Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di seme PIER PIF-2015-46, BMBF concede a 05K16GUA, 05K12GU3 e il cluster di eccellenza 'Il centro di Amburgo per Imaging ultraveloce – struttura, dinamica e controllo della materia su scala atomica' della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Il lavoro degli autori affiliato con il centro per Free Electron Laser Science è stato finanziato dall'Associazione Helmholtz attraverso fondi del programma orientato. Il sincrotrone MX sono stati raccolti presso beamline P14 operati da EMBL Hamburg presso l'anello PETRA III (DESY, Amburgo, Germania).

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Noi fabbricare dispositivi microfluidici per in situ diffrazione dei raggi x di patterning resina epossidica come pellicola di polyimide e materiale come materiale della finestra di riempimento. La nostra procedura ottimizzato vari passaggi del processo di fabbricazione sul precedente raggi x chip disegni16,21. Abbiamo ridotto lo spessore della finestra e quindi lo sfondo dispersione mentre anche fabbricazione di interpolazione come meno passaggi di processo sono necessari. cristallizzazione in situ utilizzando il protocollo descritto ha notevoli benefici. Esso consente la raccolta dei dati di diffrazione a temperatura ambiente ed esclude pertanto la necessità della protezione di cryo, che in alcuni casi contiene il rischio di introdurre artefatti nella struttura della proteina. Inoltre, i cristalli non sono soggette a stress fisico, perché il trasferimento dei cristalli dal loro ambiente nativo può essere evitato. Attraverso questa procedura, i cristalli di mantengono la loro qualità più alta e non soffrono di alcun trattamento.
Nella nostra esperienza, le fasi più critiche all'interno del protocollo ruotano intorno a controllare il processo di cristallizzazione. I parametri per ottenere cristalli adatti ai raggi x con dimensioni appropriate devono essere identificati empiricamente e non possono essere preso direttamente da esperimenti di diffusione del vapore. Utilizzando identiche concentrazioni di proteina e precipitante non ha sempre provocato in cristalli in diversi chip, o a volte in diversi pozzi all'interno del chip stesso. Ciò indica che tutti i fattori che influenzano la crescita e la nucleazione del cristallo dovrebbero essere considerati con attenzione, come la cinetica di composizione o cristallizzazione dei liquori di madre (attraverso la traiettoria di evaporazione). Come più grandi cristalli diffrangono a risoluzione più alta, opportunamente grandi cristalli idealmente sono coltivate. Il processo di nucleazione del cristallo e crescita può essere seguito con misurazioni di liste di distribuzione. Regolare il fuoco del laser all'interno del µm ~ 50 scomparti sottile cristallizzazione del chip possono essere impegnativi e possono richiedere attento allineamento manuale. Utilizzando pozzi più profondi rispetto a 100 µm, auto-allineamento laser era fattibile e affidabile, tale che pozzi multipli possono essere monitorati attraverso sistemi di acquisizione automatica.
I chip di raggi x di polyimide basato producono solo un basso fondo e dimostriamo l'idoneità di questi dispositivi per la raccolta dei dati di diffrazione di raggi x di routine risolvendo strutture per tre proteine modello. La migliore risoluzione ottenuta nel chip ha differito, confrontato con risoluzioni precedentemente raggiunti, dalla raccolta di dati di raggi x convenzionale e significativamente più grandi cristalli della proteina. Questo potrebbe essere dovuto a diversi fattori e ulteriore ottimizzazione di condizione di cristallizzazione può migliorare ulteriormente la diffrazione. È stato possibile raccogliere dati di diffrazione in situ fino a 1,8 risoluzione Å applicando cristallo con dimensioni inferiori a 30 µm. L'analisi dettagliata dei dati di diffrazione taumatina fornito le comprensioni circa danno da radiazione. Per limitare il danno da radiazione di estendere, solo un singolo cristallo deve essere esposto per vano nel dispositivo microfluidico, come la diffusione dei radicali e in cristalli vicini può verificarsi. Per migliorare la velocità di raccolta dei dati, questo deve essere automatizzato in futuro.
A causa della morfologia del cristallo, in alcuni casi può verificarsi un orientamento preferito. Questo era per esempio il caso con il dataset di thioredoxin, dove i cristalli hanno avuto un orientamento decisamente da preferire rispetto le finestre di chip. Anche qui, abbiamo potuto raccogliere un set di dati di diffrazione completa. Se cristalli presentano un orientamento preferito nel chip e in particolare se il corrispondente gruppo di spazio ha anche una simmetria bassa, quindi la completezza del dataset deve essere monitorata durante la raccolta tale da essere sufficiente canna di reticoli di diffrazione raccolti.
Studi di tempo-risolta utilizzando questi chip sono direttamente possibili quando usando la luce indotto reazioni con un approccio di pompa-sonda. La trasmissione della luce pellicola di polyimide per il laser di pompa deve essere chiarita e in alternativa, otticamente chiaro polyimide o COC potrebbero essere utilizzati. Le geometrie di microfluidica corrente non consentono per miscelazione esperimenti dopo i cristalli sono cresciuti del substrato. Tuttavia, ci aspettiamo che il protocollo di fabbricazione dei chip di raggi x descritto anche essere adatto per tali disegni per entrambi diffrazione di raggi x risolta in tempo di miscelazione, nonché approcci19di scattering.

Conoscere la struttura 3D di una proteina è essenziale per capire la sua funzionalità. Strutture di risoluzione vicino-atomica finora sono più comunemente ottenuti dalla cristallografia a raggi x. Questa tecnica espone cristalli della proteina di radiazione a raggi x e i modelli di diffrazione risultanti vengono poi analizzati per raffinatezza e determinazione della struttura. In cristallografia a raggi x tradizionali, un set di dati di diffrazione completa è registrata da un cristallo singolo, idealmente grande, alle temperature criogeniche. Tali cristalli, tuttavia, per lo più non sono banali a crescere, e per identificare condizioni di crioconservazione adatto può diventare impegnativo in sé e a volte anche causare deviazioni dalla struttura della proteina nativa5.
I recenti progressi tecnologici in laser a elettroni liberi a raggi x (FEL) e sincrotrone beamlines hanno permesso di risolvere strutture da cristalli più piccoli, come nuovo beamlines micro-messa a fuoco, brillantezza del fascio di raggi x aumentato e migliorati rivelatori di raggi x è diventato disponibili6,7. In genere, piccoli cristalli sono più facili a crescere più grande e gratuito cristalli8,9il difetto. Tuttavia, piccoli cristalli soffrono di danni di radiazione di raggi x molto più veloci di cristalli di grandi dimensioni. Questo perché rispetto ad un grande cristallo, una dose elevata di raggi x deve essere proiettata in un più piccolo volume di cristallo a diffrangono risoluzione paragonabile. Di conseguenza, anche criogenico protezione spesso non è sufficiente per registrare un set di dati di diffrazione completa da un singolo microcrystal.
Per superare questo ostacolo, cristallografia seriale è diventato il metodo di scelta per raccogliere e unire i pattern di diffrazione da molti microcristalli orientati casualmente per ottenere un set di dati completo. Radiazione sono ridotta a icona di cristallo indotto danni diffondendo la dose totale di raggi x utilizzati per risolvere una struttura proteica sopra un alto numero di cristalli5,10. In un ' diffrangono prima distruggere ' esperimento di FEL, ogni cristallo viene utilizzato solo per un'esposizione usando gli impulsi di raggi x di femto secondi. A sua volta, micro-focus beamlines presso sincrotroni di terza generazione in grado di eseguire seriale cristallografia con qualche millisecondo breve raggi x CVE11,12,13,14. Senza un cristallo oscillazione o rotazione durante la raccolta dati, tuttavia, possono essere registrati solo parziale riflessioni di Bragg e quindi decine di migliaia o più modelli di diffrazione sono in genere necessari per la determinazione di struttura15. Ad oggi, un insieme diversificato di metodi di consegna del campione è stato sviluppato per la cristallografia di seriale, come recentemente rivisto14,16,17,18,19. Tra quelli, diversi bersaglio fisso basato su strategie con successo sono state combinate con rotazione di cristallo durante le esposizioni ai raggi x tale che significativamente meno motivi di diffrazione possono fornire ugualmente completa di set di dati, anche consumando meno di consegna del campione campione rispetto alla classica seriale cristallografia esperimenti cui sono ancora le immagini registrate7,16,20,21,22,23 , 24.
Vi presentiamo un protocollo per fabbricare dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa dei raggi x. I dispositivi vengono campiti da colla a resina epossidica 5 min mediante litografia soft e sono adatti per gli esperimenti di diffrazione di raggi x in situ a temperatura ambiente che beneficiano di integrare la preparazione dei campioni direttamente in set-up di raggi x, come nel caso di risolta in tempo gli studi che seguono cinetica indotta da miscelazione18,19. Canali microfluidici sono con coperchio su entrambi i lati con un foglio di poliimmide polimerici, conseguente windows di raggi x con uno spessore combinato di circa 16 µm che consentono il basso imaging a raggi x sfondo. Tutti i materiali utilizzati offrono buona resistenza ai solvente. Questo metodo di fabbricazione è relativamente semplice e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico.
In un esempio di applicazione, descriviamo chip per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. In primo luogo, le considerazioni di progettazione e fabbricazione per l'utilizzo di valvole capillare a microfluidically dividere una reazione acquosa in un numero selezionato di nanolitro dimensioni goccioline sono discusse. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione dal canale morto-volume e spaccare facilmente può essere eseguita manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Tale isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica sono monitorati in situ mediante diffusione dinamica della luce (DLS) di controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Precedentemente è stato dimostrato che misure di liste di distribuzione possono essere eseguite in dispositivi microfluidici che consiste di una struttura di polidimetilsilossano (PDMS) legata a un vetro diapositiva25,26. Perché lo strato di polyimide ha un alta trasmissione per lunghezze d'onda più di 550 nm, l'approccio può essere esteso alle misurazioni in fiches trasparente ai raggi x, quando si utilizza un laser appropriato lunghezza d'onda27,28. Base ai risultati DLS, nucleazione iniziale può essere osservato, e ulteriore evaporazione goccia può essere fermato per ottenere cristalli della proteina di meno ma più grandi.
Dopo sufficiente cristalli vengono coltivati, set di dati completo diffrazione di raggi x può essere raccolto quindi utilizzando goniometro basato in situ fissata destinazione seriale cristallografia a raggi x a temperatura ambiente. I set di dati di diffrazione sono trattati con una suite di strumenti software e script personalizzati per risolvere la struttura di cristallo della proteina. Questa tecnica evita manufatti spesso indotti durante la crio-conservazione usati negli esperimenti di cristallografia convenzionale.
Mettiamo a confronto tre strutture di destinazione di proteine che sono stati risolti utilizzando circa 10-20 µm piccoli cristalli cresciuti nel chip migliore poi 2 risoluzione Å. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Questo protocollo può essere applicato per cristalli proteici che diffrangono ad alta risoluzione, nonché a bassa risoluzione (1.7 Å a 3.0 Å). Come quasi ogni cristallo può essere usato per la diffrazione, piccolo campione è sprecato, rendendo questo un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata su come preparare chip microfluidici trasparente ai raggi x in situ proteina cristallizzazione e diffrazione di raccolta dei dati. La procedura è stato attentamente progettata di beneficiare di microfluidica precisione senza richiedere sofisticate apparecchiature in laboratorio. Inoltre, raccolta di dati presso la beamline di sincrotrone può essere eseguita senza la necessità di un goniometro specializzato o un umidificatore per facilitare che riproducono i risultati da non esperti. La tecnica presentata può essere applicata per millisecondo seriale cristallografia raccolta di dati a temperatura ambiente mantenendo il danno da radiazione minima e senza introdurre lo stress ai cristalli dopo crescita gestendo cryo-protezione o cristallo. Quindi, il metodo descritto è adatto per qualsiasi progetto di cristallizzazione di proteine.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Series</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Epoxy glue</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silicone</td></tr><tr><td>Kapton foil</td><td>Dupont/ American Durafilm</td><td>HN grade, gauge 30 (7.5 &amp;mu;m)</td><td>polyimide foil</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop fluoropolymer coating</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-solvent</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Fluorinated oil</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD Software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Photo mask</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 inch wafer</td><td>University Wafer</td><td></td><td>Silicon wafer</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>S&amp;Uuml;SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Mask aligner</td></tr><tr><td>PDMS mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plasma machine</td><td>Diener electronic</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Glucose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Tartrate</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SPG buffer</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &amp;micro;m filter</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td></tr><tr><td>Syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock Tip</td></tr><tr><td>Needle&amp;nbsp;</td><td>Terumo Agani Needle</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8&quot;</td></tr></tbody></table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Questo protocollo descrive la fabbricazione di dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa di raggi x ottimizzato per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. I dispositivi vengono campiti da colla epossidica mediante litografia soft e sono adatti per in situ esperimenti di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. I pozzetti sono con coperchio su entrambi i lati con finestre di lamina polimerica polyimide che consentono la raccolta di dati di diffrazione con bassa priorità bassa dei raggi x. Questo metodo di fabbricazione è poco impegnativo e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico. Il protocollo di progettazione e fabbricazione di chip utilizzano valvole capillare per dividere una reazione acquosa in goccioline nanolitro definite dimensioni microfluidically. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione da morti-volume del canale e può facilmente essere eseguito manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Descriviamo come isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica può essere monitorati in situ di luce dinamica scattering controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Dopo cristalli adatti sono sviluppati, diffrazione di raggi x completo set di dati possono essere raccolti tramite goniometro basato in situ fissata destinazione cristallografia a raggi x seriale a temperatura ambiente. Il protocollo fornisce script personalizzati per elaborare diffrazione DataSet utilizzando una suite di strumenti software per risolvere e perfezionare la struttura di cristallo della proteina. Questo approccio evita i manufatti possibilmente indotti durante la crioconservazione o cristallo manuale gestione in esperimenti di cristallografia convenzionale. Presentiamo e confrontare tre strutture di proteine che sono stati risolti utilizzando piccoli cristalli con dimensioni di circa 10-20 µm cresciuti nel chip. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Il protocollo dettaglia come fabbricare un chip microfluidico trasparente raggi x custom adatto per in situ seriale cristallografia. Come quasi ogni cristallo può essere utilizzato per la raccolta di dati di diffrazione, questi chip microfluidici sono un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

14.6K Views.  DESY. Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Ricerca

Chimica

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Biochimica

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

Diffrazione di raggi X Polvere in Conservazione Scienza: verso Routine di cristallo Struttura Determinazione di corrosione prodotti sul patrimonio Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. The DAC program at 13-BM-C is part of the Partnership for Extreme Xtallography (PX^2) project. BX-90 type DACs with conical-type diamond anvils and backing plates are recommended for these experiments. The sample chamber should be loaded with noble gas to maintain a hydrostatic pressure environment. The sample is aligned to the rotation center of the diffraction goniometer. The MARCCD area detector is calibrated with a powder diffraction pattern from LaB6. The sample diffraction peaks are analyzed with the ATREX software program, and are then indexed with the RSV software program. RSV is used to refine the UB matrix of the single crystal, and with this information and the peak prediction function, more diffraction peaks can be located. Representative single crystal diffraction data from an omphacite (Ca0.51Na0.48)(Mg0.44Al0.44Fe2+0.14Fe3+0.02)Si2O6 sample were collected. Analysis of the data gave a monoclinic lattice with P2/n space group at 0.35 GPa, and the lattice parameters were found to be: a = 9.496 &#177;0.006 &#197;, b = 8.761 &#177;0.004 &#197;, c = 5.248 &#177;0.001 &#197;, &#946; = 105.06 &#177;0.03&#186;, &#945; = &#947; = 90&#186;.

In this report, we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. ATREX and RSV programs are used to analyze the data.

Alta pressione singolo cristallo di diffrazione a PX ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. A prerequisite for the method is that highly ordered crystalline specimen need to be grown from the macromolecule to be studied, which then need to be prepared for the diffraction experiment. This preparation procedure typically involves removal of the crystal from the solution, in which it was grown, soaking of the crystal in ligand solution or cryo-protectant solution and then immobilizing the crystal on a mount suitable for the experiment. A serious problem for this procedure is that macromolecular crystals are often mechanically unstable and rather fragile. Consequently, the handling of such fragile crystals can easily become a bottleneck in a structure determination attempt. Any mechanical force applied to such delicate crystals may disturb the regular packing of the molecules and may lead to a loss of diffraction power of the crystals. Here, we present a novel all-in-one sample holder, which has been developed in order to minimize the handling steps of crystals and hence to maximize the success rate of the structure determination experiment. The sample holder supports the setup of crystal drops by replacing the commonly used microscope cover slips. Further, it allows in-place crystal manipulation such as ligand soaking, cryo-protection and complex formation without any opening of the crystallization cavity and without crystal handling. Finally, the sample holder has been designed in order to enable the collection of in situ X-ray diffraction data at both, ambient and cryogenic temperature. By using this sample holder, the chances to damage the crystal on its way from crystallization to diffraction data collection are considerably reduced since direct crystal handling is no longer required.

A novel sample holder for macromolecular X-ray crystallography along with a suitable handling protocol is presented. The system allows crystal growth, crystal soaking and in situ diffraction data collection at both, ambient and cryogenic temperature without the need of any crystal manipulation or mounting.

Un portacampioni all-in-one per la cristallografia a raggi X macromolecolare con una dispersione minima dello sfondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Un chip microfluidico per ICPMS introduzione del campione

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Bioingegneria

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder microdiffraction two-dimensional (2D) maps at beamline 12.3.2 of the Advanced Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Measurements can be performed on any sample that is less than 10 cm x 10 cm x 5 cm, with a flat exposed surface. The experimental geometry is calibrated using standard materials (elemental standards for XRF, and crystalline samples such as Si, quartz, or Al2O3 for diffraction). Samples are aligned to the focal point of the x-ray microbeam, and raster scans are performed, where each pixel of a map corresponds to one measurement, e.g., one XRF spectrum or one diffraction pattern. The data are then processed using the in-house developed software XMAS, which outputs text files, where each row corresponds to a pixel position. Representative data from moissanite and an olive snail shell are presented to demonstrate data quality, collection, and analysis strategies.

We describe a beamline setup meant to carry out rapid two-dimensional x-ray fluorescence and x-ray microdiffraction mapping of single crystal or powder samples using either Laue (polychromatic radiation) or powder (monochromatic radiation) diffraction. The resulting maps give information about strain, orientation, phase distribution, and plastic deformation.

Microdiffrazione dei raggi x di sincrotrone e formazione immagine di fluorescenza del minerale e campioni di roccia

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Ingegneria

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Cristallizzazione e determinazione strutturale di un enzima:complesso di substrati mediante cristallografia seriale in un chip microfluidico versatile

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

Cristallizzazione delle proteine su chip mediante microdialisi per studi di diffrazione a raggi X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

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