Agradecemos profesor Bin Chen, Dr. Yue Zhang y Kendy Hoang ayuda con la configuración del sistema de electroporación. Este trabajo fue financiado por becas del NIH y beneficio grupo de cáncer de Santa Cruz a Z.A.W.

Todos los procedimientos aquí descritos se realizaron conforme a las directrices y reglamentos de la institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de California Santa Cruz.
1. plásmido y preparación de herramientas
<ol><li>Para cada vejiga transfectar, preparar al menos 20 μl del plásmido de ADN (1 μg/μl).</li>
	<li>Añadir 1 μl de azul de tripano a 20 μl de solución de plásmido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipeta para mezclar bien.</li>
	<li>Autoclave de todo quirúrgico instrumentos y esterilizar el área de trabajo con etanol al 70%. Rocíe los instrumentos quirúrgicos y guantes con etanol al 70% con frecuencia o utilizar un esterilizador de bolas de cristal cuando realice los pasos siguientes para mantener condiciones estériles.</li>
</ol>2. anestesia Animal
<ol><li>Utilice un sistema de anestesia superior tabla para anestesiar el animal con isoflurano. Encienda el tanque de O2 y ajustar el flujómetro de oxígeno de 1 L/min.</li>
	<li>Colocar un ratón C57BL/6J femenino adulto en la cámara de inducción. Encender y ajustar el vaporizador de isoflurano al 3% para la inducción. El ratón debe estar en anestesia en 2 minutos administrar analgésico de la buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea al quitar el ratón de la cámara de inducción para la analgesia preventiva. Nota: En el presente Protocolo, ratones femeninos se utilizan, como son más fáciles de trabajar con durante la cateterización de la uretra. El protocolo también funciona para ratones machos, pero se necesita mucho cuidado al realizar el paso 3.</li>
	<li>Aplicar pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar la sequedad. Coloque el ratón anestesiado hacia arriba sobre una almohada con la nariz en el cono de nariz. Gire el interruptor de circuito de aire para dejar isoflurano a través del cono de nariz.</li>
	<li>Sujetar la cabeza y el cono de la nariz con cinta adhesiva. Ajustar el vaporizador de isoflurano al 2% para mantenimiento.</li>
	<li>Sujetar las extremidades con cinta adhesiva. Realizar pruebas del pellizco del dedo del pie para asegurarse de que el animal está en anestesia profunda y luego afeitarse la zona abdominal.</li>
</ol>3. orina agotamiento y lavado de vejiga
<ol><li>Aplique lubricante a la sonda (24G, longitud de 2,11 cm, diámetro externo de 0,045 cm) y asegúrese de que su superficie externa está cubierta totalmente.</li>
	<li>Inserte el catéter en la abertura de la uretra y empuje lentamente hasta llegar a la vejiga, momento en el que la orina debe salir a través del catéter. Presione suavemente el abdomen para ayudar a la disminución de la orina.<ol>
<li>Comprobar si el catéter se inserta correctamente en la vejiga observando automático orina salida. Evite puncionar la pared de la uretra y la vejiga y aplique lubricante varias veces si es necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Descartar la orina con una pipeta en un vaso de residuos.</li>
	<li>Pipetear 80 μl de tampón fosfato salino (PBS) en el extremo externo del catéter, con el otro extremo en la vejiga. Cuidadosamente coloque una jeringa de 1 mL a la sonda. Empuje suavemente la jeringa para inyectar el PBS de la vejiga. Deje algunos PBS en el catéter para evitar la creación de burbujas de aire en la vejiga.</li>
	<li>Quite la jeringa. Esperar para que PBS drenar fuera de la vejiga. Presione suavemente el abdomen para evacuar a PBS.</li>
	<li>Descartar el PBS en el catéter con una pipeta en el vaso de residuos.</li>
	<li>Repita dos veces más PBS lavado (pasos 3.4-3.6). Nota: Es fundamental trabajar suavemente durante estos pasos de lavado. Sangre en el catéter o el fracaso de automático hacia fuera-flujo de líquido indica generalmente la uretra se perfora a través. También es importante evitar la introducción de burbujas de aire, ya que reducirá la eficacia de la electroporación.</li>
</ol>4. plásmido entrega
<ol><li>Etanol al 70% se aplica al abdomen de ratón y utilizar un bisturí para hacer una incisión vertical de 1 cm para abrir la piel abdominal sobre la vejiga.</li>
	<li>Pipeta de al menos 20 μl del plásmido más solución de azul de tripano en el extremo externo del catéter y conecte la jeringa.</li>
	<li>Inyecte la solución de plásmido en la vejiga. Si la vejiga se vuelve azul, la inyección es exitosa. Deje un poco de líquido en el catéter para evitar la creación de burbujas de aire en la vejiga.</li>
	<li>Agarrar el orificio uretral externo con unas pinzas y retire el catéter y la jeringa. Utilice una cuerda para apretar el orificio uretral externo. Hacer dos lazos con la cadena y luego atar con dos nudos. Nota: Estrechamiento de la uretra es importante para la prevención de retroflujo de líquido de plásmido.</li>
	<li>Encienda el generador de electroporación con los siguientes parámetros: 33V, 50 ms tiempo de trabajo y 950 ms tiempo.</li>
	<li>Mantenga la vejiga con las pinzas y pellizcar la vejiga con dos electrodos. Empuje el pedal de pie para llevar a cabo la electroporación. Nota: Los impulsos eléctricos se establecen se produzca 5 veces con intervalos cortos después de cada pulsación del pedal. El ratón puede twitch en este proceso. Empujar el pedal más de una vez puede aumentar la eficiencia de la entrega, pero demasiados impulsos eléctricos pueden dañar la integridad del tejido del urothelium.<ol>
<li>Evite cualquier contacto entre las pinzas y los electrodos, ya que esto va a generar una chispa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. recuperación
<ol><li>La sutura la abertura abdominal y piel con sutura quirúrgica estéril y clips. Aplicar yodo en la herida.</li>
	<li>Eliminar el animal en el sistema de isoflurano. Administrar el analgésico de la buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea para aliviar el dolor post-surgical.</li>
	<li>Mantener el animal en la almohada y volver a la jaula casera después de la recuperación completa. Compruebe el animal al menos una vez al día para la movilidad normal, beber y la alimentación comportamientos y no hay signos de infección hasta que la incisión haya sanado y luego retire los clips. Administrar las inyecciones subsecuentes de buprenorfina analgésico si el animal muestra síntomas de dolor tales como reducir la preparación, mayor agresividad y vocalización.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research.">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li><li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR/Cas9+system.">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li><li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver.">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li><li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing.">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li><li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis.">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice.">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li><li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium.">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li><li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier.">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer.">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li><li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents.">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+technologies+for+medicine:+principles,+applications,+and+challenges.">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

Los autores no declaran intereses que compiten.

La electroporación aumenta la permeabilidad de la membrana de la célula y es una poderosa tecnología para gene i16. Entrega del gene en roedores vivos por la electroporación se ha utilizado con frecuencia en Neurobiología campos17,18,19,20,21. Sus posibles aplicaciones en muchos otros órganos no se han explorado extensivamente. A ...

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) han estado jugando un papel esencial en la expansión de nuestro conocimiento sobre el desarrollo animal, gene funciones en vivoy los mecanismos de progresión de la enfermedad1,2. Del germline GEMMs tradicionalmente se desarrollan de dos formas. La primera es la creación de ratones transgénicos mediante inyección pronuclear del plásmido de ADN seguida por el trasplante de cigotos en las hembras seudopreñadas. El otro es la generación de ratones knock-out/knock-in por la recombinación homóloga en células madre embrionarias y el desarrollo de quimeras. Condicional knockout de genes en un tipo específico de tejido o células de interés consiste en la cría de alelos genéticamente con Cre y flox para varias generaciones. Todo el proceso puede ser costoso y desperdiciador de tiempo, especialmente si el objetivo es atacar múltiples genes tejido específica. Recientemente, se han aplicado tecnologías de edición de gene como clusters regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) a varios órganos de los ratones para inducir alteraciones genéticas específicas de tejido para el cáncer autóctono modelado3, 4,5,6,7 o mutaciones de la enfermedad correcta en situ8,9. En estos estudios, la entrega de los vectores de gRNA generalmente se logra a través de infección adenoviral o lentivirales del órgano o hidrodinámica inyección en la vena de la cola. La relativa facilidad de la entrega de los componentes CRISPR para el pulmón y el hígado ha mejorado la comodidad y eficiencia de cáncer en estos órganos en comparación con los modelos tradicionales de ratón basado en Cre-Lox.
El urotelio de la vejiga es donde se originan la mayoría los tumores de vejiga. La entrega de vectores de DNA en el urotelio de la vejiga para terapia de modelado o gen del cáncer se ve entorpecida por una capa de glicosaminoglicanos de la superficie urotelial apical, que actúa como una barrera para la adherencia del virus infeccioso10,11. Varios agentes pretratamiento Syn3 como dodecil-β-d-maltoside se han utilizado para interrumpir esta barrera y mejorar adenovirus Infección eficiencia12,13,14. No se ha divulgado si virus adeno-asociados (AAVs) efectivamente pueden infectar la vejiga. En general, un método basado no sería deseable. Aquí, describimos un nuevo método desarrollado en el laboratorio para la eficiente entrega de plásmido de ADN en el urotelio de ratón a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Porque nuestro enfoque no implica pretratamiento químico de la capa de glicosaminoglicanos o producción del virus, significativamente simplifica la entrega de plásmidos de ADN en el urotelio de la vejiga de ratón y debe facilitar varios estudios en vivo de enfermedades de la vejiga.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB Syringe</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K&amp;amp;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Cover the heat mat with paper towels</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &amp;micro;L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmid CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platinum tweezertrode 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm diameter</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>String cord</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td></tr><tr><td>Tape, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td><td>PBS animal health</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Table top system anesthesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violet suture 18&quot; FS-2 cutting 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip applier</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) son extremadamente valiosos en revelar nuevos biológicos penetraciones en los mecanismos de iniciación y progresión de enfermedades como el cáncer. Ratones transgénicos y condicional knockout se han utilizado con frecuencia para la sobreexpresión del gen o la ablación de tejidos específicos o tipos en vivo. Sin embargo, generación de modelos de línea germinal del ratón puede ser lentas y costosas. Los avances recientes en gene de la edición de tecnologías y la factibilidad de entrega de plásmidos de ADN por infección viral han permitido la rápida generación de germline no autóctonas ratón cáncer modelos para varios órganos. La vejiga es un órgano que ha sido difícil para vectores virales acceder, debido a la presencia de una capa de glicosaminoglicanos cubriendo el urotelio. Aquí, describimos un nuevo método desarrollado en el laboratorio para la eficiente entrega de plásmidos de ADN en el ratón vesical urotelio en vivo. A través de la instilación intravesical de plásmido de DNA pCAG-GFP y electroporación de vejiga quirúrgico expuesta, mostramos que el plásmido de ADN puede ser entregado específicamente en las células uroteliales de vejiga de expresión transitoria. Nuestro método proporciona una manera rápida y conveniente para la sobreexpresión y knockdown de genes en la vejiga de ratón y puede aplicarse a la construcción de GEMMs de cáncer de vejiga y otras enfermedades urológicas.

Para demostrar el éxito de la entrega del gene en el urotelio de la vejiga, se utilizó el plásmido de15 pCAG-GFP para la electroporación. 20 μl de solución de azul de tripano y plásmido fue inyectado a través de la uretra y se administraron 5 pulsos eléctricos. Después de 48 h, diseca la vejiga de ratón y observaron manchas de fluorescencia de GFP bajo el microscopio de fluorescencia de la disección, mientras que un negativo control de vejiga que no se ...

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Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.

Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

novel-method-plasmid-dna-delivery-to-mouse-bladder-urothelium

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K vistas.  University of California, Santa Cruz. Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.

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Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Investigación

Neurociencias

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un modelo ortotópico de cáncer de vejiga de Estudios de liberación de genes

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Medicina

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Neonatal electroporación superficie pial

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

En Vivo microinyección y electroporación del mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Biología

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Electroporación del ADN plásmido en el músculo esquelético del ratón

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense and transmit information about its environment to the underlying tissues, promoting voiding function and behavior. Disruption of the urothelial barrier, or its sensory/transducer function, can lead to disease. Studying these complex events is hampered by lack of simple strategies to alter gene and protein expression in the urothelium. Methods are described here that allow investigators to generate large amounts of high-titer adenovirus, which can then be used to transduce rodent urothelium with high efficiency, and in a relatively straightforward manner. Both cDNAs and small interfering RNAs can be expressed using adenoviral transduction, and the impact of transgene expression on urothelial function can be assessed 12 h to several days later. These methods have broad applicability to studies of normal and abnormal urothelial biology using mouse or rat animal models.

Methods are described for the generation of large amounts of recombinant adenoviruses, which can then be used to transduce the native rodent urothelium allowing for expression of transgenes or downregulation of endogenous gene products.

Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Electroporation-Mediated In Vitro Gene Delivery: An Electric Pulse Technique to Introduce Fluorescent Reporter Protein-Encoding Plasmids Into Cultured Cells

Source: Lo, J. C. W. et al., <a href="https://www.jove.com/v/63283">Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2021)
This video demonstrates the electroporation technique that introduces fluorescent protein-encoding plasmid DNA into mouse primary cerebellar granule cell precursors.

Entrega de genes in vitro mediada por electroporación: una técnica de pulso eléctrico para introducir plásmidos fluorescentes que codifican proteínas reporteras en células cultivadas

Source: Lo, J. C. W. et al., Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Técnicas biológicas

Gene Transfer Techniques

Transfection

Urine Depletion and Bladder Rinsing in Mouse Model: A Catheter-based Procedure to Empty and Wash Murine Urinary Bladder

Source: Yu, C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe a catheter-based procedure to empty and rinse the urinary bladder of a mouse model. The prepped mouse can then be used for further experimental procedures.

Depleción de orina y enjuague de la vejiga en un modelo de ratón: un procedimiento basado en catéter para vaciar y lavar la vejiga urinaria murina

Source: Yu, C. et al. Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe ...

Investigación sobre el cáncer

Urinary Tract Cancer

In vivo studies

Delivery of DNA Plasmids into Urothelium of Mouse Bladder: An Electroporation-based Procedure to Efficiently Deliver DNA Plasmids into Urothelial Cells of Murine Bladder to Generate Genetically Engineered Models

Source: Chuan, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation.</a> J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video demonstrates the delivery of DNA plasmid into the urothelium of the mouse bladder using a combination of urethral catheterization and electroporation techniques. The described procedure allows the generation of mouse bladder cancer models.

Entrega de plásmidos de ADN en urotelio de vejiga de ratón: un procedimiento basado en electroporación para administrar de manera eficiente plásmidos de ADN en células uroteliales de vejiga murina para generar modelos de ingeniería genética

Source: Chuan, Y. et al. Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation. J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

Source: Woodard, L. E. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56324" target="_blank">Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

Inyección hidrodinámica de pelvis renal: una técnica para administrar directamente el ADN a las células renales de un modelo murino

Source: Woodard, L. E. et al. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, ...