Agradecemos a Clare Prendergast ayuda con editar el manuscrito. DKN es apoyada por una investigación conceder (#2095) de la Fundación Flinn y TM es apoyado por becas de institutos nacionales de salud (R01HL056643 y R01HL092514). DKN desarrolló los métodos, diseñó el estudio y escribió el manuscrito; OM con los estudios en animales y obtención de la muestra clínica; SB asistida con análisis cytometric del flujo y separación celular; TM bajo la supervisión de los estudios y revisaron el manuscrito.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y el Comité uso (IACUC) y la Junta de revisión institucional (IRB) en el Hospital y centro médico de San José.
1. aislamiento de AMs del líquido murino el lavado broncoalveolar (BAL)
<ol><li>Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con preparación almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.</li>
	<li>Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.</li>
	<li>Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.</li>
	<li>Inyectar 10 mL helado tamponada fosfato salino (PBS) en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Absorber el flujo de sangre con almohadillas de algodón absorbente. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y entonces están listos para el lavado.</li>
	<li>Suavemente abrir la piel y del músculo en el cuello para exponer la vía aérea. Suprimir cuidadosamente los músculos adyacentes, cartílagos y tejido graso sin dañar la tráquea.</li>
	<li>Hacer una pequeña incisión (< 2 mm) en la tráquea a la laringe posterior. Esta incisión debe ser lo suficiente como para insertar un catéter en mientras que la tráquea está todavía unida a la laringe. Insertar un catéter de 22G de 1 pulgada sin aguja dentro de la tráquea hacia los pulmones. Asegurar el catéter con una sutura de seda trenzada (4-0; no absorbible) con un nudo cuadrado. Nota: El catéter debe recortarse según el tamaño del ratón. Catéteres muy cortos o largos tienden a tener fugas o romper la vía aérea durante el lavado. Longitud del catéter debe ser tal que cuando introduce completamente los restos de punta bien dentro de la tráquea y no llegar a los bronquios primarios.</li>
	<li>Conecte una jeringa de 1 mL con tampón BAL helada (Ca2 + y Mg2 + libre PBS + 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético, EDTA) con el catéter e infundir lentamente el búfer en los pulmones. Esto inflará los pulmones. Mantenga la jeringa atada catéter durante cinco segundos y luego aspirar el líquido del lavado tirando suavemente el pistón. Esto desinfla los pulmones. Recoger el líquido en un tubo cónico de 15 mL a hielo.</li>
	<li>Repita paso 1.10 para nueve veces más y el líquido del lavado de la piscina. No exceda 1 mL de tampón por descarga, exceda la capacidad del pulmón y provocar su ruptura.</li>
	<li>Eutanasia el ratón con sobredosis de CO2 por protocolo de IACUC aprobado.</li>
	<li>Centrifugar el líquido 10 mL BAL a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células del BAL. PRECAUCIÓN: El pellet puede ser muy pequeño, así que tenga cuidado al aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 100 μL de buffer (PBS + 2% suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) + 1 mM EDTA 25 mM de ácido N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES)) de flujo/clasificación del BAL.</li>
	<li>Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc añadiendo bloques de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.</li>
	<li>Realizar tinción con fluorescencia menos uno (FMO) del anticuerpo y solo mancha controla11,25. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por análisis de citometría de Flujo unicelular software de análisis apropiado (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Aislar AMs por un celular activado por fluorescencia clasificador (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Como alternativa, tipo AMs en 1 mL de tampón de lisis (véase Tabla de materiales) suplementado con 10 μL/mL β-mercaptoetanol para extracción de RNA.</li>
</ol>2. aislamiento de AMs de pulmón de ratón, suspensión unicelular
<ol><li>Anestesiar un ratón C57BL/6 de ocho semanas de edad con ketamina (87,5 mg/kg de peso corporal) y xilacina (12,5 mg/kg de peso corporal) cóctel por medio de una inyección intraperitoneal. Vaya al ratón logra anestesia quirúrgica con pérdida de los reflejos y la relajación de los músculos.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una superficie de disección con la cara ventral hacia arriba. Aplique ungüento veterinario oftálmica en los ojos para prevenir la deshidratación y limpie toda la superficie ventral del ratón con almohadillas con alcohol estéril saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar.</li>
	<li>Montar el ratón con las cuatro patas refrenadas.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad abdominal con las herramientas de micro disección. Debe tener cuidado de abrir tanta área como sea posible sin dañar cualquier órgano visceral o la creación de tejido colgante.</li>
	<li>Cuidadosamente abra la cavidad torácica mediante la incisión lentamente la caja torácica a través del mediastino. Idealmente, la caja torácica puede ser suprimida del lado al lado. Extremo cuidado debe tenerse no lesionar la pleura de los pulmones al abrir la cavidad torácica.</li>
	<li>Localizar la vena cava inferior y hacer una incisión para sangrar el ratón. Use almohadillas de algodón absorbente para absorber sangre.</li>
	<li>Inyectar 10 mL PBS helado en el ventrículo derecho (con jeringa de 10 mL y aguja de 25G) para eliminar las células circulantes de la sangre. Una vez completamente inundada, los pulmones aparecen blanqueados y están listos para la cosecha.</li>
	<li>Diseccionar a los pulmones por cortar la tráquea, vasos sanguíneos y ligamentos en un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de frío medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM). Mantener en hielo hasta el siguiente paso.</li>
	<li>Eutanasia el ratón con sobredosis de CO2 por protocolo de IACUC aprobado.</li>
	<li>Transferir los pulmones perfundidos en una placa de cultivo estéril y libre de pirógenos de 60 mm con 3 mL DMEM. Con ayuda de fórceps de disección embromar hacia fuera de las vías respiratorias y otros materiales de tejido pulmonar no duro, si está presente. Pique el tejido pulmonar con un bisturí para < tamaño 1 mm.</li>
	<li>Añadir 300 μg/mL TL somatométrica y 5 U/mL DNasa I, mezclar mediante pipeteo e incubar a 37° C en una incubadora durante 25 minutos. Mezclar suavemente una vez transfiriendo después de 10 minutos.</li>
	<li>Pasar los pulmones disociados a través de un tamiz de célula μm 100 instalado en un tubo cónico de 50 mL. Use la parte posterior de un émbolo de la jeringa de 1 mL para hacer puré de grumos de células en el filtro. Lavar el filtro con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Centrifugar a 500 x g a 4 ° C durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 20 mL de tampón de lavado.</li>
	<li>Repita los pasos 2.12 y 2.13 dos veces, cambiando el filtro y el tubo cada vez. Previo remojo el filtro en tampón de lavado durante más de cinco minutos aumenta la producción de AM. Preparar suspensión unicelular mediante la adición de 100 μL de buffer para el precipitado de células de flujo/clasificación.</li>
	<li>Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor de Fc al agregar bloque de ratón Fc (clon 2.4G2, 10 μg/mL) y se incuba durante 20 minutos en hielo.</li>
	<li>Realizar coloración junto con FMO y controles solo mancha11,25del anticuerpo. Evaluar el pulmón células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.</li>
	<li>AMs de tipo por un clasificador de célula (véase Tabla de materiales) directamente en ratón 1 mL soy medio de cultivo cuando AMs están destinado a cultivo in vitro o en vivo transferencia de la célula. Por otra parte, clasificar AMs en 1 mL de tampón de lisis con β-mercaptoetanol de 10 μL/mL para la extracción de RNA.</li>
</ol>3. aislamiento de AMs de humano líquido del BAL
<ol><li>Organizar la transferencia del líquido del BAL humano de la clínica al laboratorio a 4 ° C.</li>
	<li>Centrifugar el líquido del BAL (10-50 mL) a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado de células contiene células de BAL11.</li>
	<li>Lavar el precipitado con 20 mL de tampón de lavado (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 2 mM EDTA) y centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Resuspender las células del BAL son en 100 μL de buffer de flujo/clasificación (PBS + 2% de calor inactiva FBS + 1 mM EDTA 25 mM HEPES).</li>
	<li>Bloquear la Unión inespecífica del anticuerpo al receptor Fc agregando bloque Fc humano (clon Fc1.3070, 25 μg/mL) y de incubación en hielo durante 20 minutos.</li>
	<li>Realizar anticuerpos coloración junto con FMO y controles solo mancha11,24. Evaluar el BAL células por un analizador de la célula (véase Tabla de materiales) seguido por unicelular flujo cytometry análisis por software.</li>
	<li>AMs de tipo por un clasificador de células (véase Tabla de materiales) directamente en el medio de cultivo 1 mL humano AM o 1 mL de tampón de lisis suplementado con 10 μL/mL de β-mercaptoetanol.</li>
</ol>4. in vitro cultura de AMs
<ol><li>Siguiendo la clasificación de la célula, recoger las células por centrifugación a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>AMs humanos de resuspender en 1 mL medio de cultivo de humanos AM [Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultivo sobrenadante (como fuente de factor (M-CSF), concentración final de 100 U/mL estimulante de colonias de macrófagos), piruvato de sodio 1 mM, 10 mM de ácido N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic (HEPES) y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional)]. Del mismo modo, resuspender ratón AMs en 1 mL ratón AM medio de cultivo [DMEM suplementado con 10% FBS, 20% L-929 cultura sobrenadante (como una fuente de M-CSF, concentración final de 100 U/mL), 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM HEPES y 1 x penicilina/estreptomicina (opcional )].</li>
	<li>Enumerar el trypan azul excepto células viables por un contador celular y ajustar la concentración de células viables en 1 x 106/ml. Nota: Idealmente, por a 5 x 105 AMs puede ser aislado de líquido del BAL de un ratón macho de 8-10 semanas viejo C57BL/6. La producción de AM de la recopilación de pulmón de ratón es variable y puede ser ligeramente menor que el líquido del BAL del ratón. Rendimiento de AM de líquido del BAL humano depende del volumen del líquido del BAL, el volumen total de solución salina que se utiliza en el lavado y condición clínica del paciente.</li>
	<li>Basado en el rendimiento y la necesidad experimental, las células en portaobjetos de la cámara, platos de cultura o frascos de cultivo de la semilla. Idealmente, la semilla las AMs a 1 x 105/ml con medio de 10 mL en un matraz de cultivo de tejidos T25.</li>
	<li>Incubar las células en una incubadora humidificada de 37 ° C con 5% CO2 ambiente. Nota: AMs crecerá como células adherentes y son de crecimiento extremadamente lento (tiempo de duplicación > 7 días).</li>
	<li>A las 24 horas post siembra, AMs debe ser adherente y no ser separado por un suave cambio de medio de cultivo. Quitarlo del medio por la aspiración de un extremo y llenar con medio fresco, previamente calentado a 37 ° C. Nota: Las células pueden utilizarse ahora para evaluar AM fisiología o los efectos de los estímulos. AMs en diapositivas de la cámara pueden ser convenientemente teñidas con anticuerpos apropiados y son ideales para la visualización microscópica. Para la evaluación de la citometría de flujo, AMs son cosechado por la incubación con no enzimática celular disociación solución.</li>
	<li>Aspire el medio de cultivo y añadir solución de disociación lo suficiente para cubrir la superficie de cultivo (aproximadamente 2 mL por frasco T25) e incube a 37 ° C durante 5-10 minutos. No raspar será necesario, y no se recomienda para raspar las células mecánicamente. Golpee ligeramente los lados, añadir 1-2 mL buffer de flujo/clasificación y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para retirar la mayoría de las células adherentes.</li>
	<li>Estudios de RNA, lyse las células directamente en la placa de cultivo mediante la adición de tampón de lisis.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity.">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells.">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).</li><li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections.">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li><li>MacLean, J. 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A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung.">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection.">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).</li><li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development.">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li><li>Macdonald, D. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection.">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients.">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li><li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

AMs son macrófagos de pulmón-residente de larga vida que pueblan los pulmones comienza al nacer y perdurable sobre la vida entera26. Sus funciones en la fisiología pulmonar Patología de7 y12 y su potencial para predecir de autoinmunidad pulmonar24 han sido reconocidos. Porque AMs tiene una presencia a largo plazo en los pulmones11,27 y participan en la activación ...

El microambiente del pulmón es un ecosistema único complejo con un conducto de aire elaborado y vasculatura. El aire inhalado viaja a través de la tráquea y numerosas ramificaciones de bronquios y bronquiolos antes de llegar a los alvéolos, donde ocurre el intercambio de gases sangre aire. Debido a la interacción directa con la atmósfera, la superficie respiratoria requiere protección contra los efectos potencialmente perjudiciales de partículas en suspensión y contaminantes. Un número de barreras físicas, químicas e inmunológicas protege a los pulmones. En particular, el despliegue de los fagocitos en la superficie respiratoria sirve un sistema importante de primera línea de defensa. Los macrófagos alveolares (AMs) son un tipo de fagocitos reside en el pulmón, y constituyen la inmensa mayoría de la piscina de macrófagos del pulmón. Como su nombre lo indica, AMs se localizan sobre todo a la luz alveolar y se presentan como células sésiles que constantemente muestra la atmósfera ambiente y comunican con el epitelio alveolar1. En estado estacionario los pulmones, más del 95% de los fagocitos en el espacio alveolar son AMs2, cuya composición puede alterar debido a inflamación, infección o exposición crónica a contaminantes.
AMs participan en una amplia gama de funciones que pueden ser locales a los pulmones o de importancia sistémica. Por ejemplo, AMs son esencial en el desarrollo y el óptimo funcionamiento de los pulmones; vigilancia inmune; y la separación de los desechos celulares, invasión de patógenos y partículas inhalado3,4,5,6,7. Agotamiento objetivo del AMs es conocido por afectar la separación de virus respiratorios y bacterias4,8. Además de su papel como los fagocitos y los defensores de una primera línea de la homeostasis pulmonar, AMs se conocen para funcionar como células presentadoras de antígeno en obtención de T de la célula de inmunidad9, potenciando la eficacia de la vacuna intranasal10 y influir en la restricción pulmonar autoinmunidad después de trasplante de pulmón11,12. Deficiencia en la función de AM se ha relacionado con la proteinosis alveolar pulmonar (PAP), una condición que resulta de una mutación genética, malignidad o infección que impide la separación de surfactantes pulmonares13,14. Trasplante de AMs ahora se está estudiando como un enfoque terapéutico para el tratamiento del PAP 15,16.
AMs se sabe que se originan durante la embriogénesis y a persistir en los pulmones durante toda la vida sin sustituidos por circular leucocitos2,17. Aunque, AM es indetectable en los pulmones homeostáticos, diferentes niveles de volumen de AM se han divulgado en ciertas condiciones clínicas, incluyendo infección por el influenza virus4, myeloablative irradiación18, exposición a endotoxinas 19y20de la tercera edad. AMs se cree que uno mismo-renovar vía una baja proliferación17,21, pero algunos estudios recientes afirman que los monocitos pueden dar lugar a una población de22,de macrófagos intravasculares pulmonares23 bajo condiciones experimentales, pero la funcionalidad de estos macrófagos pulmonares recién convertidos todavía tienen que definirse en enfermedades pulmonares. Por otra parte, entender el umbral de estímulo en el contexto de activación de AM es un área potencialmente interesante, como el pulmón trata de conservar un equilibrio entre las señales inflamatorias y los mecanismos inmunoreguladores.
Las alteraciones fisiológicas o patológicas que conducen a la pérdida de regulación inmune están importantes para evaluar en diversos contextos clínicos (p. ej., infecciones respiratorias, enfermedad inflamatoria pulmonar y enfermedad pulmonar fibrótica). Sin embargo, AMs son cada vez más reconocido como indicadores o incluso determinantes de la salud pulmonar11,24. Actualmente, no están disponibles para la recolección, caracterización y mantenimiento AMs de seres humanos y modelos preclínicos murinos protocolos unificados. Falta de un consenso sobre precursores de AM y fenotipos y la ausencia de una metodología detallada han sido la gran barricada en descifrar funciones de AM en la enfermedad y la salud pulmonar. El siguiente protocolo ofrece una identificación definitiva, aislamiento y en vitro cultura estrategia que mucho avanzar en la comprensión del comportamiento de AM y facilitar estudios diagnóstico y terapéuticos orientada a AM.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="910">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Non-enzymatic cell dissociating solution</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">C5789</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puralube Vet Ointment</td>
			<td style="width:223px;">Dechra</td>
			<td>620300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22G Catheter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Terumo Medical Products</td>
			<td>SR-OX2225CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Non-absorbable silk braided suture&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Kent Scientific</td>
			<td>SUT-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Fc block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAria II cell sorter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:220px;">644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine&#160; (Ketathesia)</td>
			<td style="width:223px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:220px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine&#160; (AnaSed)</td>
			<td style="width:223px;">Akorn</td>
			<td style="width:220px;">139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liberase TL&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100&#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Human Fc block</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">HEPES</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">L-929 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC,&#160;CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm culture dish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>CLS3261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">15 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">50 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">FlowJo</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo</td>
			<td>v10.4</td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>147709</td>
			<td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11c (Mouse)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565452</td>
			<td>Clone N418, BV 421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-I-Ab (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>116420</td>
			<td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-F (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-H (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>129605</td>
			<td>Clone 551, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-F4/80 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>123118</td>
			<td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Ly-6C (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>128035</td>
			<td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD64 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>139311</td>
			<td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD24 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>563115</td>
			<td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD103 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>745305</td>
			<td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD317 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>127015</td>
			<td>Clone 927, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CXCR1 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>149029</td>
			<td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>304017</td>
			<td>Clone HI30, AF488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-HLA-DR (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>307618</td>
			<td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD169 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>346008</td>
			<td>Clone 7-239, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD206 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>321106</td>
			<td>Clone 15-2, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD163 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>333612</td>
			<td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages

Los macrófagos alveolares son macrófagos terminalmente diferenciados, residente de pulmón de origen prenatal. Los macrófagos alveolares son únicos en su larga vida y su importante papel en el desarrollo pulmonar y función, así como sus respuestas localizadas del pulmón a la infección y la inflamación. Hasta la fecha, ningún método unificado para la identificación, aislamiento y manejo de los macrófagos alveolares de los seres humanos y ratones existe. Este método es necesario para estudios sobre estas importantes células inmunitarias innatas en varias configuraciones experimentales. El método descrito aquí, que puede ser adoptado fácilmente por cualquier laboratorio, es un enfoque simplificado para cosechar los macrófagos alveolares de lavado broncoalveolar o de tejido pulmonar y mantenimiento in vitro. Porque los macrófagos alveolares se presentan principalmente como células adherentes en los alvéolos, el enfoque de este método es el desalojo antes de la cosecha y la identificación. El pulmón es un órgano altamente vascularizado, y varios tipos de células de origen mieloide y linfoide habitan, interactúan y son influenciados por el microambiente del pulmón. Utilizando el conjunto de marcadores de superficie que se describe aquí, los investigadores pueden fácilmente y sin ambigüedades distinguir los macrófagos alveolares de otros leucocitos y purificarlos para aplicaciones posteriores. El método de cultivo desarrollado en este documento apoya a ambos humanos y ratón macrófagos alveolares para el crecimiento in vitro y es compatible con los estudios celulares y moleculares.

El enfoque de citometría de flujo para identificar ratón AMs se muestra en la figura 1. Esto incluye el análisis de un conjunto mínimo de marcadores de superficie necesarios distinguir AMs de otros fagocitos reside en el pulmón o infiltración pulmonar. Análisis diferencial es necesaria para identificar positivamente a AMs de intersticiales macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, monocitos y macrófagos derivados de monocitos pulmonares que se...

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

23.4K vistas.  St. Joseph's Hospital and Medical Center. Esta comunicación describe modelos murinos para los propósitos experimentales y metodologías para el aislamiento y cultivo de macrófagos alveolares de los seres humanos.

Video: Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Investigación

Inmunología e Infección

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

La evaluación de la actividad anti-fúngica de aislados macrófagos alveolares por microscopía confocal

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Aislamiento de macrófagos peritoneales murinos para llevar a cabo análisis de expresión génica Al Toll-like Receptores Estimulación

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...