Name: novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation at JoVE.com

Biz Profesör Bin Chen, Dr Yue Zhang ve Kendy Hoang elektroporasyon sistemi kurma konusunda yardım için teşekkür ederim. Bu iş Z.A.W. için Santa Cruz kanser fayda grubu ve NIH gelen hibe tarafından desteklenmiştir

Burada açıklanan tüm yordamları kurallar ve düzenlemeler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Kaliforniya Üniversitesi Santa Cruz uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Plazmid ve araçları hazırlama
<ol><li>Her mesane transfect, DNA plazmid (1 µg/µL) en az 20 µL hazırlamak.</li>
	<li>Trypan mavi 1 µL plazmid çözüm 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde 20 µL ekleyin. Pipet iyice karıştırın.</li>
	<li>Otoklav tüm cerrahi aletleri ve çalışma alanı % 70 etanol ile sterilize. Cerrahi aletler ve eldiven % 70 etanol ile sık sık sprey veya cam boncuk Sterilizatör steril koşullar korumak için aşağıdaki adımları yerine getirirken kullanın.</li>
</ol>2. anaesthetizing hayvan
<ol><li>Bir tablosu üst anestezi sistemi isoflurane hayvanla anestezi için kullanın. O2 tankındaki açmak ve oksijen akış ölçer 1 L/dk ayarlayın.</li>
	<li>Yetişkin bir kadın C57BL/6J fare indüksiyon odasına koyun. Açmak ve indüksiyon için % 3 isoflurane Buharlaştırıcı ayarlayın. Fare anestezi 2 dk. Yönet buprenorfin analjezik (0.1 mg/kg) içinde subkutan indüksiyon odası preemptive analjezi için fareden kaldırılması üzerine olmalıdır. Not: İdrar Kateterizasyon sırasında çalışmak daha kolay olduğu gibi bu protokol için dişi fareler, kullanılır. İletişim kuralı da erkek fareler için çalışır ama ekstra dikkatli adım 3 gerçekleştirirken gereklidir.</li>
	<li>Oftalmik merhem kuruluğu önlemek için hayvan gözler için geçerlidir. Anaesthetized fareyi onun burun burun koni ile bir Isıtma yastık üzerinde yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Burun konisi git isoflurane izin hava devre anahtarı çevir.</li>
	<li>Baş ve yapışkan bant ile burun konisi dizginlemek. Bakım için % 2 isoflurane Buharlaştırıcı ayarlayın.</li>
	<li>Yapışkan bant ile bacaklarda dizginlemek. Belgili tanımlık hayvan içinde derin anestezi ve karın bölgesi tıraş emin olmak için ayak-çimdik sınamaları gerçekleştirin.</li>
</ol>3. idrar tükenmesi ve mesane durulama
<ol><li>Yağ kateter (24 G, 2.11 cm uzunluğunda, 0,045 cm dış çapı) uygulamak ve dış yüzeyi tamamen kaplıdır sağlamak.</li>
	<li>Kateter üretra ataşını ve hangi zamanda idrar dışarı kateter akışı gerekir mesane ulaşıncaya kadar yavaşça itin. İdrar tükenmesi yardımcı olmak için karın hafifçe bastırın.<ol>
<li>Kateter doğru mesane otomatik idrar dışarı akışı gözlemleyerek eklenir eğer kontrol edin. Üretra ve mesane duvarı piercing önlemek ve yağ gerekirse birden çok kez uygulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir pipet ile idrar atık kabı atın.</li>
	<li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) 80 µL pipet ile diğer sonunda hala mesane kateter dış ucunu. Dikkatle 1 mL şırınga için kateter takın. PBS mesane enjekte etmek şırıngayı yavaşça itin. Bazı PBS hava kabarcıkları mesane oluşturmaktan kaçınmak için kateter bırakın.</li>
	<li>Şırınga kaldırın. PBS dışarı mesane boşaltmak bekleyin. PBS boşaltmaya karın hafifçe bastırın.</li>
	<li>Sonda bir pipet ile PBS atık kabı atın.</li>
	<li>(Adım 3.4-3.6) yıkama PBS iki kez daha tekrarlayın. Not: Hafifçe çamaşır adımları sırasında çalışması için önemlidir. Kateter veya başarısızlık otomatik kan dışı sıvı akımı genellikle üretra yoluyla deldi gösterir. Elektroporasyon verimliliği düşecektir olarak da hava kabarcıkları, tanıtımı önlemek önemlidir.</li>
</ol>4. plazmid teslim
<ol><li>Fare karın % 70 etanol uygulayabilir ve neşter yukarıda mesane karın cildi açmak için 1 cm dikey kesi yapmak için kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Plazmid artı Trypan mavi çözüm en az 20 µL kateter dış ucunu pipet ve şırınga ekleyebilirsiniz.</li>
	<li>Plazmid çözüm mesane enjekte. Mesane onaylamasına enjeksiyon başarılı olur. Bazı sıvı hava kabarcıkları mesane oluşturmaktan kaçınmak için kateter bırakın.</li>
	<li>Cımbız kullanarak dış üretral orifis kapmak ve kateter ve şırınga kaldırın. Dış üretral orifis sıkmak için bir dize kullanın. Dize içeren iki döngüler yapmak ve sonra ile iki knot kravat. Not: üretral sıkma plazmid sıvı geri tepme önlemek için önemlidir.</li>
	<li>Elektroporasyon generator aşağıdaki parametreleri ile açın: 33V, 50 ms çalışma zamanı ve 950 ms aralığı zaman.</li>
	<li>Mesane cımbızla tutup da iki elektrot ile mesane çimdik. Elektroporasyon gerçekleştirmek için ayak pedalı itmek. Not: Elektrik darbeleri ile 5 kere kısa aralıklarla her pedal itme sonra gerçekleşmesi için ayarlanır. Fare bu süreçte seğirmesine neden. Birden çok kez ayak pedalı itmek teslim verimliliği artırabilir, ancak çok fazla elektrik darbeleri urothelium doku bütünlüğü zarar verebilir.<ol>
<li>Bu bir kıvılcım oluşturur cımbız ve elektrotlar arasında herhangi bir temas önlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. kurtarma
<ol><li>Steril cerrahi sütür ve klipleri ile karın ve cilt açılış dikiş. İyot yaranın üzerine uygulayın.</li>
	<li>Hayvan isoflurane sisteminizden kaldırın. Subkutan ameliyat sonrası ağrı hafifletmek için buprenorfin analjezik (0.1 mg/kg) yönetmek için.</li>
	<li>Hayvan Isıtma yastığını üzerinde tutun ve sonra tam kurtarma ev kafese geri. İçin içme ve belgili tanımlık kesme iyileşti ve küçük resimleri kaldırmak kadar beslenme davranışları ve enfeksiyon belirtisi yok en az bir kez her gün normal hareket eden, hayvan kontrol edin. Hayvan acı belirti azaltılmış damat, artan saldırganlık ve konser gibi görüntüler, sonraki buprenorfin analjezik enjeksiyonlari yönetmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research.">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li><li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR/Cas9+system.">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li><li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver.">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li><li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing.">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li><li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis.">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice.">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li><li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium.">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li><li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier.">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer.">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li><li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents.">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+technologies+for+medicine:+principles,+applications,+and+challenges.">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

Yazarlar rakip ilgi bildirin.

Elektroporasyon hücre membran geçirgenliği artırır ve gen electrotransfer16için güçlü bir teknolojidir. Gen teslim yaşam kemirgenler tarafından elektroporasyon içine Nörobiyoloji alanları17,18,19,20,21' sık kullanılan. Onun potansiyel uygulamalar birçok diğer organlarda kapsamlı bir şekilde araştırılmalıdır değ...

Genetiği fare modelleri (GEMMs) hayvan geliştirme, gen fonksiyonları vivo içindeve mekanizmaları hastalık ilerleme1,2hakkında bilgimizi genişletmek önemli bir rol oynuyor. Germline GEMMs geleneksel olarak iki şekilde geliştirilmiştir. İlk DNA plazmid pseudopregnant kadın zigotları nakli tarafından takip pronuclear enjeksiyonla transgenik fareler oluşturulmasıdır. Diğer knock-out/knock-gelen fareler tarafından homolog rekombinasyon embriyonik kök hücre üretimi ve chimeras gelişimi bu. Genlerin ilgi belirli doku veya hücre türü koşullu nakavt Cre ve flox siteleri ile genetik allelleri üreme birden çok nesiller için içerir. Kül oluşum-ebilmek var olmak pahalı ve zaman alıcı, özellikle hedef doku-özellikle birden çok gen hedef için ise. Son zamanlarda, gen düzenleme teknolojileri kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) gibi çeşitli organlarda doku özgü genetik değişiklikler otokton kanseri3modelleme için ikna etmek için farelerin uygulanmış olan, 4,5,6,7 veya doğru hastalık mutasyonlar in situ8,9. Bu çalışmalarda gRNA vektörler teslimini genellikle adenoviral veya lentiviral enfeksiyonu organ veya hidrodinamik kuyruk-damar enjeksiyon elde edildi. Akciğer ve karaciğer için CRISPR bileşenlerinin teslimatlar göreli kolaylığı büyük ölçüde kolaylık ve geleneksel Cre-Lox göre fare modellerle karşılaştırıldığında bu organlarda modelleme kanser verimliliği iyileşmiştir.
Mesane urothelium nereden köken çoğu mesane tümörleri var. Mesane urothelium kanser modelleme veya gen tedavisi için DNA vektörel çizimler teslimini glikozaminoglikan katmanı apikal ürotelyal yüzeyinde, bulaşıcı virüs10,11bağlılık için bir engel olarak engel oluyor. Syn3 ve lauryl-β-d-maltoside gibi birkaç tedavi öncesi Aracısı bu bariyer bozabilir ve adenovirus enfeksiyonu verimliliği12,13,14geliştirmek için kullanılmaktadır. Olup olmadığını virüs (AAVs) Adeno ilişkili etkin bir şekilde-ebilmek bulaştırmak mesane bildirilmemiştir. Genel olarak, bir viral tabanlı teslimat yöntemi arzu olurdu. Burada, verimli DNA plazmid teslim edilmek üzere fare urothelium İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon Laboratuarında geliştirilmiş bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Yaklaşımımız kimyasal Önarıtma glikozaminoglikan katman veya virüs üretim anlamına gelmez çünkü o önemli ölçüde DNA plazmid teslim fare mesane urothelium içine kolaylaştırır ve çeşitli in vivo çalışmalar kolaylaştırmak gerektiğini Mesane hastalıkları.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB Syringe</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K&amp;amp;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Cover the heat mat with paper towels</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &amp;micro;L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmid CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platinum tweezertrode 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm diameter</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>String cord</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td></tr><tr><td>Tape, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td><td>PBS animal health</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Table top system anesthesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violet suture 18&quot; FS-2 cutting 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip applier</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

Genetiği fare modelleri (GEMMs) insan hastalıkları kanser gibi başlama ve ilerleme mekanizmalarının içine roman biyolojik anlayışlar ortaya son derece değerlidir. Transgenik ve koşullu nakavt fareler sık gen overexpression için kullanılmış olan veya ablasyon belirli doku veya hücre içinde vivotürleri. Ancak, germline fare modelleri oluşturma zaman alıcı ve pahalı olabilir. Gen teknolojileri ve DNA plazmid tarafından viral enfeksiyon teslim fizibilite düzenleme son gelişmeler hızlı oluşturulmasında çeşitli organları germline sigara otokton fare kanser modelleri etkinleştirdiniz. Mesane urothelium kapsayan bir glikozaminoglikan katman varlığı nedeniyle erişmeye viral vektörler için zor olan bir organdır. Burada, laboratuar DNA plazmid verimli bir şekilde teslim içine fare mesane urothelium içinde vivoiçin geliştirilen bir roman yöntemi açıklanmaktadır. PCAG-GFP DNA plazmid İntravezikal korumak ve cerrahi olarak maruz mesane çoğalmasıyla, DNA plazmid geçici ifade için mesane ürotelyal hücre içine özellikle teslim olduğunu göster. Bizim yöntem overexpression ve fare mesane genlerin nakavt için hızlı ve uygun bir yol sağlar ve GEMMs mesane kanseri ve diğer üroloji hastalıkları bina için uygulanabilir.

Gen teslim mesane urothelium içine başarı göstermek için biz pCAG-GFP15 plazmid elektroporasyon için kullanılır. Plazmid ve Trypan mavi çözüm 20 µL üretra enjekte ettiler ve 5 elektrik darbeleri idare. 48 h sonra fare mesane disseke ve negatif kontrol ise GFP sinyal (şekil 1A) gösterdi elektroporasyon geçmesi değil mesane GFP floresan bir diseksiyon floresan mikroskop altında yamalari gözlendi. Cytokeratin (CK) 5, CK...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation at JoVE.com

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.

Plazmid DNA teslimat için fare mesane Urothelium elektroporasyon tarafından roman yöntemi

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

novel-method-plasmid-dna-delivery-to-mouse-bladder-urothelium

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Görüntüleme.  University of California, Santa Cruz. Biz'DNA plazmid dır fare mesane vivo içinde İdrar Kateterizasyon ve elektroporasyon ürotelyal hücre içine bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Kesesi hastalıkları otokton fare modelleri oluşturmak için hızlı ve kolay bir yol sunar.

Video: Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Nörobilim

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Tıp

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Yenidoğan Pial Yüzey Elektroporasyon

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Biyoloji

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Plazmid DNA'sının Fare İskelet Kasına Elektroporasyonu

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense and transmit information about its environment to the underlying tissues, promoting voiding function and behavior. Disruption of the urothelial barrier, or its sensory/transducer function, can lead to disease. Studying these complex events is hampered by lack of simple strategies to alter gene and protein expression in the urothelium. Methods are described here that allow investigators to generate large amounts of high-titer adenovirus, which can then be used to transduce rodent urothelium with high efficiency, and in a relatively straightforward manner. Both cDNAs and small interfering RNAs can be expressed using adenoviral transduction, and the impact of transgene expression on urothelial function can be assessed 12 h to several days later. These methods have broad applicability to studies of normal and abnormal urothelial biology using mouse or rat animal models.

Methods are described for the generation of large amounts of recombinant adenoviruses, which can then be used to transduce the native rodent urothelium allowing for expression of transgenes or downregulation of endogenous gene products.

Adenovirüs Aracılı Transdüksiyon Kullanılarak Doğal Mesane Urothelyumunda Transgenlerin Ekspresyonu

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Electroporation-Mediated In Vitro Gene Delivery: An Electric Pulse Technique to Introduce Fluorescent Reporter Protein-Encoding Plasmids Into Cultured Cells

Source: Lo, J. C. W. et al., <a href="https://www.jove.com/v/63283">Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2021)
This video demonstrates the electroporation technique that introduces fluorescent protein-encoding plasmid DNA into mouse primary cerebellar granule cell precursors.

Elektroporasyon Aracılı İn Vitro Gen İletimi: Floresan Raportör Protein Kodlayan Plazmitleri Kültürlenmiş Hücrelere Sokmak İçin Bir Elektrik Darbe Tekniği

Source: Lo, J. C. W. et al., Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Gen Transfer Teknikleri

Transfeksiyon

Urine Depletion and Bladder Rinsing in Mouse Model: A Catheter-based Procedure to Empty and Wash Murine Urinary Bladder

Source: Yu, C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe a catheter-based procedure to empty and rinse the urinary bladder of a mouse model. The prepped mouse can then be used for further experimental procedures.

Fare Modelinde İdrar Tükenmesi ve Mesane Durulama: Murin İdrar Kesesini Boşaltmak ve Yıkamak İçin Kateter Tabanlı Bir Prosedür

Source: Yu, C. et al. Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe ...

Kanser Araştırmaları

İdrar Yolu Kanseri

İn vivo çalışmalar

Delivery of DNA Plasmids into Urothelium of Mouse Bladder: An Electroporation-based Procedure to Efficiently Deliver DNA Plasmids into Urothelial Cells of Murine Bladder to Generate Genetically Engineered Models

Source: Chuan, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation.</a> J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video demonstrates the delivery of DNA plasmid into the urothelium of the mouse bladder using a combination of urethral catheterization and electroporation techniques. The described procedure allows the generation of mouse bladder cancer models.

DNA Plazmitlerinin Fare Mesanesinin Urothelium'una Verilmesi: Genetik Olarak Tasarlanmış Modeller Oluşturmak için DNA Plazmitlerini Murin Mesanesinin Ürotelyal Hücrelerine Verimli Bir Şekilde Vermek İçin Elektroporasyon Tabanlı Bir Prosedür

Source: Chuan, Y. et al. Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation. J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

Source: Woodard, L. E. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56324" target="_blank">Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

Hidrodinamik Renal Pelvis Enjeksiyonu: DNA'yı Murin Modelinin Böbrek Hücrelerine Doğrudan Verme Tekniği

Source: Woodard, L. E. et al. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, ...