Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
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Este trabalho foi financiado pelo fundo de semente PIER PIF-2015-46, o BMBF concede 05K16GUA e 05K12GU3 e o cluster de excelência 'The centro de Hamburgo para Ultrafast Imaging – estrutura, dinâmica e controle da matéria na escala atômica' do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). O trabalho dos autores afiliado com o centro para a ciência do Laser de elétrons livres foi financiado pela Associação Helmholtz, através de fundos do programa orientado. Os dados de MX síncrotron foi coletados na trajetória P14 operado pelo EMBL de Hamburgo no anel de armazenamento de PETRA III (DESY, Hamburgo, Alemanha).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Podemos fabricar dispositivos microfluídicos por difração de raios x em situ pela padronização de resina epóxi como preenchimento da folha de material e poliimida como material de janela. Nosso procedimento otimizado várias etapas do processo de fabricação mais raio-x anterior microplaqueta projetos16,21. Nós reduzimos a espessura de janela e, assim, o fundo dispersando enquanto também facilitando a fabricação menos etapas do processo são necessárias. cristalização em situ usando o protocolo descrito tem benefícios substanciais. Permite que coleta de dados de difração na temperatura e, assim, exclui a necessidade de proteção da cryo, que, em alguns casos, contém o risco de introdução de artefatos na estrutura da proteína. Além disso, os cristais não são sujeitos a estresse físico, porque a transferência dos cristais de seu ambiente nativo pode ser evitada. Através deste procedimento, os cristais de mantêm sua alta qualidade e não sofrem de qualquer tratamento.
Em nossa experiência, os passos mais críticos dentro do protocolo giram em torno de controlar o processo de cristalização. Os parâmetros para obter cristais adequados de raio-x com dimensões apropriadas precisam ser identificado empiricamente e não podem ser levados diretamente a partir de experiências de difusão de vapor. Usar idênticas concentrações de proteína e dessensibilizador não sempre resultou em cristais em fichas diferentes, ou às vezes em poços diferentes dentro do mesmo chip. Isto indica que todos os fatores que influenciam o crescimento e a nucleação de cristal devem ser considerados com cuidado, como mãe licor composição ou cristalização cinética (através da trajetória de evaporação). Como cristais maiores difração de maior resolução, devidamente grandes cristais são idealmente cultivados. O processo de nucleação de cristais e crescimento pode ser seguido com medições de DLS. Ajustar o foco do laser dentro do ~ 50 µm compartimentos de cristalização fina do chip podem ser desafiadoras e podem exigir cuidado alinhamento manual. Por meio de poços mais profundos do que 100 µm, laser autoalinhamento era viável e confiável, tal que vários poços podem ser monitorados através de sistemas automatizados de aquisição.
Os chips de raio-x de poliimida com base em produzem apenas um baixo fundo e demonstramos a adequação desses dispositivos para a rotina de coleta de dados de difração de raios-x através da resolução de estruturas para três proteínas do modelo. A melhor resolução obtida em chip diferem, em comparação com resoluções anteriormente alcançadas, de cristais de proteína significativamente maiores e coleta de dados de raio-x convencional. Isto pode ser devido a vários fatores, e ainda mais a otimização de condição de cristalização pode melhorar ainda mais a difração. Foi possível coletar dados em situ de difração em resoluções de até 1,8 Å aplicando cristal com dimensões menores que 30 µm. A análise detalhada dos dados de difração Taumatina forneceu insights sobre danos de radiação. Para limitar a extensão dos danos de radiação, apenas um único cristal deve ser exposto por compartimento no dispositivo microfluidic, como a difusão de radicais e em cristais vizinhos pode ocorrer. Para melhorar a velocidade de coleta de dados, isso deve ser automatizado no futuro.
Devido à morfologia do cristal, em alguns casos pode ocorrer uma orientação preferencial. Foi por exemplo o caso com o dataset tioredoxina, onde os cristais tinham uma orientação fortemente preferencial em relação ao windows chip. Até aqui, nós poderia coletar um conjunto de dados completo de difração. Se os cristais apresentam uma orientação preferencial no chip, e em particular se o correspondente grupo de espaço também tem uma baixa simetria, então a integralidade do conjunto de dados deve ser monitorada durante a coleta de tal que seja suficiente cana de padrões de difração coletados.
Estudos de tempo-resolvido utilizando esses chips são diretamente possíveis quando usar luz induziu reações com uma abordagem de bomba-sonda. A transmissão de luz de folha de poliimida para o laser da bomba precisa ser elucidado e Alternativamente, opticamente clara poliimida ou COC poderia ser usado. As geometrias microfluidic atual não permite substrato misturando experiências após os cristais são cultivados. No entanto, esperamos que o protocolo de fabricação de chip raio x descrito também ser adequado para tal mistura desenhos para ambos difração de raios x tempo-resolvido bem como espalhamento abordagens19.

Conhecer a estrutura 3D de uma proteína é essencial para compreender a sua funcionalidade. Estruturas de resolução atômica perto até agora são mais comumente obtidas por cristalografia de raios x. Esta técnica apresenta cristais de proteína à radiação de raios-x e os padrões de difração resultantes são então analisados para refinamento e determinação da estrutura. No tradicional cristalografia de raios x, um conjunto de dados completo de difração é gravado de um cristal único, idealmente grande, em temperaturas criogênicas. Tais cristais, no entanto, em sua maioria não são triviais para crescer, e identificar as condições de crio-preservação adequada pode se tornar um desafio em si mesmo e às vezes também pode causar desvios da estrutura nativa da proteína5.
Recentes avanços tecnológicos em laser de elétrons livres de raio-x (FEL) e de luz síncroton síncrotron permitiram resolver estruturas de cristais menores, como de luz síncroton novos microfoco, brilho do feixe maior raio-x e detectores de raio x melhorados tornou-se disponível6,7. Normalmente, pequenos cristais são mais fáceis de crescer do que grande e cristais livre8,9de defeitos. No entanto, pequenos cristais sofrem danos de radiação de raios-x muito mais rápido do que grandes cristais. Isto é porque em comparação com um grande cristal, uma dose maior de raios-x deve ser projectada em um menor volume de cristal para difração a resolução comparável. Portanto, proteção até criogênica muitas vezes não é suficiente para gravar um conjunto de dados de difração completa de um único microcrystal.
Para superar este obstáculo, cristalografia serial tornou-se o método de escolha para coletar e mesclar os padrões de difração de muitos microcristais aleatoriamente orientados para obter um conjunto de dados completo. Radiação dano induzido cristal é minimizado, espalhando a dose total de raio-x usado para resolver uma estrutura de proteína sobre um elevado número de cristais5,10. Em um ' difração antes que destruam ' FEL experimento, cada cristal é usado apenas para uma exposição usando pulsos de raio-x da femto segundos. Beamlines microfoco em fontes de síncrotron terceiros geração, por sua vez, pode executar serial cristalografia com alguns milissegundos curto raio x exposições11,12,13,14. Sem uma oscilação do cristal ou rotação durante a coleta de dados, no entanto, apenas reflexões de Bragg parciais podem ser gravados e, portanto, dezenas de milhares ou mais padrões de difração são normalmente necessários para a determinação de estrutura15. Até à data, foi desenvolvido um conjunto diversificado de métodos de entrega da amostra para cristalografia serial, como recentemente revisto14,16,17,18,19. Entre aqueles, vários fixo-alvo com base em entrega de amostra estratégias com êxito foram combinadas com rotação de cristal durante exposições de raios-x, tal que significativamente menos padrões de difração podem fornecer igualmente datasets completa enquanto também consome menos amostra em relação a cristalografia série clássica experimentos onde imagens ainda são gravadas7,16,20,21,22,23 , 24.
Apresentamos um protocolo para fabricar dispositivos microfluídicos com baixo fundo de raio-x. Os dispositivos são padronizados de cola epóxi 5-min usando litografia macia e são adequados para experimentos de difração de raios x in situ à temperatura que se beneficiam de integrar a preparação da amostra diretamente a afinação de raio-x, conforme o caso, com estudos de tempo-resolvido que seguem induzida pela mistura cinética18,19. Canais microfluídicos são pálpebras de ambos os lados com folha de poliimida poliméricos, resultando em windows de raio-x com uma espessura combinada de cerca de 16 µm que permitem a baixa imagem de plano de fundo do raio x. Todos os materiais utilizados proporcionam boa resistência solvente. Este método de fabricação é comparativamente simples e barato. Após a aquisição de um wafer de mestre SU-8, todos de fabricação pode ser concluída fora de uma sala limpa em uma configuração de laboratório de pesquisa típico.
Um exemplo de aplicativo, descrevemos fichas para goniômetro baseado cristalografia serial alvo fixo. Em primeiro lugar, as considerações de design e fabricação para usando válvulas capilar para microfluidically dividir uma reação aquosa em um número selecionado de nanolitros tamanho gotículas são discutidas. Este mecanismo de carregamento evita a perda de amostra de mortos-volume do canal e divisão pode facilmente ser executada manualmente sem o uso de bombas ou outros equipamentos para atuação de fluido. Tais nanolitros isolado tamanho gotas de solução de proteína são monitorados em situ usando Difusão dinâmica da luz (DLS) para controle da proteína cristal nucleação e crescimento. Anteriormente foi demonstrado que as medições de DLS podem ser executadas em dispositivos microfluídicos, consistindo de uma estrutura de polidimetilsiloxano (PDMS) ligada a um slide de vidro25,26. Porque a camada de poliimida tem uma transmissão elevada para comprimentos de onda mais de 550 nm, a abordagem pode ser estendida para medições em fichas transparentes de raio-x, bem como, quando usando um comprimento de onda de laser apropriado27,28. Baseado nos resultados DLS, nucleação inicial pode ser observada, e mais evaporação de gotículas pode ser interrompida para obter cristais de proteína menos, mas maior.
Depois de suficientes cristais são cultivadas, conjuntos de dados de difração de raio-x completo então podem ser coletados utilizando goniômetro baseado em situ fixada alvo serial cristalografia de raios x em temperatura ambiente. Conjuntos de dados de difração são processados usando um conjunto de ferramentas de software e scripts personalizados para resolver a estrutura de cristal da proteína. Esta técnica evita artefatos frequentemente induzidos durante a crio-preservação usado em experimentos de cristalografia convencional.
Comparamos três estruturas de destino de proteína que foram resolvidas usando aproximadamente 10-20 µm pequenos cristais crescidos no chip para melhor então 2 resolução Å. Por cristalização e diffracting em situ, manuseio e, portanto, mecânica distúrbios de cristais frágil é minimizado. Este protocolo pode ser aplicado para cristais de proteína que difração de alta resolução, bem como de baixa resolução (1,7 Å de 3.0 Å). Como quase todos os cristais podem ser usados para difração, pequena amostra é desperdiçada, tornando este um método de entrega de cristal muito eficiente.
Este protocolo fornece um guia detalhado sobre como preparar chips microfluídicos transparente de raio-x em situ proteína cristalização e difração de recolha de dados. O procedimento foi cuidadosamente projetado para beneficiar microfluidic precisão sem a necessidade de equipamentos sofisticados no laboratório. Também, coleta de dados para a trajetória de síncrotron pode ser realizada sem a necessidade de um goniômetro especializado ou umidificador para facilitar a reprodução dos resultados por não-especialistas. A técnica apresentada pode ser aplicada para serial milissegundo cristalografia coleção de dados em temperatura mantendo os danos de radiação mínima e sem a introdução de estresse para os cristais após crescimento por manipulação de cryo-proteção ou cristal. Portanto, o método descrito é adequado para qualquer projeto de cristalização de proteínas.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Series</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Epoxy glue</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silicone</td></tr><tr><td>Kapton foil</td><td>Dupont/ American Durafilm</td><td>HN grade, gauge 30 (7.5 &amp;mu;m)</td><td>polyimide foil</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop fluoropolymer coating</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-solvent</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Fluorinated oil</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD Software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Photo mask</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 inch wafer</td><td>University Wafer</td><td></td><td>Silicon wafer</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>S&amp;Uuml;SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Mask aligner</td></tr><tr><td>PDMS mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plasma machine</td><td>Diener electronic</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Glucose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Tartrate</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SPG buffer</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &amp;micro;m filter</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td></tr><tr><td>Syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock Tip</td></tr><tr><td>Needle&amp;nbsp;</td><td>Terumo Agani Needle</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8&quot;</td></tr></tbody></table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Este protocolo descreve a fabricação dispositivos microfluídicos com baixo fundo de raio-x, otimizado para goniômetro baseado cristalografia serial alvo fixo. Os dispositivos são padronizados de cola epóxi usando litografia macia e são adequados para em situ experimentos de difração de raios x em temperatura ambiente. Os poços da amostra são pálpebras de ambos os lados com janelas de folha de poliimida poliméricos que permitem a coleta de dados de difração com baixo fundo de raio-x. Este método de fabricação é pouco exigente e barato. Após a aquisição de um wafer de mestre SU-8, todos de fabricação pode ser concluída fora de uma sala limpa em um ambiente de laboratório de pesquisa típico. O protocolo de projeto e fabricação de chip utilizam válvulas capilar para dividir uma reação aquosa em gotículas de nanolitros definido tamanho de microfluidically. Este mecanismo de carregamento evita a perda de amostra de mortos-volume do canal e pode facilmente ser executado manualmente sem o uso de bombas ou outros equipamentos para atuação de fluido. Descrevemos como isolado de nanolitros de tamanho de gotas de solução de proteína pode ser monitorado em situ pela luz dinâmica dispersando a nucleação de cristais de proteína de controle e crescimento. Depois de cristais apropriados são cultivadas, conjuntos de dados de difração de raio-x completo podem ser coletados usando goniômetro baseado em situ fixada alvo serial cristalografia de raios x em temperatura ambiente. O protocolo fornece scripts personalizados para processar difração de conjuntos de dados utilizando um conjunto de ferramentas de software para resolver e refinar a estrutura de cristal da proteína. Essa abordagem evita os artefatos possivelmente induzidos durante a crio-preservação ou cristal manual em experimentos de cristalografia convencional de manipulação. Apresentar e comparar três estruturas de proteína que foram resolvidas usando pequenos cristais com dimensões de aproximadamente 10-20 µm crescido no chip. Por cristalização e diffracting em situ, manuseio e, portanto, mecânica distúrbios de cristais frágil é minimizado. O protocolo detalha como fabricar um chip personalizado radiografia microfluidic transparente adequado para em situ serial cristalografia. Como quase todos os cristais podem ser usados para coleta de dados de difração, esses chips microfluídicos são um método de entrega de cristal muito eficiente.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Este protocolo descreve em detalhes como fabricar e operar dispositivos microfluídicos para coleta de dados de difração de raios x em temperatura ambiente. Além disso, descreve como monitorar a cristalização de proteínas por difusão dinâmica da luz e como processar e analisar obtidos dados de difração.

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

microfluidic-chips-for-situ-crystal-x-ray-diffraction-situ-dynamic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Química

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Bioquímica

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

Difração de raios-X em Ciência da Conservação: Rumo a rotina determinação da estrutura cristalina de corrosão produtos na arte Heritage Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. The DAC program at 13-BM-C is part of the Partnership for Extreme Xtallography (PX^2) project. BX-90 type DACs with conical-type diamond anvils and backing plates are recommended for these experiments. The sample chamber should be loaded with noble gas to maintain a hydrostatic pressure environment. The sample is aligned to the rotation center of the diffraction goniometer. The MARCCD area detector is calibrated with a powder diffraction pattern from LaB6. The sample diffraction peaks are analyzed with the ATREX software program, and are then indexed with the RSV software program. RSV is used to refine the UB matrix of the single crystal, and with this information and the peak prediction function, more diffraction peaks can be located. Representative single crystal diffraction data from an omphacite (Ca0.51Na0.48)(Mg0.44Al0.44Fe2+0.14Fe3+0.02)Si2O6 sample were collected. Analysis of the data gave a monoclinic lattice with P2/n space group at 0.35 GPa, and the lattice parameters were found to be: a = 9.496 &#177;0.006 &#197;, b = 8.761 &#177;0.004 &#197;, c = 5.248 &#177;0.001 &#197;, &#946; = 105.06 &#177;0.03&#186;, &#945; = &#947; = 90&#186;.

In this report, we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. ATREX and RSV programs are used to analyze the data.

Alta Pressão Único Difração de Cristal no PX ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. A prerequisite for the method is that highly ordered crystalline specimen need to be grown from the macromolecule to be studied, which then need to be prepared for the diffraction experiment. This preparation procedure typically involves removal of the crystal from the solution, in which it was grown, soaking of the crystal in ligand solution or cryo-protectant solution and then immobilizing the crystal on a mount suitable for the experiment. A serious problem for this procedure is that macromolecular crystals are often mechanically unstable and rather fragile. Consequently, the handling of such fragile crystals can easily become a bottleneck in a structure determination attempt. Any mechanical force applied to such delicate crystals may disturb the regular packing of the molecules and may lead to a loss of diffraction power of the crystals. Here, we present a novel all-in-one sample holder, which has been developed in order to minimize the handling steps of crystals and hence to maximize the success rate of the structure determination experiment. The sample holder supports the setup of crystal drops by replacing the commonly used microscope cover slips. Further, it allows in-place crystal manipulation such as ligand soaking, cryo-protection and complex formation without any opening of the crystallization cavity and without crystal handling. Finally, the sample holder has been designed in order to enable the collection of in situ X-ray diffraction data at both, ambient and cryogenic temperature. By using this sample holder, the chances to damage the crystal on its way from crystallization to diffraction data collection are considerably reduced since direct crystal handling is no longer required.

A novel sample holder for macromolecular X-ray crystallography along with a suitable handling protocol is presented. The system allows crystal growth, crystal soaking and in situ diffraction data collection at both, ambient and cryogenic temperature without the need of any crystal manipulation or mounting.

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Bioengenharia

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder microdiffraction two-dimensional (2D) maps at beamline 12.3.2 of the Advanced Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Measurements can be performed on any sample that is less than 10 cm x 10 cm x 5 cm, with a flat exposed surface. The experimental geometry is calibrated using standard materials (elemental standards for XRF, and crystalline samples such as Si, quartz, or Al2O3 for diffraction). Samples are aligned to the focal point of the x-ray microbeam, and raster scans are performed, where each pixel of a map corresponds to one measurement, e.g., one XRF spectrum or one diffraction pattern. The data are then processed using the in-house developed software XMAS, which outputs text files, where each row corresponds to a pixel position. Representative data from moissanite and an olive snail shell are presented to demonstrate data quality, collection, and analysis strategies.

We describe a beamline setup meant to carry out rapid two-dimensional x-ray fluorescence and x-ray microdiffraction mapping of single crystal or powder samples using either Laue (polychromatic radiation) or powder (monochromatic radiation) diffraction. The resulting maps give information about strain, orientation, phase distribution, and plastic deformation.

Síncrotron Microdiffraction de raio-x e imagem latente de fluorescência das amostras de rocha e minerais

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Engenharia

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

Cristalização de proteínas no chip por microdiálise para estudos de difração de raios-X in situ

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

Cristalização no chip e difração serial em larga escala à temperatura ambiente

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

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