentração. A ração final das células do baço para as células de mieloma deve ser de 1 a 5 a 10.
Centrifugar a mistura celular e, em seguida, remover o supernante. Adicione um mililitro de solução glicol de polietileno de 50% às células e mexa suavemente a 37 graus por um minuto. Em pé por 30 segundos, adicione dois mililitros de RPMI 1640 médio e incubar a 37 graus por dois minutos para terminar a reação.
Adicione em dois mililitros RPMI por mais um minuto. Em seguida, adicione em 10 mililitros RPMI 1640. Centrífuga a 800g por 10 minutos.
Descartando o supernasce, adicione a solução HAT e continue a cultivar as células por sete dias a 37 graus 5% de dióxido de carbono. Após sete dias, os supernacantes celulares em 96 placas de poço foram aspirados após a fusão celular e adicionados em placas ELISA pré-revestidas com antígeno de revestimento. Cultivado a 37 graus por uma hora, o anticorpo secundário foi adicionado e cultivado por meia hora.
Depois de adicionar 100 microliters de solução de substrato. Pare com a reação. Para as placas ELISA no leitor de microplacas, utilizou-se o método de ponto final lido os dados em 450 nanômetros.
Absorvente medido a 450 nanômetros e tela os híbridos positivos. Use o método de diluição limitante para preparar os híbridos monoclonais. Depois de remover o meio HD dos híbridos selecionados, suspenda as células em RPMI 1640 e conte-as.
Diluir as células de uma concentração de uma célula, duas células e quatro células por poço por RPMI 1640 em uma placa e cultura de 96 poços. Transfira células dos híbridos que são positivas para 24 placas de poço, frascos de 25 e 75 centímetros quadrados para cultivo. Armazene as miodomias em uma caixa de resfriamento de gradiente a menos 80 graus por 24 horas.
Em seguida, transfira para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Titer de antiserums foi determinado por ELISA indireta. O rato de um a quatro foi imunizado com conjugado narigin BSA foi significativamente maior do que o rato de controle sem imunização.
O título de 1 a 5.000 é difusão suficiente. O peso molecular do conjugado hapten foi confirmado pela análise MALDI-TOF. Como mostrado na figura dois, como um peso molecular do padrão BSA e narigina têm sido conhecidos, podemos calcular e determinar que as moléculas de narigina foram conjugadas com BSA.
Apenas o hibridoma pode sobreviver e crescer na mídia de seleção hat. Após sete dias de crescimento, a cultura celular pode ser testada pela ELISA. Os híbridos positivos foram reinspetados e expandidos.
Estas imagens mostram o resultado convencional para linhas celulares monoclonais e policlonais de hybridoma. O ponto crítico deste experimento é a triagem dos mAbs específicos para o hapten, mas não a proteína portadora. A especificidade do MAB foi então examinada na presença de outros compostos estruturalmente relacionados.
A reatividade cruzada foi calculada para avaliar a especificidade do MAB para o antígeno. A curva de calibração da naringina e da faixa do forro foram obtidas. Os híbridos monoclonais específicos de antígeno foram expandidos e criopreservados em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
Depois de assistir a este vídeo, espero que você tenha um bom entendimento de como gerar anticorpos monoclonais contra um pequeno composto molecular. Então isso é tudo. Obrigado por sua observação e boa sorte para suas experiências.
