Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Fonds de semence PIER PIF-2015-46, le BMBF accorde 05K16GUA et 05K12GU3 et le cluster d’excellence « Le Centre de Hambourg pour imagerie ultrarapide – Structure, dynamique et contrôle de la matière à l’échelle atomique » de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Le travail des auteurs affiliés ainsi qu’avec le Centre pour la Science de Laser d’électrons libres a été financé par l’Association Helmholtz, par le biais de fonds destinés aux programmes orientés. Les données de MX de synchrotron ont été collectées au beamline P14 exploité par EMBL Hamburg à l’anneau de stockage de PETRA III (DESY, Hambourg, Allemagne).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous fabriquons des dispositifs microfluidiques pour in situ la diffraction des rayons x par la structuration de la résine époxy comme matériau et polyimide aluminium comme matériau de fenêtre de remplissage. Notre procédure optimisée différentes étapes de la fabrication au cours de la précédente aux rayons x puce dessins16,21. Nous avons réduit l’épaisseur de la fenêtre et ainsi l’arrière-plan tout en facilitant également fabrication de diffusion comme moins d’étapes sont nécessaires. in situ la cristallisation en utilisant le protocole décrit a des avantages substantiels. Il permet la collecte de données de diffraction à température ambiante et exclut ainsi la nécessité de la protection de cryo, qui, dans certains cas, contient le risque d’introduire des objets dans la structure des protéines. Par ailleurs, les cristaux ne sont pas soumis à un stress physique, parce que le transfert des cristaux de leur environnement natif peut être évité. Par le biais de cette procédure, les cristaux de maintiennent leur qualité et ne souffrent d’aucun traitement.
Dans notre expérience, les étapes plus critiques au sein du protocole tournent autour de contrôler le processus de cristallisation. Les paramètres afin d’obtenir des cristaux adaptés aux rayons x aux dimensions appropriées doivent être déterminés de façon empirique et ne peuvent être prises directement depuis les expériences de diffusion de vapeur. En utilisant des concentrations de protéines et précipitant identiques n’a pas toujours abouti dans les cristaux dans différentes puces, ou parfois dans les différents puits au sein de la même puce. Ceci indique que tous les facteurs qui influencent la croissance et la nucléation des cristaux devraient être considérés avec précaution, comme la cinétique de composition ou de cristallisation de liqueur mère (à travers la trajectoire de l’évaporation). Comme cristaux plus grands diffracter à une résolution plus élevée, suffisamment gros cristaux est idéalement passées. Le processus de nucléation de cristal et de la croissance peut être suivi avec des mesures de DLS. Focaliser le laser à l’intérieur de la ~ 50 µm compartiments de cristallisation fine de la puce peuvent être difficiles et peuvent nécessiter un alignement manuel soigné. À l’aide de puits plus profonds que 100 µm, laser auto-alignement était faisable et fiable, tel que plusieurs puits pourraient être surveillés par des systèmes automatisés d’acquisition.
Les puces de rayons x de polyimide basé produisent seulement un faible bruit de fond et nous démontrer l’adéquation de ces dispositifs pour la routine de collecte de données de diffraction des rayons x en résolvant les structures de trois protéines de modèle. La meilleure résolution obtenue dans puce différente, comparée à celle des résolutions précédemment obtenues, significativement plus grands cristaux de protéines et de collecte de données de radiographie conventionnelle. Cela pourrait être dû à plusieurs facteurs et optimisation de condition de cristallisation peut améliorer encore davantage la diffraction. Il a été possible de recueillir sur place des données de diffraction jusqu'à une résolution 1,8 Å application crystal avec dimensions inférieure à 30 µm. L’analyse détaillée des données de diffraction thaumatine fourni des renseignements sur les dommages de rayonnement. Pour limiter l’extension des dommages de rayonnement, qu’un seul cristal unique devrait être exposé chaque compartiment dans le dispositif microfluidique, car la diffusion des radicaux à et dans les cristaux voisins peut se produire. Pour améliorer la vitesse de collecte de données, ceci devrait être automatisé à l’avenir.
En raison de la morphologie des cristaux, dans certains cas une orientation préférentielle peut se produire. Par exemple, c’était le cas avec le dataset thiorédoxine, où les cristaux ont une orientation fortement privilégiée par rapport à des fenêtres de la puce. Même ici, nous pourrions recueillir un ensemble de données complet de diffraction. Si les cristaux présentent une orientation préférentielle dans la puce, et en particulier si le groupe d’espace correspondant a aussi une symétrie faible, puis l’intégralité de l’objet dataset doit être surveillée lors de la collecte que soit suffisamment canne de motifs de diffraction recueillies.
Études de résolution temporelle à l’aide de ces puces sont directement possibles quand utilisant la lumière induit des réactions avec une approche de la pompe-sonde. La transmission lumineuse de polyimide clinquant pour le laser de pompe doit être élucidé et alternativement, optiquement clair polyimide ou COC pourrait être utilisé. Les géométries de microfluidique actuelle ne permettent pas de mixage expériences après que les cristaux croissent de substrat. Toutefois, nous espérons que le protocole de fabrication de puce aux rayons x décrit également convenir pour ces dessins pour les deux diffraction des rayons x résolue dans le temps de mélange ainsi que diffusion des approches19.

Il est essentiel de comprendre sa fonctionnalité de connaître la structure 3D d’une protéine. Résolution atomique près de structures sont jusqu'à présent plus souvent obtenues par cristallographie aux rayons x. Cette technique expose des cristaux de protéine à rayons x et les patrons de diffraction qui en résultent sont ensuite analysées pour le raffinement et la détermination de la structure. En diffraction traditionnel, un ensemble de données complet de diffraction est rapporté d’un cristal unique, idéalement large, à des températures cryogéniques. Ces cristaux, cependant, n’est généralement pas trivial de croître, et les conditions de la cryo-préservation appropriée peut devenir difficile en soi et peut parfois également provoquer des déviations par rapport à la structure de la protéine native5.
Laser à électrons libres aux rayons x (FEL) et les faisceaux de rayonnement synchrotron, les progrès technologiques récents ont permis de résoudre les structures des cristaux plus petits, comme nouveaux faisceaux micro-focalisation, accrue aux rayons x des rondins brilliance et amélioration des détecteurs de rayons x est devenu disponible6,7. En général, les petits cristaux est plus faciles à poussent plus grandes et défauts des cristaux libres8,9. Cependant, les petits cristaux souffre de radiolésions radiographie beaucoup plus rapide que de grands cristaux. C’est parce que par rapport à un gros cristal, une plus forte dose de rayons x doit être projetée dans un plus petit volume de cristal à diffracter à résolution comparable. Par conséquent, protection même cryogénique n’est souvent pas suffisante pour enregistrer un ensemble de données complet de diffraction d’un nom unique.
Pour surmonter cet obstacle, cristallographie de la série est devenue la méthode de choix pour collecter et fusionner des patrons de diffraction de nombreux microcristaux orientés au hasard pour obtenir un ensemble de données complet. Les rayons des dommages induits crystal sont minimisé en répartissant la dose totale de rayons x utilisés pour résoudre une structure protéique au cours d’un grand nombre de cristaux5,10. Dans un ' diffracter auparavant détruire ' FEL expérimenter, chaque cristal est utilisé uniquement pour une exposition à l’aide d’impulsions de rayons x de femto-seconde. Micro-focus faisceaux à des sources de rayonnement synchrotron troisième génération à son tour peut effectuer cristallographie série avec quelques millisecondes court13,de12,de11,avec des rayons x d’expositions14. Sans une oscillation de cristal ou de rotation au cours de la collecte de données, cependant, seulement des réflexions de Bragg partielles peuvent être enregistrées et donc des dizaines de milliers ou plusieurs patrons de diffraction sont normalement exigées pour la détermination de structure15. A ce jour, un éventail de méthodes de livraison des échantillons a été développé pour la série cristallographie, comme récemment révisé14,16,17,18,19. Parmi ceux, plusieurs cibles fixes basée livraison d’échantillon stratégies ont été combinées avec succès avec rotation de cristal au cours d’expositions aux rayons x telle que significativement moins patrons de diffraction peuvent fournir également des ensembles de données complets tout en également consommer moins échantillon par rapport à la cristallographie série classique expériences où les images fixes sont enregistrement7,16,20,21,22,23 , 24.
Nous présentons un protocole visant à fabriquer des dispositifs microfluidiques avec faible bruit de fond des rayons x. Les dispositifs sont inspire de la colle époxy 5 min à l’aide de lithographie douce et conviennent pour des expériences de diffraction des rayons x in situ à la température ambiante qui profitent de l’intégration de la préparation des échantillons directement dans la mise en place des rayons x, selon le cas avec résolution temporelle des études qui suivent cinétique induite par le mélange18,19. Canaux microfluidiques est balconnet sur les deux côtés avec une feuille de polymère polyimide, résultant dans windows x-ray avec une épaisseur combinée d’environ 16 µm qui permettent pour l’imagerie de fond faible aux rayons x. Tous les matériaux utilisés fournissent la bonne résistance aux solvant. Cette méthode de fabrication est relativement simple et peu coûteuse. Après l’approvisionnement d’une plaquette de maître SU-8, tous de fabrication peut être complétée à l’extérieur de la salle blanche dans un laboratoire recherche typique.
Dans un exemple d’application, nous décrivons puces pour goniomètre basé cible fixe série cristallographie. Tout d’abord, les considérations de conception et fabrication pour l’utilisation de valves capillaire à microfluidically diviser une réaction aqueuse dans un certain nombre de gouttelettes nanolitres de taille sont discutées. Ce mécanisme de chargement permet d’éviter la perte d’échantillon de morts-volume du canal et fractionnement peut facilement être effectué manuellement sans l’aide de pompes ou autres équipements pour actionnement fluide. Ces gouttes isolées nanolitres taille de solution protéique sont surveillés in situ à l’aide de diffusion dynamique de la lumière (DLS) contrôle protéine crystal nucléation et croissance. Il a été précédemment démontré que DLS mesures peuvent être réalisées dans les dispositifs microfluidiques consistant en une structure de polydiméthylsiloxane (PDMS) collée sur un verre diapositive25,26. Parce que la couche de polyimide a une forte transmission de longueurs d’onde plus de 550 nm, l’approche peut être étendue aux Mensurations en jetons transparents de radiographie ainsi, lorsque vous utilisez un de27,de longueur d’onde laser approprié28. Basé sur les résultats DLS, nucléation initiale peut être observée, et autre évaporation goutte peut être arrêtée pour obtenir des cristaux de protéines moins nombreux mais plus gros.
Après que suffisamment de cristaux est cultivés, ensembles de données complets de diffraction des rayons x peuvent ensuite être collectées à l’aide de goniomètre basé sur place fixée cible série diffraction à température ambiante. Ensembles de données de diffraction sont traitées à l’aide d’une suite d’outils logiciels et des scripts personnalisés pour résoudre la structure cristalline de protéine. Cette technique évite les objets souvent induites au cours de la cryo-préservation utilisée dans des expériences de diffraction conventionnelle.
Nous comparons trois structures de protéine cible qui ont été résolus en utilisant environ 10 à 20 µm petits cristaux cultivés dans la puce au mieux puis 2 résolution Å. Par cristallisation et diffractant in situ, manipulation et donc mécanique des perturbations des cristaux fragiles est réduit au minimum. Ce protocole peut être appliqué pour des cristaux de protéines qui diffracter à haute résolution ainsi que la faible résolution (1,7 Å à 3,0 Å). Comme presque chaque cristal peut être utilisé pour la diffraction, petit échantillon est gaspillée, ce qui en fait une méthode de livraison de cristal très efficace.
Ce protocole prévoit un guide détaillé sur comment préparer les puces microfluidiques transparent aux rayons x en situ protéine cristallisation et diffraction de collecte de données. La procédure a été soigneusement conçue pour bénéficier de microfluidique précision sans nécessiter des équipements sophistiqués dans le laboratoire. En outre, la collecte de données à la source de rayonnement synchrotron peut être effectuée sans nécessiter un goniomètre spécialisé ou un humidificateur pour faciliter la reproduction des résultats par des non-spécialistes. La technique présentée peut être appliquée milliseconde série cristallographie collecte de données à température ambiante tout en gardant les radiolésions minime et sans introduire de stress aux cristaux après une croissance de manutention cryo-protection ou cristal. Par conséquent, la méthode décrite est adaptée pour tout projet de cristallisation de protéines.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Series</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Developer</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Solvent</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Epoxy glue</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silicone</td></tr><tr><td>Kapton foil</td><td>Dupont/ American Durafilm</td><td>HN grade, gauge 30 (7.5 &amp;mu;m)</td><td>polyimide foil</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop fluoropolymer coating</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-solvent</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Fluorinated oil</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD Software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Photo mask</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 inch wafer</td><td>University Wafer</td><td></td><td>Silicon wafer</td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>S&amp;Uuml;SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Mask aligner</td></tr><tr><td>PDMS mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plasma machine</td><td>Diener electronic</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Glucose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Protein</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Tartrate</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Ammonium Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SPG buffer</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS Instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D printer</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &amp;micro;m filter</td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td></tr><tr><td>Syringes&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock Tip</td></tr><tr><td>Needle&amp;nbsp;</td><td>Terumo Agani Needle</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8&quot;</td></tr></tbody></table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Ce protocole décrit la fabrication des dispositifs microfluidiques avec faible bruit de fond des rayons x optimisé pour goniomètre basé cible fixe série cristallographie. Les dispositifs sont inspire de la colle époxy à l’aide de lithographie douce et conviennent pour des expériences in situ de diffraction des rayons x à température ambiante. Les puits d’échantillon sont balconnet sur deux côtés avec fenêtres de feuille polymérique polyimide qui permettent la collecte de données de diffraction avec faible bruit de fond des rayons x. Cette méthode de fabrication est peu exigeant et peu coûteux. Après l’approvisionnement d’une plaquette de maître SU-8, tous de fabrication peut être complétée à l’extérieur de la salle blanche dans un environnement de laboratoire de recherche typique. Le protocole de conception et fabrication de puce utiliser robinetterie capillaire à microfluidically diviser une réaction aqueuse définie nanolitres taille goutelettes. Ce mécanisme de chargement permet d’éviter la perte d’échantillon de morts-volume du canal et peut facilement être effectué manuellement sans l’aide de pompes ou autres équipements pour actionnement fluide. Nous décrivons comment isolé nanolitres taille gouttes d’une solution protéique peut être contrôlée in situ de la dynamique de la lumière diffusion contrôle protéine crystal nucléation et croissance. Après que cristaux adaptés est cultivés, diffraction des rayons x complet des ensembles de données peuvent être collectées à l’aide de goniomètre basé sur place fixée cible série diffraction à température ambiante. Le protocole prévoit des scripts personnalisés pour traiter des ensembles de données de diffraction en utilisant une suite d’outils logiciels de résoudre et d’affiner la structure cristalline de protéine. Cette approche évite les objets éventuellement induites lors de cryoconservation ou manuel à cristaux de manutention dans les expériences de diffraction conventionnelle. Nous présentons et comparer trois structures de protéines qui ont été résolus à l’aide de petits cristaux avec des dimensions d’environ 10 à 20 µm, cultivé dans la puce. Par cristallisation et diffractant in situ, manipulation et donc mécanique des perturbations des cristaux fragiles est réduit au minimum. Le protocole détaille comment fabriquer une puce de microfluidique transparent aux rayons x personnalisée adaptée aux in situ série cristallographie. Comme presque chaque cristal peut être utilisé pour la collecte de données de diffraction, ces puces microfluidiques sont une méthode de livraison de cristal très efficace.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Ce protocole décrit en détail comment fabriquer et utiliser des dispositifs microfluidiques pour la collecte de données de diffraction des rayons x à la température ambiante. En outre, il décrit comment contrôler la cristallisation de protéines en diffusion dynamique de la lumière et comment traiter et analyser des données de diffraction a obtenu.

Puces microfluidiques pour diffusion de lumière dynamique Diffraction de rayons x de cristaux In Situ et In Situ pour série cristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

14.6K vues.  DESY. Ce protocole décrit en détail comment fabriquer et utiliser des dispositifs microfluidiques pour la collecte de données de diffraction des rayons x à la température ambiante. En outre, il décrit comment contrôler la cristallisation de protéines en diffusion dynamique de la lumière et comment traiter et analyser des données de diffraction a obtenu.

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

Préparation cellules adhérentes pour fluorescence X-ray Imaging par fixation chimique

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Recherche

Chimie

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to precisely maneuver the nucleation and crystal growth towards desired sizes of protein crystals. The controlled crystallization is based on sample investigation with in situ Dynamic Light Scattering (DLS) while all visual changes in the droplet are monitored online with the help of a microscope coupled to a CCD camera, thus enabling a full investigation of the protein droplet during all stages of crystallization. The use of in situ DLS measurements throughout the entire experiment allows a precise identification of the highly supersaturated protein solution transitioning to a new phase &#8211; the formation of crystal nuclei. By identifying the protein nucleation stage, the crystallization can be optimized from large protein crystals to the production of protein microcrystals. The experimental protocol shows an interactive crystallization approach based on precise automated steps such as precipitant addition, water evaporation for inducing high supersaturation, and sample dilution for slowing induced homogeneous nucleation or reversing phase transitions.

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Here we present a protocol for controlled production of protein microcrystals. The process uses an automated device allowing controlled manipulation of several crystallization parameters. The protein crystallization is carried-out by controlled and automated addition of crystallization solutions while monitoring and investigating the radius distribution of particles in the crystallization droplet.

Des cristaux de protéine croissante avec des Dimensions distinctes à l’aide d’automatisé cristallisation couplée avec In Situ diffusion dynamique de la lumière

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Biochimie

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

X-ray Powder Diffraction en science de la conservation: Vers Routine structure cristalline Détermination des produits de corrosion sur l&#39;art du patrimoine Objets

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. The DAC program at 13-BM-C is part of the Partnership for Extreme Xtallography (PX^2) project. BX-90 type DACs with conical-type diamond anvils and backing plates are recommended for these experiments. The sample chamber should be loaded with noble gas to maintain a hydrostatic pressure environment. The sample is aligned to the rotation center of the diffraction goniometer. The MARCCD area detector is calibrated with a powder diffraction pattern from LaB6. The sample diffraction peaks are analyzed with the ATREX software program, and are then indexed with the RSV software program. RSV is used to refine the UB matrix of the single crystal, and with this information and the peak prediction function, more diffraction peaks can be located. Representative single crystal diffraction data from an omphacite (Ca0.51Na0.48)(Mg0.44Al0.44Fe2+0.14Fe3+0.02)Si2O6 sample were collected. Analysis of the data gave a monoclinic lattice with P2/n space group at 0.35 GPa, and the lattice parameters were found to be: a = 9.496 &#177;0.006 &#197;, b = 8.761 &#177;0.004 &#197;, c = 5.248 &#177;0.001 &#197;, &#946; = 105.06 &#177;0.03&#186;, &#945; = &#947; = 90&#186;.

In this report, we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell at the GSECARS 13-BM-C beamline at the Advanced Photon Source. ATREX and RSV programs are used to analyze the data.

High Pressure Monocristal Diffraction PX ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. A prerequisite for the method is that highly ordered crystalline specimen need to be grown from the macromolecule to be studied, which then need to be prepared for the diffraction experiment. This preparation procedure typically involves removal of the crystal from the solution, in which it was grown, soaking of the crystal in ligand solution or cryo-protectant solution and then immobilizing the crystal on a mount suitable for the experiment. A serious problem for this procedure is that macromolecular crystals are often mechanically unstable and rather fragile. Consequently, the handling of such fragile crystals can easily become a bottleneck in a structure determination attempt. Any mechanical force applied to such delicate crystals may disturb the regular packing of the molecules and may lead to a loss of diffraction power of the crystals. Here, we present a novel all-in-one sample holder, which has been developed in order to minimize the handling steps of crystals and hence to maximize the success rate of the structure determination experiment. The sample holder supports the setup of crystal drops by replacing the commonly used microscope cover slips. Further, it allows in-place crystal manipulation such as ligand soaking, cryo-protection and complex formation without any opening of the crystallization cavity and without crystal handling. Finally, the sample holder has been designed in order to enable the collection of in situ X-ray diffraction data at both, ambient and cryogenic temperature. By using this sample holder, the chances to damage the crystal on its way from crystallization to diffraction data collection are considerably reduced since direct crystal handling is no longer required.

A novel sample holder for macromolecular X-ray crystallography along with a suitable handling protocol is presented. The system allows crystal growth, crystal soaking and in situ diffraction data collection at both, ambient and cryogenic temperature without the need of any crystal manipulation or mounting.

Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Une puce microfluidique pour ICPMS Présentation échantillon

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Bio-ingénierie

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder microdiffraction two-dimensional (2D) maps at beamline 12.3.2 of the Advanced Light Source (ALS), Lawrence Berkeley National Laboratory. Measurements can be performed on any sample that is less than 10 cm x 10 cm x 5 cm, with a flat exposed surface. The experimental geometry is calibrated using standard materials (elemental standards for XRF, and crystalline samples such as Si, quartz, or Al2O3 for diffraction). Samples are aligned to the focal point of the x-ray microbeam, and raster scans are performed, where each pixel of a map corresponds to one measurement, e.g., one XRF spectrum or one diffraction pattern. The data are then processed using the in-house developed software XMAS, which outputs text files, where each row corresponds to a pixel position. Representative data from moissanite and an olive snail shell are presented to demonstrate data quality, collection, and analysis strategies.

We describe a beamline setup meant to carry out rapid two-dimensional x-ray fluorescence and x-ray microdiffraction mapping of single crystal or powder samples using either Laue (polychromatic radiation) or powder (monochromatic radiation) diffraction. The resulting maps give information about strain, orientation, phase distribution, and plastic deformation.

Microdiffraction de rayon x de synchrotron et imagerie de Fluorescence des échantillons de roches et de minéraux

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Ingénierie

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We describe a versatile microfluidic chip that enables the production of crystals by the efficient method of counter-diffusion. The convection-free environment provided by the microfluidic channels is ideal for crystal growth and useful to diffuse a substrate into the active site of the crystalline enzyme. Here we applied this approach to the CCA-adding enzyme of the psychrophilic bacterium Planococcus halocryophilus in the presented example. After crystallization and substrate diffusion/soaking, the crystal structure of the enzyme:substrate complex was determined at room temperature by serial crystallography and the analysis of multiple crystals directly inside the chip. The whole procedure preserves the genuine diffraction properties of the samples because it requires no crystal handling.

A versatile microfluidic device is described that enables the crystallization of an enzyme using the counter-diffusion method, the introduction of a substrate in the crystals by soaking, and the 3D structure determination of the enzyme:substrate complex by a serial analysis of crystals inside the chip at room temperature.

Cristallisation et détermination structurale d’une enzyme : complexe de substrat par cristallographie sérielle dans une puce microfluidique polyvalente

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins on-chip with the dialysis method and allowing in situ single-crystal or serial crystallography experiments at room temperature. The protocol details the fabrication process of the microchips, the manipulation of the on-chip crystallization experiments and the treatment of the in situ collected X-ray diffraction data for the structural elucidation of the protein sample. The main feature of this microfabrication procedure lies on the integration of a commercially available, semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane in between two layers of the chip. The molecular weight cut-off of the embedded membrane varies depending on the molecular weight of the macromolecule and the precipitants. The device exploits the advantages of microfluidic technology, such as the use of minute volumes of samples (&#60;1 &#181;L) and fine tuning over transport phenomena. The chip coupled them with the dialysis method, providing precise and reversible control over the crystallization process and can be used for investigating phase diagrams of proteins at the microliter scale. The device is patterned using a photocurable thiolene-based resin with soft imprint lithography on an optically transparent polymeric substrate. Moreover, the background scattering of the materials composing the microchips and generating background noise was evaluated rendering the chip compatible for in situ X-ray diffraction experiments. Once protein crystals are grown on-chip up to an adequate size and population uniformity, the microchips can be directly mounted in front of the X-ray beam with the aid of a 3D printed holder. This approach addresses the challenges rising from the use of cryoprotectants and manual harvesting in conventional protein crystallography experiments through an easy and inexpensive manner. Complete X-ray diffraction data sets from multiple, isomorphous lysozyme crystals grown on-chip were collected at room temperature for structure determination.

Crystallization of Proteins on Chip by Microdialysis for In Situ X-ray Diffraction Studies

This paper details the fabrication protocol of microfluidic chips developed for on-chip protein crystallization with the dialysis method and in situ X-ray diffraction experiments. The microfabrication process makes it possible to integrate a semipermeable regenerated cellulose dialysis membrane with any molecular weight cut-off, between two layers of the chip.

Cristallisation des protéines sur puce par microdialyse pour les études in situ sur la diffraction des rayons X

This protocol describes the manufacturing of reproducible and inexpensive microfluidic devices covering the whole pipeline for crystallizing proteins ...

On-Chip Crystallization and Large-Scale Serial Diffraction at Room Temperature

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since cryogenic temperatures are non-physiological and may prevent, deter, or even alter protein structural dynamics, a robust method for routine X-ray diffraction experiments at room temperature is highly desirable. The crystal-on-crystal device and its accompanying hardware and software used in this protocol are designed to enable in situ X-ray diffraction at room temperature for protein crystals of different sizes without any sample manipulation. Here we present the protocols for the key steps from device assembly, on-chip crystallization, optical scanning, crystal recognition to X-ray shot planning and automated data collection. Since this platform requires no crystal harvesting nor any other sample manipulation, hundreds to thousands of protein crystals grown on chip can be introduced into an X-ray beam in a programmable and high-throughput manner.

This contribution describes how to set up protein crystallization on crystal-on-crystal devices and how to perform automated serial data collection at room temperature using the on-chip crystallization platform.

Cristallisation sur puce et diffraction série à grande échelle à température ambiante

Biochemical reactions and biological processes can be best understood by demonstrating how proteins transition among their functional states. Since ...

Puces microfluidiques pour diffusion de lumière dynamique Diffraction de rayons x de cristaux In Situ et In Situ pour série cristallographie

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