원고 편집 도움에 감사 클레어 Prendergast 하 고. DKN 지원 연구 러닝 재단에서 (#2095) 부여 및 TM는 건강의 국가 학회 (R01HL056643 및 R01HL092514)에서 교부 금에 의해 지원 됩니다. DKN는 방법을 개발 하 고 연구를 설계 하 고, 쓴 원고; OM 지원 동물 연구와 임상 샘플 조달; SB 지원 흐름 cytometric 분석 및 세포 분류; TM 연구를 감독 하 고 원고를 검토.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 세인트 조셉의 병원 및 의료 센터에서 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었습니다.
1. 절연 Murine Bronchoalveolar 게 (BAL) 액체에서 AMs의
<ol><li>케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.</li>
	<li>복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 준비 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.</li>
	<li>부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.</li>
	<li>열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.</li>
	<li>순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL 버퍼링 차가운 인산 염 (PBS)를 삽입할. 흡수 성 목화 패드와 함께 혈액의 흐름을 흡수. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 게에 대 한 준비가 다음 blanched 표시 됩니다.</li>
	<li>부드럽게 피부를 자르면 고 기도 폭로 목에 근육. 신중 하 게 소비 세는 인접 근육, 연골, 및 지방 조직 기관 손상 없이.</li>
	<li>작은 절 개를 만들기 (< 2 m m) 후 두 후부 기관에. 이 절 기도 여전히 후 두에 연결 되어 있는 동안에 카 테 터 삽입에 충분 해야 합니다. 폐 쪽으로 기관지에 바늘 없이 1 인치 22 G 카 테 터를 삽입 합니다. 실크 꼰된 봉합으로 카 테 터를 확보 (4-0; 비 흡수) 광장 매듭. 참고: 카 테 터는 마우스 크기에 따라 모든 트림을 하 게 해야 합니다. 매우 짧은 또는 긴 카는 누설 하 게 동안 기도 찢 어 경향이 있습니다. 카 테 터 길이 등을 해야 그 때 완전히 삽입 팁 남아 기도 내 고 주 기관지에 도달 하지.</li>
	<li>카 테 터를 얼음 처럼 차가운 발 버퍼 (캘리포니아2 + , Mg2 + 무료 PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산, EDTA)으로 가득 1 mL 주사기를 연결 하 고 천천히 폐에 버퍼 되지 않도록. 이 폐를 부 풀 려 것입니다. 5 초에 대 한 카 테 터에 부착 된 주사기를 유지 하 고 게 액체 피스톤을 부드럽게 당겨서 발음. 이 폐 폐의 것입니다. 얼음에 15 mL 원뿔 튜브에 액체를 수집 합니다.</li>
	<li>9 번에 대 한 단계 1.10을 반복 하 고 게 액체 수영장. 폐 용량을 초과 하 고 그것의 파열으로 이어질 수 있습니다 그 플러시, 당 1 mL 버퍼를 초과 하지 마십시오.</li>
	<li>IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.</li>
	<li>10 분간 4 ° C에서 250 x g에 10 mL 발 유체 원심. 셀 펠 릿 발 셀을 포함합니다. 주의: 펠 릿 매우 작을 수 있습니다, 그리고 그래서 주의 상쾌한 발음 하는 경우.</li>
	<li>흐름/정렬 버퍼 (PBS 2% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 1 mM EDTA + + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES))의 100 μ에 발 셀 resuspend</li>
	<li>Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.</li>
	<li>항 체 형광에서 1 (FMO)을 뺀 함께 얼룩을 수행 하 고 단일-얼룩 컨트롤11,25. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 흐름 cytometry 분석 하 여 적절 한 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조) ( 재료의 표참조).</li>
	<li>AMs 격리 형광 활성화 된 세포에 의해 정렬 ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 정렬 AMs 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충 ( 재료의 표참조).</li>
</ol>2. 마우스 폐, 단일 세포 현 탁 액에서에서 AMs의 격리
<ol><li>케 타 민 (87.5 mg/kg 체중)와 xylazine (12.5 mg/kg 체중) 복 주사를 통해 칵테일 8 주 된 C57BL/6 마우스 anaesthetize 때 반사의 손실 및 근육의 이완으로 수술 마 취를 달성 하는 마우스를 이동 합니다.</li>
	<li>복 부 면이 위로 향하도록 해 부 표면에 마우스를 놓습니다. 탈수를 방지 하기 위해 살 균 알코올 패드 70% 소독 소 프로 파 놀과 포화와 마우스의 복 부 표면 전체를 닦아 눈에 안과 의사 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>제 지 하는 모든 4 개의 다리와 마우스를 탑재 합니다.</li>
	<li>부드럽게 마이크로 해 부 도구와 복 부 구멍을 엽니다. 돌출 된 조직을 만들거나 어떤 내장 장기를 손상 하지 않고 가능한 많은 영역을 열고 주의 해야 합니다.</li>
	<li>부드럽게 천천히 incising는 mediastinum 통해 흉 곽 흉 강 열. 이상적으로, 흉 곽 쪽으로 측에서 excised 될 수 있습니다. 흉 강 여는 동안 폐의 늑 막 손상 않기로 주의 기울여야 합니다.</li>
	<li>열 등 한 베 나 정 맥을 찾아서 마우스 피를 절 개 합니다. 흡수 성 목화 패드를 사용 하 여 혈액을.</li>
	<li>순환 혈액 세포를 (10 mL 주사기 및 25g 바늘을 사용 하 여) 우 심 실에 10 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 삽입할. 일단 완전히 끼얹는다 폐 고 수확에 대 한 준비가 blanched 표시 됩니다.</li>
	<li>추위의 5 mL 15 mL 원뿔 튜브로 기관, 혈관, 인 대를 절단 하 여 폐 밖으로 해 부 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM). 다음 단계까지 얼음에 그것을 유지.</li>
	<li>IACUC 승인 프로토콜에 의해 CO2 과다와 마우스를 안락사.</li>
	<li>Perfused 폐 3 mL DMEM와 멸 균 및 pyrogen 무료 60 m m 문화 접시에 전송 합니다. 있는 경우 집게 해 부의 도움으로 기도와 다른 하드 비 폐 조직 소재, 애타게. 하 메스와 폐 조직 말하다 < 1 m m 크기.</li>
	<li>300 µ g/mL Liberase TL과 5 U/mL을 추가 DNase I, pipetting으로 혼합 하 고 25 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어. 부드럽게 한 번 10 분 후 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>50 mL 원뿔 튜브에 설치 된 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 천연된 폐를 전달 합니다. 1 mL 주사기에서 플런저의 뒷면을 사용 하 여 필터에 세포 덩어리를 매 시. 20 mL 워시 버퍼 필터 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>4 ° C에서 500 x g에서 5 분간 원심. 삭제는 상쾌한 고 셀 펠 릿 20 mL 워시 버퍼에서 resuspend.</li>
	<li>단계 반복 2.12 2.13 두 번 필터와 튜브 각 시간을 변경 합니다. 전 5 분 이상 워시 버퍼에 필터를 몸을 담글 오전 수확량을 증가 합니다. 100을 추가 하 여 단일 세포 현 탁 액을 준비 μ 흐름/정렬 셀 펠 릿에 버퍼.</li>
	<li>Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 마우스 Fc 블록을 추가 하 여 차단 (클론 2.4G2, 10 μ g/mL)와 얼음에 20 분 동안 잠복기.</li>
	<li>항 체 단일 얼룩 컨트롤11,25FMO와 얼룩을 수행 합니다. 평가 하는 폐 세포 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 마우스에 있어 문화 매체 AMs에 생체 외 문화 또는 vivo에서 것입니다 때 셀 전송. 또는, 1 mL 세포의 용 해 버퍼 10 μ/mL β-Mercaptoethanol RNA 추출에 대 한 보충으로 AMs를 정렬 합니다.</li>
</ol>3. 인간의 발 액체에서 AMs의 격리
<ol><li>4 ° c.에 실험실을 병원에서 인간의 발 액체의 이동 정렬</li>
	<li>10 분 동안 발 유체 (10-50 mL) 4 ° C에서 250 x g에서 원심. 셀 펠 릿 발 셀11포함 되어 있습니다.</li>
	<li>20 mL 워시 버퍼와 펠 릿을 세척 (PBS + 2% 열 사 FBS + 2 mM EDTA)와 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.</li>
	<li>발 셀 흐름/정렬 버퍼의 100 μ에는 resuspend (PBS + 2% 열 사 FBS 1 mM EDTA + 25mm HEPES).</li>
	<li>인간의 Fc 블록 (클론 Fc1.3070, 25 μ g/mL)을 추가 하 고 20 분 동안 얼음에 배양 하 여 Fc 수용 체에 특이 항 체 바인딩을 차단.</li>
	<li>항 체 단일 얼룩 컨트롤11,24FMO와 얼룩을 수행 합니다. BAL 평가 셀 분석기로 셀 단일 셀 cytometry 분석 하 여 분석 소프트웨어 다음 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>셀 정렬 하 여 정렬 AMs ( 재료의 표참조) 직접 1 mL 인간의 오전 문화 매체 또는 1 mL 세포의 용 해 버퍼에 보충 10 μ/mL β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>4. 문화 체 외에서 AMs에의
<ol><li>셀 정렬, 다음 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g에서 centrifuging 여 세포를 수확.</li>
	<li>1 mL 인간의 오전 문화 매체 [로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 보충 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF), 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 인간의 AMs resuspend 1mm 나트륨 pyruvate, 10 m m N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic 산 (HEPES), 및 (옵션) 1 x 페니실린/스]. 마찬가지로, 마우스 AMs 1 mL 마우스 오전 문화 매체 [DMEM 10 %FBS, 20 %L-929 문화 (의 소스로 M-CSF, 100 U/mL 최종 농도), 표면에 뜨는 1mm 나트륨 Pyruvate, 10 mM HEPES, 및 (선택 사항 1 x 페니실린/스 보충을 resuspend합니다 )].</li>
	<li>Trypan 블루 제외 가능한 셀 셀 카운터로 열거 하 고 1 x 106/mL에서 실행 가능한 세포 농도 조정 합니다. 참고: 이상적으로, 최대 5 x 105 AMs 수 발 유체는 8 10 주 오래 된 C57BL/6 남성 마우스에서 수집 으로부터 격리. 마우스 폐 다이제스트에서 오전 항복 변수 이며 마우스 발 액체의 보다 약간 덜 수 있습니다. 인간의 발 액체에서 오전 항복 발 액, 게, 그리고 환자의 임상 상태에 사용 하는 염 분의 총 볼륨의 볼륨에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>수율과 실험 필요성에 따라, 챔버 슬라이드, 문화 요리 또는 문화 플라스 크에 세포 씨앗. 이상적으로, 1 x 105/mL T25 조직 배양 플라스 크에 10 mL 매체에 AMs 씨앗.</li>
	<li>셀 5% CO2 분위기 37 ° C 습도 인큐베이터에 품 어. 참고: AMs 부착 세포로 성장할 것입니다 그리고 매우 느린-성장 하는 (시간을 두 배로 > 7 일).</li>
	<li>24 시간 후 시드, AMs 되어야 점착 및 문화 매체의 부드러운 변화에 의해 분리 되지 것입니다. 한쪽에서 포부에 의해 매체를 제거 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 신선한 매체와 보충 참고: 셀 이제 오전 생리학 또는 자극의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. AMs 성장 챔버 슬라이드에 적절 한 항 체와 편리 하 게 얼룩이 질 수 있다 고 현미경 시각화에 이상적입니다. 흐름 cytometric 평가, AMs 비 효소 셀 솔루션 해리 외피에 의해 수확.</li>
	<li>문화 매체를 발음 하 고 문화 표면 (T25 플라스 크 당 약 2 mL)와 5-10 분 동안 37 ° C에서 품 어 충분히 출신과 솔루션을 추가 합니다. 아니 된다고 해야 합니다, 그리고 세포를 기계적으로 긁어 권장 되지 않습니다. 부드럽게 양쪽, 1-2 mL 흐름/정렬 버퍼 추가 누르고 부드럽게 위아래로 분리 부착 세포의 대부분을 플라스틱.</li>
	<li>RNA 연구에 대 한 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 여 문화 접시에 직접 세포를 lyse.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity.">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+prevent+lethal+influenza+pneumonia+by+inhibiting+infection+of+type-1+alveolar+epithelial+cells.">Alveolar macrophages prevent lethal influenza pneumonia by inhibiting infection of type-1 alveolar epithelial cells.</a> PLoS Pathog. 13 (1), e1006140 (2017).</li><li>Ghoneim, H. E., Thomas, P. G., McCullers, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+during+influenza+infection+facilitates+bacterial+superinfections.">Depletion of alveolar macrophages during influenza infection facilitates bacterial superinfections.</a> J Immunol. 191 (3), 1250-1259 (2013).</li><li>MacLean, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequestration+of+inhaled+particulate+antigens+by+lung+phagocytes.+A+mechanism+for+the+effective+inhibition+of+pulmonary+cell-mediated+immunity.">Sequestration of inhaled particulate antigens by lung phagocytes. A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung.">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection.">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).</li><li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development.">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li><li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease.">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li><li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses.">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li><li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection:+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha,+T+helper+1/T+helper+2+cytokines,+IgG+subclasses,+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation.">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li><li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li><li>Greenhill, S. R., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+proteinosis:+a+bench-to-bedside+story+of+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+dysfunction.">Pulmonary alveolar proteinosis: a bench-to-bedside story of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor dysfunction.</a> Chest. 136 (2), 571-577 (2009).</li><li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), 250ra113 (2014).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy.">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li><li>Hashimoto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+self-maintain+locally+throughout+adult+life+with+minimal+contribution+from+circulating+monocytes.">Tissue-resident macrophages self-maintain locally throughout adult life with minimal contribution from circulating monocytes.</a> Immunity. 38 (4), 792-804 (2013).</li><li>Murphy, J., Summer, R., Wilson, A. A., Kotton, D. N., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prolonged+life-span+of+alveolar+macrophages.">The prolonged life-span of alveolar macrophages.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (4), 380-385 (2008).</li><li>Maus, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+alveolar+macrophages+are+replaced+by+recruited+monocytes+in+response+to+endotoxin-induced+lung+inflammation.">Resident alveolar macrophages are replaced by recruited monocytes in response to endotoxin-induced lung inflammation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 35 (2), 227-235 (2006).</li><li>Perdiguero, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages+originate+from+yolk-sac-derived+erythro-myeloid+progenitors.">Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors.</a> Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).</li><li>Bitterman, P. B., Saltzman, L. E., Adelberg, S., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophage+replication.+One+mechanism+for+the+expansion+of+the+mononuclear+phagocyte+population+in+the+chronically+inflamed+lung.">Alveolar macrophage replication. One mechanism for the expansion of the mononuclear phagocyte population in the chronically inflamed lung.</a> J Clin Invest. 74 (2), 460-469 (1984).</li><li>Misharin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-derived+alveolar+macrophages+drive+lung+fibrosis+and+persist+in+the+lung+over+the+life+span.">Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span.</a> J Exp Med. , (2017).</li><li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+pulmonary+intravascular+nonclassical+monocytes+recruit+recipient+neutrophils+and+mediate+primary+lung+allograft+dysfunction.">Donor pulmonary intravascular nonclassical monocytes recruit recipient neutrophils and mediate primary lung allograft dysfunction.</a> Sci Transl Med. 9 (394), (2017).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection.">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells.">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li><li>Eguiluz-Gracia, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+human+donor+alveolar+macrophages+in+lung+transplant+recipients.">Long-term persistence of human donor alveolar macrophages in lung transplant recipients.</a> Thorax. 71 (11), 1006-1011 (2016).</li><li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li></ol>

저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.

AMs는 출생 시 시작 및26의 전체 수명 동안 지속 폐를 채우는 긴-생활 폐 상주 세포. 폐 생리학7 과 병리학12 및 폐 면역24 의 그들의 잠재력에서 그들의 역할을 인정 받고 있다. AMs 폐11,27 에 있는 장기 존재와 그들이 활성화 및 면역 반응11,24, 다른 만성 염증 및 거리 폐에 그들의 역할의 진행에 관여 하는 있기 때문에 질병 평가 될 필요가 있다. 역사적으로, AMs 혼란된 정체성 졌고 종종 오인 했다. 최근 채택된 phenotypic 마커25,28, 그는 지금 인간의 구별 하 고 (예를 들어, 중간 세포, 폐 수지상 세포, 및 monocyte 다른 폐 식 세포에서 AMs를 마우스를 가능한 폐 세포 파생). 여기에 설명 된 방법은 분리 하 고 마우스 및 인간의 AMs의 생체 외에서 문화에 대 한 최적화 되어 있다. 이러한 프로토콜 다른 종에서 AMs에 대 한 광범위 하 게 채택 수 있습니다, 있지만 적절 한 phenotypic 결정 철저 한 특성에 대 한 표면 마커 "최소한 필요" 설정을 설정 하기 위해 실시 한다.
게 여 murine AMs의 격리, 킬레이트 화 대리인 (즉, EDTA)와 미리 발 버퍼를 재미의 포함 현재 연구에서 중요 한 것을 발견 했다. AMs 때문에 치경 벽에 부착, 혼자 PBS 사용 하 여 셀 dislodging에 효과가 아니 었 고 상당히 낮은 수확량을 생산. 기도에 카 테 터의 설치를 보안 하는 것은 또 다른 중요 한 단계입니다. 누출 방지 첨부 파일을 발 액체의 손실을 최소화 되도록 주의 해야 합니다. 추가 주의 필요 lavaging 젊은 마우스 동안 (< 6 주 이전), 기관지의 구조 진미 끊어지고 또는 누설에 게 동안 발생할 수 있습니다. 두 연속 겹치지 봉합을 자주 설치 테의 안전한 첨부 파일을 보장 하 고 누출을 방지. 비록 비 효소 분리 (즉., 보충 chelator 버퍼)는이 연구에서 오전 격리 수행에 그것이 가능 폐 게 동안 콜라와 효소 분리는 더 나은 오전 수율 생산할 수 있습니다.
인간의 오전 발 유체에서의 비중은 변수입니다. AMs 일상적인 후 폐 이식 후속 동안 노턴 가슴 연구소에서 인간의 폐 이식 받는 사람에서 수집 된 모든 발 세포의 약 10%를 구성 하며 총 오전 수율은 여러 변수에 의존 합니다. 이러한 변수에 환자의 임상 상태, 염 분에 게, 사용의 볼륨 및 오전 격리에 대 한 처리는 발 유체의 볼륨 포함 됩니다. 전 게 절차 (예: 바늘 생 검)을 microhemorrhage 발 세포; 세포 구성 변경 그럼에도 불구 하 고, 구현 phenotypic 감 적의 명백한 탐지 및 인간의 오전 수영장 (그림 2)의 수 있습니다.
L-929 컨디셔닝 매체 (M-CSF의 소스)를 사용 하 여 AMs의 체 외에 유지 보수를 위해 필요 했다. 그것은 우리의 믿음입니다 그 보충 정화 M-CSF의 문화;에서 AMs를 유지 하기 위해 충분 한 것 그러나, 최적화 된 농도 모두 인간을 위한 밖으로 일 수와 AMs를 마우스 필요가 있다. Endocytosis, 염증, 항 원 프레 젠 테이 션, 성숙/활성화 상태, 또는 한 시간 코스 분석11,24에 대 한 라이브 셀의 유지 보수를 필요로 하는 다른 분석 결과 대 한 연구에 사용 되는 경작된 한 세포 수 . 이 연구 과정에서 그것은 지속적으로 교양된 선 및 단기 터미널 연구 AMs를 유지 하려고 했다 (< 수확 이후 30 일) 수행 했다. 따라서,이 방법에는 분명 한 한계는 특히 세포의 안정성에 장기적인 문화 데이터의 부족 (즉, 여부 유한 또는 연속 AMs 성장할 수 있는 선, cryoprotectants 하 cryopreservation, AMs의 응답 및 및/또는 genotypic phenotypic 변화) 지속적인 문화 후. AMs는 긴 생활 세포 vivo에서 그리고 변이의 어느 정도 건강 한 폐와 호흡기 감염 또는 염증 성 면역 응답을 받은 그를 격리 하는 세포 사이 예정 이다.
전반적으로, 방법 제시 여기 문서 분리, 특성화, 인간을 유지 하 고 마우스 AMs는 간단한 접근 방법 셀 문화 시스템. 이 프로토콜은 개별 실험 필요에 따라 추가 최적화 수 있습니다, 하지만 그것은 호흡기 질환과 폐 의학에 AMs의 기능적 관련성을 해 부하는 초보자의 프로토콜 역할 수 있습니다.

폐 microenvironment 정교한 공기 도관, 맥 관 구조는 고유 하 게 복잡 한 생태계 이다. 흡입된 공기 혈액 공기 가스 교환 발생 하는 위치는 폐 포에 도달 하기 전에 기관 그리고 기관지 및 bronchioles의 수많은 분 지를 통해 여행. 분위기와 직접 상호 작용을 인해 호흡기 표면 공 수 입자와 오염 물질의 잠재적으로 유해한 영향 으로부터 보호를 요구 한다. 다양 한 물리, 화학, 및 면역학 장벽 폐를 보호합니다. 특히, 호흡기 표면에 phagocytes의 배포는 중요 한 첫 번째-라인 방어 시스템을 제공합니다. 치경 세포 (AMs)는 한 가지 유형의 폐 상주 식 세포, 그리고 그들은 폐 대 식 세포 수영장의 대부분을. 그들의 이름에서 알 수 있듯이, AMs 주로 치경 루멘에 지역화 하 고 지속적으로 주변 분위기를 샘플 하 고 치경 상피1와 통신 하는 무 셀으로 발생 합니다. 정상 상태 폐에서 치조 공간에서 식 세포의 95%는 AMs2, 염증, 감염, 또는 오염 물질에 만성 노출의 구성을 변경할 수 있습니다.
AMs 폐에 로컬 될 수 있는 함수 및/또는 조직의 중요성의 광범위에 참가 한다. 예를 들어 AMs는 개발 및 폐;의 최적의 기능에 필수적 면역 감시; 그리고 세포 파편, 병원 균와 흡입된 입자3,,45,,67의. AMs의 타겟된 고갈 호흡기 바이러스 및 박테리아4,8의 손상으로 알려져 있다. 식 세포와 폐 항상성의 첫 줄 수비수로 서 자신의 역할, 외 AMs 알려져 있습니다 T 도출에 세포를 항 원 제시 세포 면역9, 작동 potentiating intranasal 백신10 의 효능과 폐 이식11,12후 폐 제한 면역에 영향을 미치는. 오전 기능 결핍 폐 치조 proteinosis (PAP), 유전자 변이, 악성 종양 또는 감염 폐 계면 활성 제13,14의 손상 발생 조건에 연결 되었습니다. AMs의 이식 PAP 15,16의 처리를 위한 치료 방법으로 탐험 되 고 지금입니다.
AMs는 embryogenesis 동안 발생 하 고 인생을 통해 폐 순환 백혈구2,17로 대체 되 고 없이 유지 알려져 있습니다. 오전 매출의 다양 한 수준의 인플루엔자 바이러스4, myeloablative 조사18도에 노출에 의해 감염을 포함 하 여 특정 임상 상황에 보고 되었습니다 비록, 오전 회전율 homeostatic 폐에서 감지, 19, 그리고 나이20. AMs는 낮은 확산17,21를 통해 자기 갱신으로 하지만 일부 최근 연구 monocytes 혈관 내 폐 세포22,23 아래에서 인구를 야기할 수 있는 주장 하지만 이러한 새로 변환 된 폐 세포의 기능 실험 조건, 폐 질환에 정의 하 아직 있다. 또한, 폐 염증 신호 및 immunoregulatory 기계 사이 균형을 유지 하는 시도 잠재적으로 흥미로운 영역입니다 오전 활성화의 맥락에서 자극의 임계값을 이해.
면역 규칙의 손실 생리 또는 pathologic 변경 다양 한 임상 설정 (예: 호흡기 감염, 염증 성 폐 질환과 거리 폐 질환)에서 평가에 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, AMs는 지표 또는 폐 건강11,24의 심지어 결정 요인으로 점점 인식 된다. 현재, 수확, 특성화, 또는 인간 및 전 임상 murine 모델에서 유지 AMs 사용할 수 없는 통합된 프로토콜 있습니다. 오전 선구자 및 고기, 합의의 부족 및 상세한 방법론의 부재 폐 건강 및 질병에 오전의 해독 역할에서 주요 장애물이 있었다. 다음 프로토콜 최종 식별, 격리 및 생체 외에서 문화 전략을 크게 오전 동작의 이해를 전진 하 고 오전 대상으로 진단 및 치료 연구를 용이 하 게 제공 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="910">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Non-enzymatic cell dissociating solution</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">C5789</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Puralube Vet Ointment</td>
			<td style="width:223px;">Dechra</td>
			<td>620300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">22G Catheter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Terumo Medical Products</td>
			<td>SR-OX2225CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-0 Non-absorbable silk braided suture&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Kent Scientific</td>
			<td>SUT-15-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">21-031-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Fc block&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>12183018A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">b-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>M6250&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSAria II cell sorter&#160;</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:220px;">644832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketamine&#160; (Ketathesia)</td>
			<td style="width:223px;">Henry Schein</td>
			<td style="width:220px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine&#160; (AnaSed)</td>
			<td style="width:223px;">Akorn</td>
			<td style="width:220px;">139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liberase TL&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:220px;">5401020001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>AMPD1-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100&#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Human Fc block</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">HEPES</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">L-929 cell line</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC,&#160;CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T25 Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm culture dish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Millipore-Sigma</td>
			<td>CLS3261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">15 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:220px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">50 mL Conical tube&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSRFortessa cell analyzer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>657669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">FlowJo</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo</td>
			<td>v10.4</td>
			<td>Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>147709</td>
			<td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101228</td>
			<td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11c (Mouse)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565452</td>
			<td>Clone N418, BV 421 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-I-Ab (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>116420</td>
			<td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-F (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>562757</td>
			<td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Siglec-H (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>129605</td>
			<td>Clone 551, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-F4/80 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>123118</td>
			<td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-Ly-6C (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>128035</td>
			<td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD64 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>139311</td>
			<td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD24 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>563115</td>
			<td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD103 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td>745305</td>
			<td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD317 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>127015</td>
			<td>Clone 927, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CXCR1 (Mouse)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>149029</td>
			<td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD45 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>304017</td>
			<td>Clone HI30, AF488 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD11b (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-HLA-DR (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>307618</td>
			<td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD169 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>346008</td>
			<td>Clone 7-239, APC conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD206 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>321106</td>
			<td>Clone 15-2, PE conjugated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:301px;">Anti-CD163 (Human)</td>
			<td style="width:223px;">Biolegend</td>
			<td>333612</td>
			<td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages

치경 대 식 세포는 태아 근원의 말기 분화, 폐 상주 대 식 세포. 치경 대 식 세포는 그들의 긴 수명 및 폐 지역화 감염 및 염증 응답 뿐만 아니라 폐 개발 및 기능, 그들의 중요 한 역할에서 고유. 날짜 하려면, 식별, 격리, 및 인간과 쥐에서 치경 대 식 세포의 취급에 대 한 통합된 방법 존재 합니다. 이러한 메서드는 다양 한 실험 설정에서 이러한 중요 한 타고 난 면역 세포에 대 한 연구에 대 한 필요 하다. 쉽게 어떤 연구소에 의해 채택 될 수 있습니다, 여기에, 설명 하는 방법을 bronchoalveolar 게 액체 또는 폐 조직에서 치경 대 식 세포를 수확 하 고 그들 에 시험관을 유지 하는 간단한 접근 방법입니다. 치경 대 식 세포는 폐 포에 부착 세포로 주로 발생 하기 때문에이 방법의 초점은 수확 및 식별 하기 전에 그들을 dislodging에 있습니다. 폐는 매우 vascularized 기관 그리고 골수성과 림프 근원의 다양 한 셀 형식 서식, 상호 작용, 폐 microenvironment에 의해 좌우 된다. 여기 설명 된 표면 마커 집합을 사용 하 여 연구원 수를 쉽고 명확 하 게 다른 백혈구에서 치경 대 식 세포를 구별 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 그들을 정화. 여기 개발 문화 메서드 두 인간을 지원 하 고 치경 대 식 세포에 체 외 성장에 대 한 마우스 세포질이 고 분자 연구와 호환 됩니다.

흐름 cytometric 접근 마우스 AMs를 식별 하는 그림 1에 표시 됩니다. 이 표면 마커 다른 폐 상주 또는 폐에 침투 식 세포에서 AMs를 구별 하는 데 필요한 최소한의 분석을 포함 한다. 차동 분석은 긍정적으로 중간 세포, 수지상 세포, 호 중구, monocytes, 및 폐에서 발생 하는 monocyte 파생 된 폐 세포에서 AMs를 식별 해야 합니다. 표면 마커 다음 구성표 쉽게 구별이 세포 유형 서로 어디 AMs CD45는 채택 될 수 있다+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+-A+ b, f 4/80-, CD11b- ; 중간 대 식 세포 는 CD45+, CD11b+-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + 수지상 세포 는 CD45+, CD11b+, CD11c+-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + 수지상 세포 는 CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+-Ab +, CD11b-; Plasmacytoid Dendritic 셀 은 CD45+, CD317+, Siglec-+, Ly-6 C+-Ab-, 호 중구 는 CD45+, Ly-6 G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab-, C 광-6-, 및 Monocytes 는 CD45+, CD64+, C 광-6+,-Ab-. 강조 표시 (CD11c안녕 및 Siglec-F안녕) 빨강과 청록 (CD11c안녕, Siglec-Fint), 각각, 오전 인구 기존의 AMs (주요 인구) 및 monocyte 파생 된 폐 세포 (대표 작은 인구) 치조 공간에서 발생 하는. CD45 정렬 흐름+, CD11c안녕하세요, Siglec-F안녕하세요 셀 수익률 순화 마우스 AMs. 그림 2 에서는 정확한 식별 및 인간의 AMs의 격리에 필요한 세포 표면 마커를 보여 줍니다. 인간의 AMs CD45 되 고 긍정적으로 확인은+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, 및 CD206+ 발 세포, 그리고 흐름 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정렬 될 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57287/57287fig1.jpg"> 그림 1 : 마우스 AMs의 대표적인 흐름 cytometric 분석. (A) 마우스 폐 조직 단면도 (hematoxylin 및 오신)에 AMs의 해 부 위치. AMs는 화살표와 함께 표시 됩니다 그리고 눈금 막대 60 μ m. (B) 대표 cytometry 게이팅 마우스 발 셀에서 AMs를 식별 하는 전략. 샘플 셀 분석기에 의해 평가 했다 및 데이터 다운 샘플링 된 500 이벤트 비교 분석 소프트웨어. (CD11c안녕 및 Siglec-F안녕) 빨강과 청록 (CD11c안녕, Siglec-Fint), 각각, 기존의 AMs (주요 인구) 및 monocyte 파생 된 폐 세포 (작은 인구) 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57287/57287fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57287/57287fig2.jpg"> 그림 2 : 인간의 AMs의 대표적인 흐름 cytometric 분석. (A) 게이팅 인간의 폐 이식 받는 사람에서 발 액체에서 인간 AMs를 식별 하는 전략. (B) 문화의 7 일에서 인간의 AMs의 밝은 분야 현미경 사진. 눈금 막대는 400 μ m. <a href="/files/ftp_upload/57287/57287fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

23.4K 조회수.  St. Joseph's Hospital and Medical Center. 이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...