针对天然产物的单克隆抗体的产生

单克隆抗体被称为单特异性抗体，由单个B淋巴细胞克隆和与同一表位结合的单价抗体产生。最近，单克隆抗体为基础的ELISA已成为我们食品或天然产品定性或定量分析的新兴平台。此方法是一种准确、敏感和有效的方法，无需繁琐的预处理步骤。

因此，这是生物样品和未来临床应用的关键。中药MAB的制备是研究中药配方复杂系统特性的重要一步。我们开发了一种针对小分子化合物生成mABs的协议，包括人工抗原合成、小鼠免疫和细胞融合。

与载体蛋白结合合成人工抗原。人工抗原和完整的佐剂混合和乳化。小鼠通过皮下注射免疫。

拿出免疫小鼠的脾脏，做单细胞悬浮。混合骨髓瘤细胞。通过PEG方法分离和融合与帽子敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。

选择一个细胞系，通过ELISA来准备抗体。对抗原有反应的单克隆抗体分泌的杂交瘤被克隆。建立杂交瘤细胞系是冷冻保留。

期化氧化过程用于合成纳里金BSA结合体。首先，纳里金在100微升新鲜准备好的帕里奥酸钠溶液中以每毫升1毫克的最终浓度溶解，以5毫升的纳里金溶液。在室温下搅拌混合物一小时。

其次，在纳里金钠期酸反应混合物中加入两毫升载体蛋白。将混合物调整为pH9溶液，并继续反应6至8小时。第三，用PDS透析法纯化了三天，使CBS疏远了。

弗伦德的完全佐剂和不完全的辅助剂用于小鼠免疫。对于疫苗接种，混合50微克的偶联用与Freund的完全佐剂和乳化完全的等量。通过后皮下注射，将这种混合物的100微克管理到每只BALB/c小鼠。

两周后，通过皮下注射提供强化疫苗，与不完全佐剂混合的相同量的偶联剂。在初级免疫中，Freund的完全辅助剂和免疫原通过次皮注射使用。对于强化免疫，Freund的不完全辅助剂和免疫原通过皮下注射使用。

对于没有辅助剂的影响免疫，只有免疫原通过皮下注射或内氨酸注射使用。饲料层细胞主要来自腹部上皮细胞或巨噬细胞。RPMI 1640 FBS 和 HAT 用于准备 HAT 屏幕介质。

HAT补充剂溶解在10毫升RPMI介质中，然后加入500毫升RPMI 1640含有20%FBS。ICR小鼠被75%乙醇消毒5分钟。用止血钳从腹部取出毛皮后，用75%乙醇消毒区域。

切开外皮露出腹腔。将三毫升无菌 RPMI 1640 介质注入腹部。然后按摩腹部，将额外的细胞分离到溶液中。

将胎儿细胞悬浮液吸入15毫升离心管。在1000g下离心细胞悬浮液10分钟后，丢弃上经液，重新悬浮胎儿细胞以获得单细胞悬浮液。此过程后，使用 HAT 介质溶解细胞。

数一数细胞，使其从细胞成员每毫升10万。将细胞转移到96个井细胞培养板中。在37度，5%的二氧化碳孵育板过夜。

所选择的免疫小鼠被75%乙醇消毒5分钟。吸气 RPMI 1640 介质作为洗涤缓冲器。用剪刀切除皮肤和肌肉组织，露出脾脏。

小心地用钳子隔离脾脏。然后在 RPMI 1640 中清洗脾脏。隔离脾脏，切成碎片。

慢慢地敲打脾脏。然后用RMPI 1640培养基进行治疗，溶解细胞，准备脾脏细胞悬浮液。之后，由800个网状细胞滤株过滤细胞。

小心地钉住脾脏，取出大组织。避免大组织会影响细胞的融合。是脾脏细胞悬浮液与RPMI 1640介质。

然后将细胞悬浮液添加到离心管中。以1000克离心收获脾脏细胞10分钟。然后丢弃上一液。

脾脏细胞应该在10亿到100亿。从培养箱中取出培养和扩增的骨髓瘤细胞，轻轻摇动烧瓶以获得细胞悬浮液。是使用 RPMI 的悬架两次。

混合脾脏细胞悬浮液和骨髓瘤细胞。计数细胞并调整浓度。脾细胞对骨髓瘤细胞的最终配给应该是1到5到1到10。

离心细胞混合物，然后取出上一代。向细胞中加入一毫升50%聚乙二醇溶液，在37度下轻轻搅拌一分钟。站立30秒，加入两毫升RPMI 1640介质，在37度孵育2分钟，以终止反应。

再加两毫升 RPMI 一分钟。然后，加入10毫升RPMI 1640。在800g下离心10分钟。

丢弃上一液，加入帽子溶液，继续培养细胞7天，浓度为37度5%二氧化碳。七天后，96个井板中的细胞超自然剂在细胞融合后被吸气，并加入ELISA板，预涂有涂层抗原。在37度培养一小时，二次抗体被添加和培养半小时。

加入100微升基板溶液后。停止反应。对进入微孔板读卡器的ELISA板，采用端点法读取450纳米的数据。

测量450纳米的吸光度，并筛选正杂交瘤。使用限制稀释方法准备单克隆杂交瘤。从选定的杂交瘤中去除 HD 介质后，重新挂起 RPMI 1640 中的细胞并计数它们。

在 96 井板和培养物中，用 RPMI 1640 稀释每井一个细胞、两个细胞和四个细胞的浓度细胞。将正向的杂交细胞转移到24个井板、25和75平方厘米的烧瓶进行培养。将 myodomas 存放在零下 80 度的梯度冷却箱中 24 小时。

然后转移到液氮长期储存。抗塞膜的滴度是由间接的ELISA决定的。小鼠一至四被免疫与纳里金BSA结合明显高于控制小鼠没有免疫。

1 到 5000 的滴度是足够的扩散。MALDI-TOF分析证实了同偶结合物的分子量。如图二所示，众所周知，BSA标准和纳里金的分子量，我们可以计算和确定纳里金分子与 BSA 结合。

只有杂交瘤才能在 HAT 选择介质中存活和生长。经过七天的生长，细胞培养可以通过ELISA进行测试。正杂交瘤被重新克隆和扩大。

这些图像显示了稳定的单克隆和多克隆杂交细胞系的常规结果。这个实验的关键点是筛选特异性的mAbs，但不是载体蛋白。然后，在其他结构相关化合物存在的情况下，对mAb的特异性进行检查。

计算交叉反应性以评估抗原的 mAb 特异性。获得纳林宁的校准曲线和衬套范围。抗原特异性单克隆杂交瘤被扩大，并冷冻保存在液氮中，用于长期储存。

看完这段视频后，我希望你对如何产生针对小分子化合物的单克隆抗体有一个很好的理解。就这些了感谢您的收看，并祝您的实验好运。