Clare Prendergast el yazması düzenleme ile yardım için teşekkür. DKN desteklenmektedir tarafından bir araştırma Flinn Vakfı'ndan (#2095) vermek ve TM Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01HL056643 ve R01HL092514) gelen hibe tarafından desteklenmektedir. DKN yöntemleri geliştirilmiş, çalışma tasarlanmış ve el yazması yazdı; OM hayvan çalışmaları ve klinik örnek ihale ile destekli; SB akış sitometrik çözümlemesi ve hücre sıralama ile destekli; TM çalışmalar denetimli ve el yazması inceledim.

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) ve St Joseph's Hastanesi ve Tıp Merkezi, kurumsal inceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır.
1. yalıtım AMs üzerinden fare Bronchoalveolar lavaj (BAL) sıvı
<ol><li>Bir sekiz haftalık C57BL/6 fare ile ketamin (87,5 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (12.5 mg/kg vücut ağırlığı) mayi bir enjeksiyon kokteyl uyuşturan. Cerrahi anestezi Reflekslerin kaybı ve kas gevşeme ile fare attains devam.</li>
	<li>Fareyi bir diseksiyon yüzeye ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Oftalmik veteriner merhem gözleri su kaybı önlemek ve dezenfekte için % 70 isopropanol ile doymuş steril alkol hazırlık yastıkları ile fare tüm menfez yüzey silmek için uygulayın.</li>
	<li>Fare ölçülü tüm dört ayaklı bağlayın.</li>
	<li>Yavaşça karın boşluğu ile mikro diseksiyon Araçlar'ı açın. Herhangi bir visseral organlara zarar verme ya da çıkıntılı doku oluşturma olmadan mümkün olduğu kadar alan açmak için özen göstermelidir.</li>
	<li>Yavaşça göğüs boşluğuna yavaş yavaş mediasten aracılığıyla göğüs kafesi incising tarafından açın. İdeal olarak, göğüs kafesinin yan tarafına eksize. Aşırı akciğerler plevra göğüs boşluğuna açılırken değil incitmek özen göstermelidir.</li>
	<li>İnferior vena kava bulun ve fare kanamaya bir kesi yapmak. Kan emmek için emici pamuk tamponlarla kullanabilirsiniz.</li>
	<li>10 mL buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) dolaşımdaki kan hücreleri temizlemek için (10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak) sağ ventrikül enjekte. Kan emici pamuklu ped ile akışını emer. Tamamen periosteum sonra akciğerler beyazlatılmış görünür ve sonra lavaj için hazırsınız.</li>
	<li>Nazikçe cildi kesip ve hava yolu ortaya çıkarmak için boyun kas. Dikkatle bitişik kaslar, kıkırdak ve yağlı doku nefes borusu zarar vermeden tüketim.</li>
	<li>Küçük bir kesi yapmak (< 2 mm) gırtlak için posterior Trakea üzerinde. Bu kesik nefes borusu hâlâ gırtlak için bağlı iken bir kateter içine eklemek yeterli olmalıdır. Trake akciğerlere doğru iğne olmadan 1-inç 22 G kateter takın. İpek örgülü dikiş sondayla güvenli (4-0; absorbe olmayan) bir Meydanı düğüm ile. Not: Kateter kesilmiş olabilir fare boyutu temelinde gerekiyor. Son derece kısa veya uzun Kateterler sızıntı ve/veya hava yolu Lavaj sırasında gözyaşı eğilimindedir. Kateter uzunluğu böyle olması gerektiğini iyi nefes borusu içinde o zaman tam olarak ipucu kalır eklenen ve birincil bronşlar ulaşmak değil.</li>
	<li>Buz gibi BAL arabelleğe (Ca2 + ve Mg2 + ücretsiz PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic asit, EDTA) kateter ile dolu bir 1-mL şırınga ekleyin ve yavaş yavaş arabellek akciğerleri aşılamak. Bu akciğerleri şişirmek. Beş saniyeliğine için kateter bağlı şırınga tutmak ve pistonu hafifçe çekerek lavaj sıvı Aspire edin. Bu akciğerler deflate. Buz üzerinde yerleştirilen bir 15 mL konik tüp sıvı toplamak.</li>
	<li>Adım 1,10 dokuz kez daha tekrarlayın ve lavaj sıvı havuz. Bu akciğer kapasitesini aşan ve onun kopmalara neden flush, başına 1 mL arabellek fazla olamaz.</li>
	<li>Fare ile CO2 doz onaylanan IACUC protokolü tarafından ötenazi.</li>
	<li>10 mL BAL sıvısı 250 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet BAL hücreler içeriyor. Uyarı: Pelet olabilir çok küçük, çok süpernatant aspirating zaman dikkatli olun.</li>
	<li>Akışı sıralama/arabellek (PBS + % 2 inaktive ısı fetal sığır serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic asit (HEPES)) 100 μL BAL hücrelerinde resuspend.</li>
	<li>Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma fare Fc blok ekleyerek engellemek (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) ve 20 dakika boyunca buzda kuluçka.</li>
	<li>Floresans eksi bir (FMO) birlikte boyama antikor gerçekleştirmek ve tek-leke11,25denetler. BAL değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından uygun analiz yazılımı tarafından tek hücreli Akış Sitometresi Analizi ile takip ( Tablo malzemelerigörmek) ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>AMs izole bir floresan aktif hücre tarafından sıralayıcısı ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL MOUSE'um kültür orta AMs içinde vitro kültür ve in vivo için amaçlanan hücre aktarımı. Alternatif olarak, sıralama 1 mL lizis arabellek AMs ( Tablo malzemelerigörmek) ile 10 μL/mL β-Mercaptoethanol RNA çıkarılması için takıma.</li>
</ol>2. fare akciğer, tek hücreli süspansiyon gelen AMs yalıtım
<ol><li>Bir sekiz haftalık C57BL/6 fare ile ketamin (87,5 mg/kg vücut ağırlığı) ve xylazine (12.5 mg/kg vücut ağırlığı) mayi bir enjeksiyon kokteyl uyuşturan. Cerrahi anestezi Reflekslerin kaybı ve kas gevşeme ile fare attains devam.</li>
	<li>Fareyi bir diseksiyon yüzeye ventral yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Oftalmik veteriner merhem gözleri su kaybı önlemek ve dezenfekte için % 70 isopropanol ile doymuş steril alkol yastıkları ile fare tüm menfez yüzey silmek için uygulayın.</li>
	<li>Fare ölçülü tüm dört ayaklı bağlayın.</li>
	<li>Yavaşça karın boşluğu ile mikro diseksiyon Araçlar'ı açın. Herhangi bir visseral organlara zarar verme ya da çıkıntılı doku oluşturma olmadan mümkün olduğu kadar alan açmak için özen göstermelidir.</li>
	<li>Yavaşça göğüs boşluğuna yavaş yavaş mediasten aracılığıyla göğüs kafesi incising tarafından açın. İdeal olarak, göğüs kafesinin yan tarafına eksize. Aşırı akciğerler plevra göğüs boşluğuna açılırken değil incitmek özen göstermelidir.</li>
	<li>İnferior vena kava bulun ve fare kanamaya bir kesi yapmak. Kan emmek için emici pamuk tamponlarla kullanabilirsiniz.</li>
	<li>10 mL buz gibi PBS dolaşımdaki kan hücreleri temizlemek için (10 mL şırınga ve 25 G iğne kullanarak) sağ ventrikül enjekte. Tamamen periosteum sonra akciğerler beyazlatılmış görünür ve hasat için hazırız.</li>
	<li>5 mL soğuk bir 15 mL konik boru içine nefes borusu, kan damarları ve kasları kesilmesinin tarafından ciğerlerini parçalayıp Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM). Sonraki adım kadar buza korumak.</li>
	<li>Fare ile CO2 doz onaylanan IACUC protokolü tarafından ötenazi.</li>
	<li>Perfused akciğer 3 mL DMEM ile steril ve pyrogen Ücretsiz 60 mm kültür çanak içine aktarın. Anatomi forseps yardımıyla varsa solunum yolları ve diğer sabit olmayan Akciğer doku malzeme alay. Bir neşter ile Akciğer doku kıyma < 1 mm boyut.</li>
	<li>300 µg/mL Liberase TL ve 5 U/mL ekleyin Dnaz ben, mix pipetting tarafından ve bir kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya 25 dakikadır. Karışımı yavaşça bir kez 10 dakika sonra pipetting.</li>
	<li>50 mL konik tüp üzerinde yüklü bir 100 µm hücre süzgeç Disosiye akciğerlere geçer. Bir dalgıç arkasından 1 mL şırınga mash up hücre kümeleri filtresini kullanın. 20 mL yıkama arabellek filtresiyle yıkayın (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Vasıl 500 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet 20 mL yıkama arabellekte resuspend.</li>
	<li>2.12 ve iki kez, 2.13 filtre ve tüp her zaman değişen adımları yineleyin. Beş dakikadan fazla yıkama arabellekte filtre önceden iliklerine kadar AM verim artar. 100 ekleyerek tek hücre süspansiyon hazırlamak akışı sıralama/hücre Pelet arabelleğe μL.</li>
	<li>Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma fare Fc blok ekleyerek engellemek (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) ve 20 dakika boyunca buzda kuluçka.</li>
	<li>Antikor FMO ve tek-leke denetimleri11,25ile birlikte boyama gerçekleştirmek. Akciğer değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından yazılım tek hücreli Akış Sitometresi Analizi analiz tarafından takip ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Sıralama AMs hücre sıralayıcısı tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL MOUSE'um kültür orta AMs içinde vitro kültür ve in vivo için amaçlanan hücre aktarımı. Alternatif olarak, AMs 1 mL 10 μL/mL β-Mercaptoethanol RNA çıkarılması için ile takıma lizis arabellek içine sıralayın.</li>
</ol>3. insan BAL sıvısı üzerinden AMs yalıtım
<ol><li>Klinik laboratuvar 4 ° C'de insan BAL sıvı göndermek</li>
	<li>BAL sıvısı (10-50 mL) 250 x g 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet BAL hücreleri11içerir.</li>
	<li>Pelet 20 mL yıkama arabelleği ile yıkayın (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 2 mM EDTA) ve santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.</li>
	<li>Resuspend BAL hücrelerdir 100 μL akışı/arabellek sıralama (PBS + % 2 ısı Inaktif FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).</li>
	<li>İnsan Fc blok (Klon Fc1.3070, 25 μg/mL) ekleyip 20 dakika boyunca buzda kuluçka Fc reseptör nonspesifik antikor bağlanma engelleyin.</li>
	<li>Antikor FMO ve tek-leke denetimleri11,24ile birlikte boyama gerçekleştirmek. BAL değerlendirmek hücreleri hücre Çözümleyicisi tarafından yazılım tek hücreli Akış Sitometresi Analizi analiz tarafından takip ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Sıralama AMs hücre sıralayıcısı tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) doğrudan 1 mL insan AM kültür orta veya 1 mL lizis arabellek 10 μL/mL β-Mercaptoethanol ile desteklenmiştir.</li>
</ol>4. vitro kültür AMs
<ol><li>Hücre sıralama aşağıdaki hücreleri 250 x g 10 dk 4 ° c de centrifuging tarafından hasat.</li>
	<li>1 mL insan AM kültür orta [Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) % 10 ile desteklenmiş 1640 FBS, % 20 L-929 kültür (kaynağı makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF), 100 U/mL nihai toplama olarak), süpernatant insan AMs resuspend 1 mM sodyum pyruvate, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic asit (HEPES) ve 1 x penisilin/streptomisin (isteğe bağlı)]. Benzer şekilde, fare AMs 1 mL fare AM kültür orta [%10 FBS, % 20 L-929 kültür süpernatant (bir kaynak olarak M-CSF, 100 U/mL nihai toplama), 1 mM sodyum Pyruvate, 10 mM HEPES ve 1 x penisilin/streptomisin (isteğe bağlı DMEM resuspend )].</li>
	<li>Trypan mavi hariç hücrelerin hücre sayacı tarafından numaralandırmak ve 1 x 106/mL uygun hücre konsantrasyonu ayarlayın. Not: İdeal olarak, yukarı 5 x 10 için5 AMs 8-10 hafta eski bir C57BL/6 erkek fare toplanan BAL sıvısı üzerinden ayrılmış olabilir. Fare akciğer Özet dan AM verim değişkendir ve biraz daha az fare BAL sıvısı bundan olabilir. BAL sıvısı, lavaj ve hastanın klinik durumu kullanılan tuz çözeltisi hacmi hacmi AM verim insan BAL sıvısı üzerinden bağlıdır.</li>
	<li>Verim ve deneysel gerekliliği üzerinde bağlı olarak, hücre odası slaytlar, kültür yemekleri veya kültür şişeler tohum. İdeal olarak, 1 x 105/mL T25 doku kültürü şişeye 10 mL orta ile AMs tohum.</li>
	<li>37 ° C oksijen kuluçka %5 CO2 atmosfere sahip hücreleri kuluçkaya. Not: AMs yapışık hücreleri olarak büyüyecek ve son derece yavaş büyüyen vardır (zaman iki katına > 7 gün).</li>
	<li>24 saat sonrası Ekim tarihi, AMs olmalıdır yapışık ve kültür orta hafif bir değişiklik tarafından müstakil değil. Orta aspirasyon bir ucundan kaldırmak ve 37 ° C'ye önceden sıcak taze orta ile doldurmak Not: Hücreleri şimdi AM Fizyoloji veya uyaranlara etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. AMs odası slaytları yetiştirilen uygun uygun antikorlar ile Boyanabilen ve mikroskobik görselleştirme için idealdir. Akış sitometrik değerlendirme için AMs kuluçka tarafından çözüm dissociating enzimatik olmayan hücre ile hasat.</li>
	<li>Kültür orta Aspire edin ve kültür yüzey (T25 şişe başına yaklaşık 2 mL) kapak ve 37 ° C'de 5-10 dakika için kuluçkaya dissociating çözüm için yeterince ekleyin. Hiçbir kazıma gerekli olacak ve bu hücreleri mekanik kazımak için tavsiye edilmez. Kenarları hafifçe dokunun, 1-2 mL akışı/arabellek sıralama ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı yapışık hücreleri çoğunluğu ayırmak için pipet.</li>
	<li>RNA çalışmaları için kültür çanak üzerinde doğrudan hücre lizis arabelleği ekleyerek parçalayıcı.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity.">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells.">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).</li><li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections.">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li><li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity.">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung.">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection.">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).</li><li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development.">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li><li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease.">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li><li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses.">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li><li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection:+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha,+T+helper+1/T+helper+2+cytokines,+IgG+subclasses,+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation.">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li><li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li><li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+proteinosis:+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction.">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li><li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy.">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li><li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes.">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li><li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages.">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li><li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation.">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li><li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung.">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction.">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection.">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients.">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li><li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li></ol>

Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

AMs doğumda başlayan ve tüm yaşam süresi26üzerinde kalıcı ciğerleri doldurmak uzun yaşam akciğer yerleşik makrofajlar vardır. Pulmoner Fizyoloji7 ve patoloji12 ve pulmoner otoimmünite24 toplam tahmin etmek için potansiyel rolleri kabul edilmiştir. AMs akciğerler11,27 ' uzun vadeli bir durum olduğundan ve harekete geçirmek ve bağışıklık yanıtı<...

Akciğer microenvironment bir ayrıntılı hava kanalı ve damarlara ile benzersiz olarak karmaşık bir ekosistem var. İnhale hava nefes borusunu delip geçmiş çok sayıda şube bronchioles ve bronşlar kan-hava gaz değişimi oluştuğu alveoller ulaşmadan önce geçecek. Atmosferi ile doğrudan etkileşim nedeniyle solunum yüzey havadaki parçacıklar ve kirleticilerin zararlı etkilerinden koruma gerektirir. Fiziksel, kimyasal ve immünolojik engeller bir takım akciğer korumak. Özellikle, solunum yüzeyde fagositler dağıtımını bir önemli ilk satır savunma sistemi hizmet vermektedir. Alveoler makrofajlar (AMs) akciğer yerleşik fagositler bir türdür ve akciğer makrofaj havuzu büyük çoğunluğu kadar yapıyorlar. Onların adından da anlaşılacağı gibi AMs öncelikle alveoler Lümen yerelleştirilmiştir ve sürekli ortam atmosfer örnek ve alveoler epitel1ile iletişim kuran sesil hücreler olarak ortaya çikmaktadir. Kararlı duruma akciğerlerde AMs2olan kompozisyon iltihap, enfeksiyon ya da kronik kirleticiler maruz nedeniyle değiştirebilir, alveoler uzayda fagositler % 95'den fazla vardır.
AMs geniş bir akciğerlere yerel olabilir fonksiyonların ve/veya sistemik önemli alanda katılmak. Örneğin, AMs geliştirme ve en uygun akciğerler işleyişi ve gereklidir; immün gözetim; ve hücresel enkaz patojenler ve inhale parçacıklar3,4,5,6,7istila, boşluk. AMs hedeflenen tükenmesi izni solunum virüs ve bakteri4,8zarar olduğu bilinmektedir. Fagositler ve pulmoner homeostazı ilk satır savunucuları olarak onların rol yanı sıra, AMs alabilme T antijen sunan hücreler bağışıklık9, hücre gibi çalışmaya burunici aşı10 etkinliğini potentiating bilinen ve Akciğer tarafından kısıtlanmış otoimmünite akciğer nakli11,12sonra etkileyen. Eksikliği AM işlevindeki pulmoner alveoler proteinosis (PAP), bir genetik mutasyon, malignite veya pulmoner yüzey aktif maddeleri13,14Gümrükleme bozar enfeksiyon kaynaklanan bir durum bağlı. AMs nakli şimdi PAP 15,16tedavisi için bir tedavi yaklaşımı olarak keşfedilmeden.
AMs embriyogenez sırasında kaynaklanan ve hayatı boyunca akciğerlerde lökosit2,17dolaşan tarafından değiştirilen olmadan kalıcı olması için bilinir. AM ciro homeostatik akciğerlerde tespit edilemez olmasına rağmen çeşitli düzeylerde AM ciro enfeksiyon da dahil olmak üzere bazı klinik koşullarda bildirilmiştir grip virüsü4, myeloablative ışınlama18, endotoksin maruz 19ve yaşlılık20. AMs via düşük dereceli nükleer silahların yayılmasına karşı17,21kendini yenilemek inanılıyor, ama bazı yeni çalışmalar monosit intravasküler akciğer makrofajlar22,23 altında bir nüfusa çıkmasına neden olabilir olduğunu iddia Ama bu yeni dönüştürülmüş pulmoner makrofajlar işlevselliğini deneysel koşullar henüz akciğer hastalıklarında tanımlanması gerekir. Ayrıca, AM etkinleştirme içeriğinde uyarıcı eşik anlama akciğer iltihabi sinyalleri ve immunoregulatory makine arasında bir denge korumak çalışır gibi potansiyel olarak ilginç bir alan olduğunu.
Bağışıklık yönetmelik kaybına yol fizyolojik veya patolojik değişiklikler çeşitli klinik ayarları (Örneğin, solunum yolu enfeksiyonları, inflamatuar akciğer hastalığı ve fibrotik akciğer hastalığı) değerlendirmek önemlidir. Yine de, AMs giderek göstergeleri veya hatta akciğer sağlığı11,24belirleyicileri kabul edilmektedir. Şu anda, hasat, karakterize, ve/veya bakımını AMs insanlar ve preklinik fare modelleri için kullanılabilir birleştirilmiş iletişim kuralı vardır. AM öncüleri ve fenotipleri üzerinde bir fikir birliği olmaması ve detaylı bir metodoloji yokluğu AM deşifre rolleri büyük barikat akciğer sağlığı ve hastalıkları olmuştu. Aşağıdaki iletişim kuralı kesin kimlik, yalıtım ve büyük ölçüde AM davranış anlayışı ilerletmek ve tanı ve tedavi edici çalışmalar AM hedefli kolaylaştırmak vitro kültür strateji sunmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="910">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Non-enzymatic cell dissociating solution</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">C5789</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puralube Vet Ointment</td>
			<td style="width:223px;">Dechra</td>
			<td>620300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22G Catheter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Terumo Medical Products</td>
			<td>SR-OX2225CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Non-absorbable silk braided suture&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Kent Scientific</td>
			<td>SUT-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Fc block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAria II cell sorter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:220px;">644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine&#160; (Ketathesia)</td>
			<td style="width:223px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:220px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine&#160; (AnaSed)</td>
			<td style="width:223px;">Akorn</td>
			<td style="width:220px;">139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liberase TL&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100&#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Human Fc block</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">HEPES</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">L-929 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC,&#160;CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm culture dish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>CLS3261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">15 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">50 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">FlowJo</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo</td>
			<td>v10.4</td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>147709</td>
			<td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11c (Mouse)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565452</td>
			<td>Clone N418, BV 421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-I-Ab (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>116420</td>
			<td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-F (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-H (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>129605</td>
			<td>Clone 551, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-F4/80 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>123118</td>
			<td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Ly-6C (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>128035</td>
			<td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD64 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>139311</td>
			<td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD24 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>563115</td>
			<td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD103 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>745305</td>
			<td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD317 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>127015</td>
			<td>Clone 927, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CXCR1 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>149029</td>
			<td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>304017</td>
			<td>Clone HI30, AF488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-HLA-DR (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>307618</td>
			<td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD169 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>346008</td>
			<td>Clone 7-239, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD206 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>321106</td>
			<td>Clone 15-2, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD163 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>333612</td>
			<td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages

Alveoler makrofajlar ölümcül farklılaştırılmış, akciğer yerleşik makrofajlar doğum öncesi kökeni vardır. Alveoler makrofajlar onların uzun ömürlü ve akciğerleri ve işlev yanı sıra onların akciğer lokalize yanıt enfeksiyon ve inflamasyon onların önemli rol içinde benzersizdir. Bugüne kadar tanıma, yalıtım ve alveoler makrofajlar insan ve fare kullanımı birleştirilmiş yöntem bulunmaktadır. Böyle bir yöntem çalışmaları bu önemli doğuştan gelen bağışıklık hücreleri üzerinde yapılan çeşitli deneysel ayarları için gereklidir. Alveoler makrofajlar bronchoalveolar lavaj sıvı veya Akciğer doku hasat ve onları içinde vitrokorumak için kolayca herhangi bir laboratuvar tarafından kabul edilebilir, burada açıklanan yöntemi basitleştirilmiş bir yaklaşımdır. Alveoler makrofajlar öncelikle alveoller yapışık hücreleri olarak meydana çünkü bu yöntemin önce hasat ve kimlik kekii üzerinde odaklanmıştır. Akciğer son derece bozukluklarına bir organdır ve çeşitli hücre tiplerinin myeloid ve lenfoid kökenli yaşamak, etkileşim ve akciğer microenvironment tarafından etkilenmiştir. Burada açıklanan yüzey işaretlerinin kümesini kullanarak, araştırmacılar kolayca belirsizliğe yer bırakmadan alveoler makrofajlar diğer lökositler tanımlanması, ayrıştırılması ve onları aşağı akım uygulamalarda arındırmak. Burada geliştirilen kültür yöntemi her iki insan destekler ve alveoler makrofajlar içinde vitro büyüme için fare ve hücresel ve moleküler çalışmalar ile uyumludur.

Fare AMs tanımlamak için akış sitometrik yaklaşım şekil 1' de gösterilen. Bu yüzey işaretlerinin diğer akciğer yerleşik veya akciğer infiltre fagositler AMs ayrım gerekli en az set analizini içerir. Fark analiz olumlu interstisyel makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller, monosit ve akciğerlerde oluşan monosit kaynaklı akciğer makrofajlar üzerinden AMs tanımlamak için gereklidir. Yüzey işaretlerinin aşağıdaki düzeni bu hücr...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages at JoVE.com

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

23.4K Görüntüleme.  St. Joseph's Hospital and Medical Center. Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Video: Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

Birincil İnsan Monositlerinin İzolasyon, Transfeksiyon ve Kültürü

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...