Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
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Este trabajo fue financiado por el fondo de la semilla de muelle PIF-2015-46, el BMBF concede 05K16GUA y 05K12GU3 y el cluster de excelencia "El centro de Hamburgo para ultrarrápida de imágenes, estructura, dinámica y Control de la materia a escala atómica" de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). La obra de autores afiliados con el centro para Free-Electron Laser Science fue financiada por la Asociación de Helmholtz a través de fondos de programa orientado. Los datos de MX del sincrotrón fue recogidos en línea P14 operado por EMBL Hamburgo en el anillo del almacenaje PETRA III (DESY, Hamburgo, Alemania).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Fabricamos dispositivos microfluídicos para difracción de rayos x en situ por resina epoxi como llenar la hoja de material y poliimida como material de la ventana de dibujo. Nuestro procedimiento había optimizado distintos pasos del proceso de fabricación por anterior radiografía chip diseños16,21. Hemos reducido el espesor de la ventana y así el fondo dispersión y también facilitando la fabricación menos pasos de proceso se requiere. en situ cristalización utilizando el protocolo descrito tiene importantes beneficios. Permite la recopilación de datos de difracción a temperatura ambiente y excluye de tal modo la necesidad de protección del crio, que en algunos casos contiene el riesgo de introducir artefactos en la estructura de la proteína. Además, los cristales no están sujetos a estrés físico, porque puede evitar la transferencia de los cristales de su medio ambiente nativo. A través de este procedimiento, los cristales mantienen su alta calidad y no sufren de ningún tratamiento.
En nuestra experiencia, los pasos más críticos dentro del protocolo giran en torno a controlar el proceso de cristalización. Los parámetros para obtener cristales adecuados rayos x con dimensiones adecuadas necesitan ser identificadas empíricamente y no pueden ser tomados directamente de experimentos de difusión de vapor. Utilizando concentraciones idénticas de la proteína y precipitado no siempre produjo cristales en fichas diferentes, o a veces en diferentes pozos en el mismo chip. Esto indica que deben considerarse cuidadosamente, todos los factores que influyen en el crecimiento y la nucleación del cristal como cinética de composición o cristalización de licor madre (a través de la trayectoria de evaporación). Como grandes cristales difractan a mayor resolución, idealmente se cultivan adecuadamente grandes cristales. El proceso de nucleación del cristal y el crecimiento se puede seguir con las mediciones de DLS. Ajuste el enfoque de láser dentro de la ~ 50 μm compartimientos de cristalización fina del chip pueden ser difíciles y requieran cuidadosa alineación manual. Mediante el uso de pozos de más de 100 μm, auto-alineación láser era factible y confiable, tal que varios pozos podrían controlarse a través de planes de adquisición automatizada.
Las fichas de polyimide basado en rayos x producen sólo un bajo fondo y demostrar la idoneidad de estos dispositivos para rutina de recolección de datos de difracción de rayos x mediante la resolución de estructuras de tres proteínas de modelo. La mejor resolución obtenida en chip diferenció, en comparación con las resoluciones previamente alcanzadas, de cristales de proteína significativamente mayores y recogida de datos de rayos x convencional. Esto podría ser debido a varios factores y mayor optimización de condiciones de cristalización puede mejorar aún más la difracción. Fue posible recolectar datos en situ de difracción hasta 1,8 resolución Å aplicar cristal con dimensiones menores a 30 μm. El análisis detallado de datos de difracción de la taumatina proporciona conocimientos sobre el daño de la radiación. Para limitar la extensión del daño de la radiación, se debe exponer solamente un solo cristal por compartimento en el dispositivo de microfluidos, como puede ocurrir la difusión de los radicales y en cristales vecinos. Para mejorar la velocidad de recogida de datos, esto debe ser automatizado en el futuro.
Debido a la morfología del cristal, en algunos casos puede ocurrir una orientación preferida. Esto ocurrió por ejemplo con el dataset de la tiorredoxina, donde los cristales tenían una orientación fuertemente preferida con respecto a las ventanas de la viruta. Hasta aquí, podríamos recoger un conjunto de datos de difracción completa. Si cristales exhiben una orientación preferida en el chip y en particular si el grupo correspondiente del espacio tiene también una simetría bajo, entonces la integridad del conjunto de datos debe ser vigilada durante la colección tal que suficiente caña de patrones de difracción recogidos.
Estudios tiempo-resolved usando estos chips son directamente posibles usando la luz inducida por reacciones con un enfoque de prueba de bomba. La transmisión ligera de aluminio del polyimide para el laser de la bomba necesita ser aclarado y también ópticamente claro polyimide o COC podría ser utilizado. Las geometrías de microfluidos actuales no permiten para substrato mezcla de experimentos después de que los cristales crecen. Sin embargo, esperamos que el descrito rayos x chip fabricación protocolo también sea conveniente para tal mezcla diseños para ambos difracción de rayos x de tiempo resuelto así como dispersión de enfoques19.

Conocer la estructura 3D de una proteína es esencial para entender su funcionalidad. Las estructuras de resolución atómica cerca hasta ahora se obtienen comúnmente por cristalografía de rayos x. Esta técnica expone cristales proteicos a la radiación de rayos x y luego se analizan los patrones de difracción resultante para el refinamiento y la determinación de la estructura. En Cristalografía de rayos x tradicionales, un conjunto de datos de difracción completa se registra de un cristal solo, ideal grande a temperaturas criogénicas. Tales cristales, sin embargo, en su mayoría no son triviales para crecer, e identificar condiciones de criopreservación adecuados puede convertirse en un desafío en sí mismo y a veces también puede provocar desviaciones de la estructura nativa de la proteína del5.
Recientes avances en láser de electrones libres de rayos x (FEL) y beamlines del sincrotrón han permitido resolver estructuras de cristales más pequeños, como nuevas líneas de enfoque micro, haz de rayos x mayor brillantez, y detectores de rayos x mejorados se convirtió hay disponibles6,7. Por lo general, pequeños cristales son fáciles de crecer que grande y defecto cristales gratis8,9. Sin embargo, pequeños cristales sufren de daño de la radiación de rayos x mucho más rápido que grandes cristales. Esto es porque en comparación con un cristal grande, una mayor dosis de rayos x debe ser proyectada en un menor volumen de cristal que difractan de resolución comparable. Por lo tanto, incluso criogénico protección a menudo no es suficiente para grabar un conjunto de datos de difracción completa desde una sola microcrystal.
Para superar este obstáculo, Cristalografía de la serie se ha convertido en el método de elección para recoger y combinar patrones de difracción de muchos microcristales aleatoriamente orientados a obtener un conjunto completo de datos. Radiación se reduce al mínimo daño inducido cristal repartiendo la dosis total de rayos x utilizado para resolver una estructura de las proteínas sobre un gran número de cristales5,10. En un ' difractar antes de destruir ' vil experimento, cada cristal es utilizado para una exposición usando pulsos de rayos x de femto-segundos. Líneas de micro focus en fuentes de sincrotrón de tercera generación a su vez pueden llevar a cabo serial Cristalografía con pocos milisegundos corta rayos x exposiciones11,12,13,14. Sin oscilación de cristal o rotación durante la recolección de datos, sin embargo, las reflexiones de Bragg sólo parciales se pueden grabar y por lo tanto decenas de miles o más patrones de difracción son típicamente necesarios para la determinación de estructura15. Hasta la fecha, un conjunto diverso de métodos de entrega de la muestra se ha desarrollado para la cristalografía serial, como recientemente ha comentado14,16,17,18,19. Entre aquellos, varios objetivo fijo basado en la entrega de la muestra estrategias con éxito fueron combinadas con la rotación del cristal durante exposiciones de rayos x que significativamente menos patrones de difracción pueden proporcionar igualmente conjuntos de datos completos y también consume menos muestra comparada clásica Cristalografía serie experimentos donde son imágenes fijas grabadas7,16,20,21,22,23 , 24.
Presentamos un protocolo para fabricar dispositivos microfluídicos con bajo fondo de rayos x. Los dispositivos son con motivos de pegamento epoxy de 5 minutos utilizando litografía blanda y son convenientes para los experimentos de difracción de rayos x in situ en la temperatura que se benefician de la integración de la preparación de la muestra directamente en la instalación de rayos x, como el caso de estudios de tiempo resuelto que siguen cinética inducida por mezcla18,19. Canales de microfluidos son con tapa en ambos lados con papel de polyimide poliméricos, dando por resultado x-Ray windows con un espesor combinado de cerca de 16 μm que permiten la proyección de imagen de fondo rayos x baja. Todos los materiales utilizados ofrecen buena resistencia solvente. Este método de fabricación es comparable simple y barato. Después de la contratación de una oblea maestro SU-8, todos de fabricación puede completarse fuera de una sala limpia en un entorno de laboratorio de investigación típicos.
En un ejemplo, describimos chips para goniómetro base de Cristalografía serial blanco fijo. En primer lugar, se discuten las consideraciones diseño y fabricación para el uso de válvulas capilares a microfluidically dividir una reacción acuosa en un número seleccionado de nanoliter tamaño de gotitas. Este mecanismo de carga evita la pérdida de la muestra de canal muerto-volumen y dividir fácilmente se puede realizar manualmente sin uso de bombas u otros equipos para accionamiento líquido. Tales nanoliter aislada tamaño de gotas de solución de proteína son monitoreados en situ con dispersión ligera dinámica (DLS) para control proteína cristal nucleación y crecimiento. Previamente se ha demostrado que se pueden realizar mediciones de DLS en dispositivos microfluídicos que consiste en una estructura de polidimetilsiloxano (PDMS) enlazada a un cristal diapositiva25,26. Porque la capa de poliamida tiene una alta transmisión para longitudes de onda más de 550 nm, el enfoque puede ampliarse a las mediciones en las virutas transparentes de rayos x, cuando se utiliza una longitud de onda de láser adecuado27,28. Basándose en los resultados DLS, nucleación inicial puede ser observado y posterior evaporación de la gota puede interrumpirse para obtener cristales de proteínas menos pero más grande.
Después de suficientes cristales se cultivan, conjuntos de datos de difracción de rayos x completa luego se pueden recoger mediante goniómetro base de la cristalografía de rayos x serie en situ fijadas objetivo a temperatura ambiente. Conjuntos de datos de difracción son procesados usando un conjunto de herramientas de software y scripts personalizados para resolver la estructura cristalina de la proteína. Esta técnica evita artefactos inducidas a menudo durante la criopreservación utilizada en experimentos de Cristalografía convencional.
Comparamos tres estructuras objetivo de proteína que se resolvieron con 10-20 μm pequeños cristales cultivados en chip a una resolución mejor y 2 Å. Por cristalización y diffracting en situ, manejo y por lo tanto mecánico se reduce al mínimo los disturbios de frágiles cristales. Este protocolo puede aplicarse para cristales proteicos que difractan a alta resolución y baja resolución (1.7 Å a 3.0 Å). Como casi cada cristal puede ser utilizado para la difracción, se desperdicia poca muestra, haciendo de este un método muy eficiente de cristal.
Este protocolo proporciona a una guía detallada sobre cómo preparar chips de microfluídica transparente radiografía en situ proteína cristalización y difracción recogida de datos. El procedimiento fue cuidadosamente diseñado para beneficiarse de microfluidos precisión sin necesidad de equipos sofisticados en el laboratorio. Además, recopilación de datos en la línea de sincrotrón puede realizarse sin necesidad de un goniómetro especializado o un humidificador para facilitar la reproducción de los resultados por no expertos. La técnica presentada puede aplicarse para serie milisegundo Cristalografía recolección a temperatura ambiente manteniendo el daño de la radiación mínima y sin la introducción de estrés a los cristales después de crecimiento por manipulación cryo-protección o cristal. Por lo tanto, el método descrito es adecuado para cualquier proyecto de cristalización de proteínas.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Series</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Epoxy glue</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silicone</td></tr><tr><td>Kapton foil</td><td>Dupont/ American Durafilm</td><td>HN grade, gauge 30 (7.5 &amp;mu;m)</td><td>polyimide foil</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop fluoropolymer coating</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-solvent</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Fluorinated oil</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD Software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Photo mask</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 inch wafer</td><td>University Wafer</td><td></td><td>Silicon wafer</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>S&amp;Uuml;SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Mask aligner</td></tr><tr><td>PDMS mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plasma machine</td><td>Diener electronic</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Glucose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Tartrate</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SPG buffer</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &amp;micro;m filter</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td></tr><tr><td>Syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock Tip</td></tr><tr><td>Needle&amp;nbsp;</td><td>Terumo Agani Needle</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8&quot;</td></tr></tbody></table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Este protocolo describe fabricación dispositivos microfluídicos con bajo fondo de rayos x optimizada para goniómetro base de Cristalografía serial blanco fijo. Los dispositivos son con motivos de pegamento epoxy usando litografía blanda y son adecuados para en situ el experimentos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Los pocillos de la muestra son con tapa en ambos lados con ventanas de hoja polimérica polyimide que permiten la recopilación de datos de difracción con bajo fondo de rayos x. Este método de fabricación es poco exigente y de bajo costo. Después de la contratación de una oblea maestro SU-8, todos de fabricación puede completarse fuera de una sala limpia en un entorno de laboratorio de investigación típicos. El protocolo de diseño y fabricación de chip utilizan válvulas capilares a microfluidically dividir una reacción acuosa en nanoliter definido tamaño de gotitas. Este mecanismo de carga evita la pérdida de la muestra de canal muerto-volumen y puede fácilmente realizarse manualmente sin uso de bombas u otros equipos para accionamiento líquido. Describimos cómo aislado nanoliter tamaño de gotas de solución de proteína puede ser monitoreada en situ por luz dinámica dispersión control proteína cristal nucleación y crecimiento. Después de cristales adecuados se cultivan, conjuntos de datos de difracción de rayos x completa pueden recogerse mediante goniómetro base de la cristalografía de rayos x serie en situ fijadas objetivo a temperatura ambiente. El protocolo proporciona secuencias de comandos personalizadas para procesar conjuntos de datos de difracción usando un conjunto de herramientas de software para resolver y refinar la estructura cristalina de la proteína. Este enfoque evita los artefactos posiblemente inducidos durante la criopreservación o cristal manual de experimentos de Cristalografía convencional. Presentar y comparar tres estructuras de la proteína que se resolvieron con pequeños cristales con dimensiones de aproximadamente 10-20 μm en chip. Por cristalización y diffracting en situ, manejo y por lo tanto mecánico se reduce al mínimo los disturbios de frágiles cristales. El protocolo detalla cómo fabricar un chip de microfluidos transparente radiografía personalizado adecuado para en situ serial Cristalografía. Como casi cada cristal puede ser utilizado para la recolección de datos de difracción, estos chips microfluídicos son un método muy eficiente de cristal.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Este protocolo describe en detalle cómo fabricar y operar dispositivos de microfluidos para la recogida de datos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Además, describe cómo supervisar la cristalización de proteínas por la dispersión ligera dinámica y obtenidos de cómo procesar y analizar datos de difracción.

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

14.6K vistas.  DESY. Este protocolo describe en detalle cómo fabricar y operar dispositivos de microfluidos para la recogida de datos de difracción de rayos x a temperatura ambiente. Además, describe cómo supervisar la cristalización de proteínas por la dispersión ligera dinámica y obtenidos de cómo procesar y analizar datos de difracción.

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparación de células adherentes, por Imágenes de fluorescencia de rayos X por Química Fijación

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Investigación

Química

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Cristales de proteína creciente con distintas dimensiones usando automatizado de cristalización juntada con In Situ dispersión ligera dinámica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Bioquímica

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

Difracción de polvo de rayos X en Ciencias de la Conservación: Hacia rutina de determinación de estructura cristalina de los productos de corrosión de objetos de arte del patrimonio

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. The DAC program at 13-BM-C is part of the Partnership for Extreme Xtallography (PX^2) project. BX-90 type DACs with conical-type diamond anvils and backing plates are recommended for these experiments. The sample chamber should be loaded with noble gas to maintain a hydrostatic pressure environment. The sample is aligned to the rotation center of the diffraction goniometer. The MARCCD area detector is calibrated with a powder diffraction pattern from LaB6. The sample diffraction peaks are analyzed with the ATREX software program, and are then indexed with the RSV software program. RSV is used to refine the UB matrix of the single crystal, and with this information and the peak prediction function, more diffraction peaks can be located. Representative single crystal diffraction data from an omphacite (Ca0.51Na0.48)(Mg0.44Al0.44Fe2+0.14Fe3+0.02)Si2O6 sample were collected. Analysis of the data gave a monoclinic lattice with P2/n space group at 0.35 GPa, and the lattice parameters were found to be: a = 9.496 &#177;0.006 &#197;, b = 8.761 &#177;0.004 &#197;, c = 5.248 &#177;0.001 &#197;, &#946; = 105.06 &#177;0.03&#186;, &#945; = &#947; = 90&#186;.

In this report, we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. ATREX and RSV programs are used to analyze the data.

Alta Presión cristal único Difracción en PX ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. A prerequisite for the method is that highly ordered crystalline specimen need to be grown from the macromolecule to be studied, which then need to be prepared for the diffraction experiment. This preparation procedure typically involves removal of the crystal from the solution, in which it was grown, soaking of the crystal in ligand solution or cryo-protectant solution and then immobilizing the crystal on a mount suitable for the experiment. A serious problem for this procedure is that macromolecular crystals are often mechanically unstable and rather fragile. Consequently, the handling of such fragile crystals can easily become a bottleneck in a structure determination attempt. Any mechanical force applied to such delicate crystals may disturb the regular packing of the molecules and may lead to a loss of diffraction power of the crystals. Here, we present a novel all-in-one sample holder, which has been developed in order to minimize the handling steps of crystals and hence to maximize the success rate of the structure determination experiment. The sample holder supports the setup of crystal drops by replacing the commonly used microscope cover slips. Further, it allows in-place crystal manipulation such as ligand soaking, cryo-protection and complex formation without any opening of the crystallization cavity and without crystal handling. Finally, the sample holder has been designed in order to enable the collection of in situ X-ray diffraction data at both, ambient and cryogenic temperature. By using this sample holder, the chances to damage the crystal on its way from crystallization to diffraction data collection are considerably reduced since direct crystal handling is no longer required.

A novel sample holder for macromolecular X-ray crystallography along with a suitable handling protocol is presented. The system allows crystal growth, crystal soaking and in situ diffraction data collection at both, ambient and cryogenic temperature without the need of any crystal manipulation or mounting.

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip de microfluidos para ICPMS Introducción Muestra

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Bioingeniería

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder microdiffraction two-dimensional (2D) maps at beamline 12.3.2 of the Advanced Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Measurements can be performed on any sample that is less than 10 cm x 10 cm x 5 cm, with a flat exposed surface. The experimental geometry is calibrated using standard materials (elemental standards for XRF, and crystalline samples such as Si, quartz, or Al2O3 for diffraction). Samples are aligned to the focal point of the x-ray microbeam, and raster scans are performed, where each pixel of a map corresponds to one measurement, e.g., one XRF spectrum or one diffraction pattern. The data are then processed using the in-house developed software XMAS, which outputs text files, where each row corresponds to a pixel position. Representative data from moissanite and an olive snail shell are presented to demonstrate data quality, collection, and analysis strategies.

We describe a beamline setup meant to carry out rapid two-dimensional x-ray fluorescence and x-ray microdiffraction mapping of single crystal or powder samples using either Laue (polychromatic radiation) or powder (monochromatic radiation) diffraction. The resulting maps give information about strain, orientation, phase distribution, and plastic deformation.

Rayos x de sincrotrón Microdiffraction y proyección de imagen de fluorescencia de las muestras de rocas y minerales

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Ingeniería

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

Cristalización en chip y difracción en serie a gran escala a temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

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