Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
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이 작품은 부두 씨앗 기금 PIF-2015-46에 의해 지원 되었다, 05K16GUA 및 05K12GU3, 그리고는 독일의 ' 초고속 영상-구조, 역학 및 원자 규모에서 물질 제어를 위한 함부르크 센터 ' 우수 클러스터는 BMBF 부여 가운데 (DFG)입니다. 자유 전자 레이저 과학을 위한 센터와 제휴 하는 작가의 작업 지향 프로그램 기금을 통해 헬름홀츠 협회에 의해 투자 되었다. 싱크 로트 론 MX 데이터 페트라 III 저장 링 (DESY, 함부르크, 독일)에 의해 EMBL 함부르크 beamline P14 운영에 모아 졌다.

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저자는 공개 없다.

우리는 창 소재로 소재와 폴 박 작성으로 에폭시 수 지를 패턴화 하 여 제자리에 x 선 회절에 대 한 미세 장치를 조작. 우리의 절차 이전 x 선 칩 디자인16,21을 통해 제조 프로세스의 여러 단계를 최적화. 우리 창 두께 감소 하 고 그로 인하여 또한 제조를 완화 하는 동안 비 산 배경으로 적은 프로세스 단계는 필요. 제자리에서 결정 화 기술된 프로토콜을 사용 하 여 상당한 장점이 있습니다. 그것은 실내 온도에 회절 데이터 수집을 허용 하 고 그로 인하여 어떤 경우에 인공 단백질 구조에 소개의 위험을 포함 하는 곳을 알아내는 보호의 필요성을 제외. 또한, 크리스탈 적용 되지 않습니다 물리적 스트레스 때문에 그들의 네이티브 환경에서 결정의 양도 피할 수 있다. 이 절차를 통해 결정 그들의 고품질을 유지 하 고 어떤 치료에서 고통을 하지 않습니다.
우리의 경험에는 프로토콜 내에서 가장 중요 한 단계를 결정 화 과정을 통제 돌고 있다. X 선 적절 한 크기와 적당 한 결정을 얻기 위해 매개 변수 경험적으로 확인 될 필요가 있고 증기 확산 실험에서 직접 촬영 하실 수 없습니다. 항상 다른 칩, 또는 때때로 다른 우물 같은 칩 내에 결정에서 단백질 및 비례적 동일 농도 사용 하 여 발생 하지 않았다. 이 크리스탈 nucleation 및 성장에 영향을 미치는 모든 요인 고려 되어야 신중 하 게, 어머니 주류 구성 또는 결정 화 속도 론 (통해 증발 궤적) 등을 나타냅니다. 더 큰 결정은 더 높은 해상도를 diffract로 적당 하 게 큰 결정 이상적으로 성장 된다. 크리스탈 nucleation 및 성장 과정은 DL 측정 뒤 수 있습니다. ~ 50 µ m 내부 레이저 초점 조정 칩의 얇은 결정 화 구획 도전적 일 수 있다 고 주의 수동 정렬 해야 할 수도 있습니다. 100 µ m 보다 깊은 우물을 사용 하 여 레이저 자동 정렬 가능 하 고 신뢰할 수 있는, 같은 했다 여러 우물 자동된 취득 제도 통해 모니터링할 수 있습니다.
구체의 기반 x 선 칩 생산만 낮은 배경 하 고 루틴 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 이러한 장치의 적합성 3 모델 단백질에 대 한 구조를 해결 하 여 보여 줍니다. 훨씬 더 큰 단백질 결정 및 기존 선 데이터 수집에서 이전 달성된 해상도 비해 칩에서 얻은 최고의 해상도가 달랐다. 이 여러 요인으로 인해 될 수 있고 더 결정 화 조건 최적화는 회절 개선할 수 있습니다. 회절 데이터와 적용 크리스탈 30 µ m 보다 작은 크기 1.8 Å 해상도 제자리에 수집 가능 했다. 방사선 손상에 대 한 통찰력을 제공 하는 thaumatin 회절 데이터의 상세한 분석. 하 고 인접 결정에 래 디 칼의 확산을 발생할 수 있습니다 방사선 손상의 확장을 제한 하려면 하나의 단 결정 미세 장치에서 구획 당 노출 합니다. 데이터 수집의 속도 개선 하기 위해,이 한다 자동화 미래에.
크리스탈 형태학, 때문에 어떤 경우에 기본 방향을 발생할 수 있습니다. 이것은 예 thioredoxin 데이터 집합의 경우 크리스탈 칩 윈도우 기준으로 강력 하 게 원하는 방향을 했다. 여기에 완전 한 회절 데이터 집합을 수집 수 합니다. 결정 전시 칩에 기본 방향 및 특히 해당 공간 그룹은 또한 낮은 대칭, 경우 다음 데이터 집합의 완전성 모니터링 해야 컬렉션 동안 충분 한 회절 패턴 지팡이 하도록 하는 경우 수집.
이러한 칩을 사용 하 여 시간 해결 연구는 빛을 사용 하 여 펌프-프로브 방식으로 반응을 유발 하는 경우 직접 가능 합니다. COC를 사용할 수 또는 폴 호 일 광선 전송 펌프 레이저에 대 한 해명 되 고 또는 광학 투명 폴 필요 합니다. 현재 미세 형상 결정 성장 후 실험을 혼합 하는 기판에 대 한 허용 하지 않습니다. 그러나, 우리는 또한 같은 혼합 두 시간 해결 x 선 회절에 대 한 디자인으로 접근19뿌리에 적합 하도록 설명된 x 선 칩 제조 프로토콜을 기대 합니다.

단백질의 3D 구조를 알고 이해의 기능을 필수적 이다. 근처 원자 해결책 구조 엑스레이 결정학에 의해 지금까지 가장 일반적으로 얻어진 다. 이 기술은 단백질 결정 x 선 방사선에 노출 하 고 결과 회절 패턴은 다음 구조 결정 및 수정에 대 한 분석. 전통적인 엑스레이 결정학, 극저온 온도에서 단일 적으로 큰 크리스탈에서 완전 한 회절 데이터 집합 기록 됩니다. 그러나 이러한 결정, 주로 성장, 하 찮 고 적당 한 곳을 알아내는-보존 조건 식별 하 수 그 자체에 도전 되 고 때때로 또한 네이티브 단백질 구조5에서 편차를 발생할 수 있습니다.
X 선 자유 전자 레이저 (FEL)에 싱크 로트 론 beamlines 최근의 기술 진보는 더 작은 크리스탈 구조를 해결 하기 위해 허용, 새로운 마이크로 초점 beamlines로 증가 x 선 빔 광채, 그리고 향상 된 x 선 검출기 되었다 사용 가능한6,7. 일반적으로, 작은 결정은 보다 큰 성장 하 고 무료 크리스탈8,9제거 하기 쉽습니다. 그러나, 작은 결정 큰 결정 보다 훨씬 더 빠른 x 선 방사선 손상 으로부터 고통. 이 때문에 대형 크리스탈에 비해, 더 높은 엑스레이 복용량 비교 해상도를 diffract에 작은 크리스탈 볼륨으로 예상 해야 합니다. 따라서, 심지어 극저온 보호가 아니다 종종 단일 microcrystal에서 완전 한 회절 데이터 집합을 기록 하는 데 충분 한.
이 장애물을 극복 하기 위해 직렬 결정학 수집 하 고 완전 한 데이터 집합을 얻기 위해 많은 무작위로 지향된 microcrystals에서 회절 패턴을 병합 선택의 방법 되고있다. 방사선 유발된 크리스탈 손상 총 엑스레이 복용량을 확산 하 여 최소화 높은 수 결정5,10의 단백질 구조를 해결 하는 데 사용. 에 ' diffract 전에 파괴 ' 펠 실험, 각 결정은 femto 초 x-선 펄스를 사용 하 여 하나의 노출에만 사용 됩니다. 제 3 세대 싱크 로트 론 근원에 마이크로 포커스 beamlines 차례로 몇 밀리초 짧은 x 선 노출11,12,,1314직렬 결정학을 수행할 수 있습니다. 그러나 크리스탈 발진 또는 데이터 수집 하는 동안 회전, 없이, 부분 브래그 반사만 기록 될 수 및 따라서 수천 수만 또는 더 많은 회절 패턴은 일반적으로 구조 결정15필요. 날짜 하려면, 다양 한 샘플 전달 방법 최근 검토14,,1617,18,19로 직렬 결정학에 대 한 개발 되었습니다. 그 사이 여러 고정 대상 기반 샘플 배달 되도록 크게 적은 회절 패턴 제공할 수 있는 동등 하 게 완전 한 데이터 집합 또한 더 적은 소모 하는 동안 전략 성공적으로 크리스탈 회전 x 선 노출 동안 결합 했다 샘플에 비해 클래식 직렬 결정학에 스틸 이미지는 실험 기록7,,1620,21,,2223 , 24.
우리는 낮은 x 선 배경으로 미세 장치를 조작 하는 프로토콜을 제시. 장치와 소프트 리소 그래피를 사용 하 여 5 분 에폭시 접착제에서 꽃무늬는 x 선 설정에 직접 통합 하는 경우로 샘플 준비에서 혜택을 실 온에서 제자리에서 x 선 회절 실험에 적합 시간 해결 연구 혼합 유도 속도 론18,19을 따라. 미세 채널은 폴리머 polyimide 호, 낮은 x 선 배경 이미지에 대 한 허용 하는 약 16 µ m의 결합된 두께 가진 x 선 창에서 결과 양쪽 모두 옛. 사용된 하는 모든 자료는 좋은 용 매 저항을 제공합니다. 이 제조 방법은 comparably 간단 하 고 저렴 한입니다. 수-8 마스터 웨이퍼 소싱, 후 모든 제작 일반적인 연구 실험실 설정에서 클린 룸 밖에 서 완료할 수 있습니다.
각도 고정된 대상 직렬 결정학 기반 응용 프로그램 예를 들어, 우리 칩 설명. 첫째, 모 세관 valving microfluidically nanoliter 크기의 방울의 선택한 번호에 수성 반응 분할을 사용 하 여에 대 한 설계 및 제조 고려 사항은 설명 합니다. 이 로딩 방식에서 채널 죽은 볼륨 샘플 손실 방지와 분할 쉽게 수행할 수 있습니다 수동으로 작동 유체에 대 한 펌프 또는 다른 장비를 사용 하지 않고. 단백질 해결책의 이러한 격리 nanoliter 크기의 방울 모니터링 현장에서 제어 단백질 크리스탈 nucleation 및 성장 동적 산란 (DL)을 사용 하 여 있습니다. 그것은 이전 DL 측정 유리 슬라이드25,26에 보 세입니다 (PDMS) 구조의 구성 된 미세 장치에서 수행할 수 있습니다 입증 되었습니다. 구체의 레이어에 파장 550 이상에 대 한 높은 전송 때문에 nm, 접근 확장 될 수 있습니다 투명 칩에 게 뿐만 아니라, x-선 측정에 적합 한 레이저 파장27,28을 사용 하는 경우. DL 결과에 따라, 초기 nucleation 관찰 될 수 있다, 그리고 더 작은 물방울 증발 적지만 큰 단백질 결정을 얻을 수 수 있습니다.
충분 한 결정 성장 후에, 완전 한 x 선 회절 데이터 집합 다음 실 온에서 각도 기반 제자리에 고정 대상 직렬 엑스레이 결정학을 사용 하 여 수집할 수 있습니다. 회절 데이터 집합 단백질 결정 구조를 해결 하기 위해 일련의 소프트웨어 도구와 사용자 지정 스크립트를 사용 하 여 처리 됩니다. 이 기술은 유물 종종 cryo 보전 기존의 결정학 실험에 사용 되는 동안 유도 방지 합니다.
우리에 대 한 사용 하 여 해결 했다 3 개의 단백질 대상 구조를 비교 하 여 10-20 µ m 작은 결정 더 나은 다음 2 Å 해상도 칩에서 성장. Crystallizing 고 제자리에서처리 및 따라서 기계 diffracting에 의해 깨지기 쉬운 크리스탈의 소요 최소화 됩니다. 이 프로토콜은 낮은 해상도 (1.7 Å 3.0 Å)로 높은 해상도를 diffract는 단백질 결정을 위해 적용할 수 있습니다. 거의 모든 크리스탈 회절에 대 한 사용할 수 있는, 매우 효율적인 크리스탈 전달 방법을 만드는 작은 샘플 낭비 이다.
이 프로토콜 제자리에서 단백질 결정 화 및 회절 데이터 수집에 대 한 x 선 투명 미세 칩을 준비 하는 방법에 대 한 상세한 가이드를 제공 합니다. 절차는 실험실에서 정교한 장비가 필요 없이 미세 정밀 혜택을 신중 하 게 설계 되었다. 또한, 싱크 로트 론 beamline에 데이터 수집 비 전문가가 전문된 각도 또는 쉽게 재현 결과 가습기 필요 없이 수행할 수 있습니다. 제시 기법 크리스탈 또는 곳을 알아내는-보호 처리에 의해 직렬 밀리초 결정학 데이터 수집을 위해 실내 온도에 방사선 손상을 최소화 하면서 고 성장 후 크리스탈을 스트레스 없이 적용할 수 있습니다. 따라서, 설명 방법은 어떤 단백질 결정 화 프로젝트에 적합 합니다.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Series</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Epoxy glue</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silicone</td></tr><tr><td>Kapton foil</td><td>Dupont/ American Durafilm</td><td>HN grade, gauge 30 (7.5 &amp;mu;m)</td><td>polyimide foil</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop fluoropolymer coating</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-solvent</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Fluorinated oil</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD Software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Photo mask</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 inch wafer</td><td>University Wafer</td><td></td><td>Silicon wafer</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>S&amp;Uuml;SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Mask aligner</td></tr><tr><td>PDMS mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plasma machine</td><td>Diener electronic</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Glucose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Tartrate</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SPG buffer</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &amp;micro;m filter</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td></tr><tr><td>Syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock Tip</td></tr><tr><td>Needle&amp;nbsp;</td><td>Terumo Agani Needle</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8&quot;</td></tr></tbody></table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

이 프로토콜 낮은 x 선 배경 각도 고정된 대상 직렬 결정학을 기반으로 최적화 된 조작 미세 장치를 설명 합니다. 소자는 소프트 리소 그래피를 사용 하 여 에폭시 접착제에서 모방 하 고 실 온에서 x 선 회절 실험 현장에 적합. 샘플 웰 스는 낮은 x 선 배경으로 회절 데이터 수집을 허용 하는 폴리머 polyimide 호 창문이 양쪽에 옛. 이 제조 방법은 요구 하 고 저렴 한입니다. 수-8 마스터 웨이퍼의 소싱 후 모든 제작 일반 연구 랩 환경에서 클린 룸 밖에 서 완료할 수 있습니다. 칩 설계 및 제조 프로토콜 모 세관 valving 정의 nanoliter 크기의 방울으로 수성 반응을 분할 하는 microfluidically를 사용 합니다. 이 로딩 메커니즘 채널 죽은 볼륨에서 샘플 손실 방지 하 고 쉽게 작동 유체에 대 한 펌프 또는 다른 장비를 사용 하지 않고 수동으로 수행할 수 있습니다. 우리는 단백질 해결책의 어떻게 격리 nanoliter 크기의 방울 수 수 모니터링 현장에 동적 빛에 의해 비 산 제어 단백질 크리스탈 nucleation 및 성장에 설명 합니다. 적당 한 결정 성장 후에, 완전 한 x 선 회절 데이터 집합 기반 각도 제자리에 고정 대상 직렬 엑스레이 결정학을 사용 하 여 실 온에서 수집할 수 있습니다. 프로토콜 수정 단백질 결정 구조를 해결 하기 위해 소프트웨어 도구 제품군을 사용 하 여 회절 데이터 집합을 처리 하는 사용자 지정 스크립트를 제공 합니다. 이 이렇게 유물 가능성이 cryo 보전 또는 수동 크리스탈 기존의 결정학 실험에서 처리 하는 동안 유도 방지 합니다. 우리가 제시 하 고 약 10-20 µ m 칩에서의 크기와 작은 결정을 사용 하 여 해결 했다 3 개의 단백질 구조 비교. Crystallizing 고 제자리에서처리 및 따라서 기계 diffracting에 의해 깨지기 쉬운 크리스탈의 소요 최소화 됩니다. 프로토콜에는 제자리에 직렬 결정학에 대 한 적합 한 사용자 지정 x 선 투명 미세 칩을 조작 하는 방법을 자세히 설명 합니다. 거의 모든 크리스탈 회절 데이터 수집을 위해 사용 될 수 있습니다, 이러한 미세 칩은 매우 효율적인 크리스탈 배달 방법입니다.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

이 프로토콜은 자세하게에서 조작 상 온에서 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 미세 장치를 작동 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 그것은 동적 산란에 의해 단백질 결정 화를 모니터링 하는 방법 설명 하 고 처리 하 고 분석 하는 방법을 얻은 회절 데이터.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

microfluidic-chips-for-situ-crystal-x-ray-diffraction-situ-dynamic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

14.6K 조회수.  DESY. 이 프로토콜은 자세하게에서 조작 상 온에서 x 선 회절 데이터 컬렉션에 대 한 미세 장치를 작동 하는 방법을 설명 합니다. 또한, 그것은 동적 산란에 의해 단백질 결정 화를 모니터링 하는 방법 설명 하 고 처리 하 고 분석 하는 방법을 얻은 회절 데이터.

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

연구

화학

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

생화학

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

보존 과학의 X 선 분말 회절 : 문화 예술에 부식 제품의 일상적인 결정 구조 결정을 향해

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. The DAC program at 13-BM-C is part of the Partnership for Extreme Xtallography (PX^2) project. BX-90 type DACs with conical-type diamond anvils and backing plates are recommended for these experiments. The sample chamber should be loaded with noble gas to maintain a hydrostatic pressure environment. The sample is aligned to the rotation center of the diffraction goniometer. The MARCCD area detector is calibrated with a powder diffraction pattern from LaB6. The sample diffraction peaks are analyzed with the ATREX software program, and are then indexed with the RSV software program. RSV is used to refine the UB matrix of the single crystal, and with this information and the peak prediction function, more diffraction peaks can be located. Representative single crystal diffraction data from an omphacite (Ca0.51Na0.48)(Mg0.44Al0.44Fe2+0.14Fe3+0.02)Si2O6 sample were collected. Analysis of the data gave a monoclinic lattice with P2/n space group at 0.35 GPa, and the lattice parameters were found to be: a = 9.496 &#177;0.006 &#197;, b = 8.761 &#177;0.004 &#197;, c = 5.248 &#177;0.001 &#197;, &#946; = 105.06 &#177;0.03&#186;, &#945; = &#947; = 90&#186;.

In this report, we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. ATREX and RSV programs are used to analyze the data.

고압 PX에서 단결정 회절 ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. A prerequisite for the method is that highly ordered crystalline specimen need to be grown from the macromolecule to be studied, which then need to be prepared for the diffraction experiment. This preparation procedure typically involves removal of the crystal from the solution, in which it was grown, soaking of the crystal in ligand solution or cryo-protectant solution and then immobilizing the crystal on a mount suitable for the experiment. A serious problem for this procedure is that macromolecular crystals are often mechanically unstable and rather fragile. Consequently, the handling of such fragile crystals can easily become a bottleneck in a structure determination attempt. Any mechanical force applied to such delicate crystals may disturb the regular packing of the molecules and may lead to a loss of diffraction power of the crystals. Here, we present a novel all-in-one sample holder, which has been developed in order to minimize the handling steps of crystals and hence to maximize the success rate of the structure determination experiment. The sample holder supports the setup of crystal drops by replacing the commonly used microscope cover slips. Further, it allows in-place crystal manipulation such as ligand soaking, cryo-protection and complex formation without any opening of the crystallization cavity and without crystal handling. Finally, the sample holder has been designed in order to enable the collection of in situ X-ray diffraction data at both, ambient and cryogenic temperature. By using this sample holder, the chances to damage the crystal on its way from crystallization to diffraction data collection are considerably reduced since direct crystal handling is no longer required.

A novel sample holder for macromolecular X-ray crystallography along with a suitable handling protocol is presented. The system allows crystal growth, crystal soaking and in situ diffraction data collection at both, ambient and cryogenic temperature without the need of any crystal manipulation or mounting.

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

생체공학

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder microdiffraction two-dimensional (2D) maps at beamline 12.3.2 of the Advanced Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Measurements can be performed on any sample that is less than 10 cm x 10 cm x 5 cm, with a flat exposed surface. The experimental geometry is calibrated using standard materials (elemental standards for XRF, and crystalline samples such as Si, quartz, or Al2O3 for diffraction). Samples are aligned to the focal point of the x-ray microbeam, and raster scans are performed, where each pixel of a map corresponds to one measurement, e.g., one XRF spectrum or one diffraction pattern. The data are then processed using the in-house developed software XMAS, which outputs text files, where each row corresponds to a pixel position. Representative data from moissanite and an olive snail shell are presented to demonstrate data quality, collection, and analysis strategies.

We describe a beamline setup meant to carry out rapid two-dimensional x-ray fluorescence and x-ray microdiffraction mapping of single crystal or powder samples using either Laue (polychromatic radiation) or powder (monochromatic radiation) diffraction. The resulting maps give information about strain, orientation, phase distribution, and plastic deformation.

싱크 로트 론 엑스레이 Microdiffraction 및 광물 및 암석 샘플의 형광 이미징

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

공학

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

시투 X선 회절 연구를 위한 미세 투약에 의한 칩에 단백질의 결정화

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

온칩 결정화 및 실온에서의 대규모 연속 회절

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

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