Name: novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation at JoVE.com

אנו מודים חן סל פרופסור דוקטור יואה ג'אנג, Kendy הואנג לקבלת עזרה בהתקנת מערכת אלקטרופורציה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן סנטה קרוז סרטן לטובת קבוצה NIH Z.A.W.

כל ההליכים המתוארים כאן בוצעו בהתאם הנחיות והתקנות מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה בסנטה קרוז.
1. פלסמיד והכנת כלים
<ol><li>עבור כל שלפוחית השתן transfect, להכין µL לפחות עשרים של הדנ א פלסמיד (µg 1/µL).</li>
	<li>להוסיף 1 µL של Trypan Blue µL 20 של פתרון פלסמיד צינור microcentrifuge 1.5 mL. פיפטה לערבב היטב.</li>
	<li>אוטוקלב כירורגי כל כלים ולחטא את סביבת העבודה עם 70% אתנול. לרסס סטריליים, כפפות עם אתנול 70% בתדירות גבוהה או להשתמש מעקר חרוז זכוכית בעת ביצוע השלבים הבאים כדי לשמור על תנאים סטריליים.</li>
</ol>2. anaesthetizing בעלי חיים
<ol><li>השתמש מערכת הרדמה בראש הטבלה כדי עזים ומתנגד החיה עם איזופלוריין. להפעיל את הטנק2 O ולהתאים את זרימה חמצן כדי 1 ליטר/דקה.</li>
	<li>המקום העכבר C57BL/6J הנשי למבוגרים בבית הבליעה אינדוקציה. הפעל והתאם את מאדה איזופלוריין 3% עבור אינדוקציה. העכבר צריך להיות בהרדמה תוך 2 דק מנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously על ההסרה של העכבר מן החדר אינדוקציה על שיכוך כאבים מונעת. הערה: פרוטוקול זה, נקבה עכברים משמשים, כפי שהם יותר קל לעבוד עם במהלך צנתור השופכה. הפרוטוקול פועל גם על עכברים זכר, אך נדרש לנקוט משנה זהירות בעת ביצוע שלב 3.</li>
	<li>משחה אופטלמולוגיות חלות על העיניים של החיה למניעת יובש. הנח את העכבר anaesthetized פונה כלפי מעלה על משטח חימום עם האף שלה בקונוס האף. תלחץ על המתג מעגל אוויר כדי לאפשר איזופלוריין לעבור את חרוט האף.</li>
	<li>לרסן את הראש והחרוט האף עם דבק. התאם את מאדה איזופלוריין ל-2% לצורך תחזוקה.</li>
	<li>לרסן את הגפיים עם דבק. לבצע הבוהן-קמצוץ בדיקות כדי לוודא החיה בהרדמה עמוקה, ואז מגלחים את אזור הבטן.</li>
</ol>3. שתן דלדול ושטיפה שלפוחית השתן
<ol><li>חלות סיכה הקטטר (G 24, אורך של 2.11 ס"מ, הקוטר החיצוני של ס"מ 0.045) ולהבטיח כי השטח החיצוני שלה מכוסה.</li>
	<li>הכנס את הצנתר לתוך הפתח השופכה, לאט לדחוף אותו עד שהוא מגיע שלפוחית השתן, ובו בזמן השתן צריך לזרום החוצה דרך הקטטר. לחץ בעדינות את הבטן כדי לסייע דלדול שתן.<ol>
<li>בדוק אם הצנתר הוכנס לתוך שלפוחית השתן על ידי התבוננות שתן אוטומטיים יותר זורם. להימנע פירסינג הקיר שופכה ושלפוחית ולהחיל סיכה מספר פעמים במידת הצורך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למחוק את השתן עם פיפטה לתוך גביע פסולת.</li>
	<li>פיפטה µL 80 תמיסת פוספט buffered (PBS) אל הקצה החיצוני של הקטטר, בקצהו השני עדיין בשלפוחית. בזהירות לצרף מזרק 1 מ"ל הצנתר. דחף בעדינות את המזרק כדי להזריק את החינוכית לתוך שלפוחית השתן. להשאיר קצת PBS הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.</li>
	<li>הסר את המזרק. המתן PBS לנקז החוצה שלפוחית השתן. לחץ בעדינות את הבטן לפנות PBS.</li>
	<li>למחוק את PBS הקטטר עם פיפטה לתוך כשהספל פסולת.</li>
	<li>חזור על PBS שטיפה (שלבים 3.4-3.6) עוד פעמיים. הערה: זה חיוני כדי לעבוד בעדינות במהלך השלבים כביסה. דם קטטר או כשל אוטומטי מחוץ זרימה של נוזל בדרך כלל מצביע על השופכה היא חדרה מבעד. חשוב גם להימנע היכרות עם בועות אוויר, כפי שהם יקטין את היעילות אלקטרופורציה.</li>
</ol>4. פלסמיד משלוח
<ol><li>להחיל 70% אתנול בבטן בעכבר ולהשתמש אזמל לעשות חתך אנכי של 1 ס מ כדי לפתוח את העור בבטן מעל שלפוחית השתן.</li>
	<li>פיפטה µL לפחות עשרים של פלסמיד בתוספת Trypan Blue פתרון אל הקצה החיצוני של הקטטר, ולצרף את המזרק.</li>
	<li>להזריק את הפתרון פלסמיד לתוך שלפוחית השתן. אם שלפוחית השתן הופך לכחול, הזריקה הוא מוצלח. יוצאים נוזל הקטטר כדי להימנע מיצירת בועות אוויר בתוך שלפוחית השתן.</li>
	<li>. תפוס את פתח השופכה חיצוני באמצעות פינצטה ולאחר מכן הסר את הקטטר ואת המזרק. להשתמש במחרוזת כדי להדק את פתח השופכה חיצוניים. להפוך את שתי לולאות עם המחרוזת, ואז לקשור עם שני קשרים. הערה: הידוק של השופכה חשוב למניעת זרם אחורי של נוזל פלסמיד.</li>
	<li>להפעיל את הגנרטור אלקטרופורציה עם הפרמטרים הבאים: 33V, 50 מילישניות זמן עבודה, ו- 950 ms מרווח הזמן.</li>
	<li>להחזיק את השלפוחית עם פינצטה וצבטתי את השלפוחית עם שתי אלקטרודות. ללחוץ על דוושת רגל כדי לבצע את אלקטרופורציה. הערה: פולסים חשמליים מוגדרים יכולה להופיע 5 פעמים עם מרווחי זמן קצר לאחר כל דחיפה פדלים. העכבר עשוי להתעוות בתהליך זה. לוחץ על דוושת רגל יותר מפעם אחת יכול להגביר את היעילות המסירה, אך פולסים חשמליים רבים מדי עלולה לגרום נזק על urothelium שלמות רקמות.<ol>
<li>הימנע מכל מגע בין את הפינצטה האלקטרודות, כמו פעולה זו תיצור ניצוץ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. השבת
<ol><li>תפר פתיחת בטן, עור עם תפירה סטריליים, אטבים. החל יוד לתוך הפצע.</li>
	<li>הסר את החיה המערכת איזופלוריין. לנהל הבופרנורפין שיכוך כאב (0.1 מ"ג/ק"ג) subcutaneously כדי להקל על הכאב לאחר ניתוח.</li>
	<li>לשמור את החיה על כרית חימום ולהחזיר אותה לכלוב הביתה לאחר החלמה מלאה. בדוק את החיה לפחות פעם ביום לניידות נורמלי, השתייה והאכלת התנהגויות, אין סימנים לזיהום עד החתך נרפאה ולאחר מכן הסר את הקליפים. לנהל זריקות עוקבות של הבופרנורפין שיכוך כאב אם החיה מציגה סימפטום כאב כגון מופחתת לטפח, גדל תוקפנות, והניקוד.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research.">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li><li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR/Cas9+system.">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li><li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver.">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li><li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing.">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li><li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis.">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype.">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice.">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li><li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium.">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li><li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier.">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li><li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium.">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li><li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer.">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li><li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents.">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+technologies+for+medicine:+principles,+applications,+and+challenges.">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

המחברים מצהירים שום עניין מתחרות.

אלקטרופורציה משפר את חדירות קרום התא, טכנולוגיה רבת עוצמה עבור ג'ין electrotransfer16. המסירה הגן לתוך החיים מכרסמים מאת אלקטרופורציה שימש לעתים קרובות נוירוביולוגיה שדות17,18,19,20,21. שלה יישומים א?...

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יש משחק תפקיד חיוני בהרחבת הידע שלנו על בעלי חיים, ג'ין פונקציות ויווופיתוח מנגנוני המחלה התקדמות1,2. Germline GEMMs מפותחים באופן מסורתי בשתי דרכים. הראשונה היא היצירה של העכברים הטרנסגניים בזריקה pronuclear של הדנ א פלסמיד ואחריו את השתלת של מופרות לתוך נקבות pseudopregnant. השני הוא הדור של עכברים טוק-אאוט/טוק-in על-ידי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים לבין התפתחות כימרות. נוקאאוט מותנה של גנים ספציפיים ברקמות או תא סוג עניין כרוך הרבייה של אללים מהונדסים עם Cre ואתרים flox דורות מרובים. כל התהליך יכול להיות יקר ולא זמן רב, במיוחד אם המטרה היא היעד גנים מרובים רקמות-במיוחד. לאחרונה, עריכת ג'ין טכנולוגיות כגון באשכולות interspaced בקביעות קצר palindromic חזרה (CRISPR) הוחלו על מספר איברים של העכברים לזירוז רקמות ספציפיות שינויים גנטיים לסרטן autochthonous מידול3, 4,5,6,7 או מוטציות המחלה הנכונה בחיי עיר8,9. במחקרים אלה, המסירה של הווקטורים gRNA הושג בדרך כלל דרך זיהום adenoviral או lentiviral של האיבר או הזרקת וריד הזנב hydrodynamic. הקלות היחסית משלוח של הרכיבים CRISPR ריאות ולכבד השתפרה במידה את הנוחות והיעילות של סרטן מידול באיברים אלה לעומת הדגמים העכבר Cre-לקס המבוסס מסורתית.
Urothelium שלפוחית השתן היא איפה שמקורן רוב גידולים בשלפוחית השתן. המשלוח של ה-DNA וקטורים שלפוחית השתן urothelium לטיפול דוגמנות או ג'ין סרטן היא הקשו על ידי שכבה גליקוזאמינוגליקן על פני השטח urothelial הפסגה, אשר משמש כמחסום ב"זכות של הווירוסים זיהומיות10,11. מספר סוכנים pretreatment כגון Syn3 ו- dodecyl-β-d-maltoside שימשו כדי לשבש את מחסום זה ולשפר אדנו זיהום יעילות12,13,14. אם adeno-הקשורים וירוסים (AAVs) יכול להדביק ביעילות שלפוחית השתן לא דווחה. בסך הכל, שיטת משלוח מבוסס נגיפי יהיה רצוי. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדה למסירה יעיל דנ א פלסמיד urothelium העכבר דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. כי הגישה שלנו אינו כרוך רעלני כימי של השכבה גליקוזאמינוגליקן או וירוס הייצור, שזה משמעותי מפשט את המסירה של ה-DNA פלסמידים לתוך urothelium שלפוחית השתן העכבר, צריך להקל על מחקרים שונים אין ויוו מחלות שלפוחית השתן.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB Syringe</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K&amp;amp;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Cover the heat mat with paper towels</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &amp;micro;L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmid CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platinum tweezertrode 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm diameter</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>String cord</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td></tr><tr><td>Tape, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td><td>PBS animal health</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Table top system anesthesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violet suture 18&quot; FS-2 cutting 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip applier</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) יקרים מאוד בגילוי הרומן ביולוגי תובנות החניכה, התקדמות מנגנוני מחלות אנושיות כגון סרטן. העכברים הטרנסגניים, מותנה נוקאאוט שימשו לעיתים קרובות ביטוי גנים או אבלציה רקמות ספציפיות או תא סוגי בתוך vivo. עם זאת, יצירת מודלים העכבר germline יכול להיות זמן רב ויקרות. הפיתוחים האחרונים בתחום הגן עריכה טכנולוגיות ואת הכדאיות של אספקת פלסמידים DNA על ידי זיהום ויראלי אפשרו דור מהירה של הלא-germline autochthonous העכבר סרטן מודלים עבור מספר איברים. שלפוחית השתן הוא איבר זה היה קשה עבור וקטורים ויראלית לגשת, בשל נוכחותם של שכבה גליקוזאמינוגליקן המכסים את urothelium. כאן, אנו מתארים שיטה שפותחה במעבדת לאספקה יעילה של ה-DNA פלסמידים לתוך העכבר שלפוחית השתן urothelium vivo בתוך. דרך intravesical החדרה של pCAG-GFP דנ א פלסמיד אלקטרופורציה השלפוחית בניתוח חשוף, אנו מראים כי פלסמיד דנ א יכולה להיות מועברת במיוחד לתוך התאים urothelial שלפוחית השתן לביטוי ארעית. השיטה שלנו מספק דרך נוחה ומהירה ביטוי נוקאאוט של גנים בשלפוחית עכבר, ניתן להחיל על בניין GEMMs של סרטן שלפוחית השתן ומחלות אורולוגיים אחרים.

כדי להדגים את ההצלחה של המסירה הגן לתוך urothelium שלפוחית השתן, השתמשנו על פלסמיד15 pCAG-GFP עבור אלקטרופורציה. 20 µL של פלסמיד Trypan Blue פתרון הוזרק דרך השופכה, נוהלו 5 פולסים חשמליים. לאחר 48 שעות, אנחנו גזור העכבר שלפוחית השתן ולא נצפתה כתמים של קרינה פלואורסצנטית GFP תחת מ...

Watch this Scientific Journal Video about Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation at JoVE.com

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

novel-method-plasmid-dna-delivery-to-mouse-bladder-urothelium

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  University of California, Santa Cruz. אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

Video: Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neuroscience

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

סרטן שלפוחית ​​השתן לדגם orthotopic ג&#39;ין משלוח לימודים

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Medicine

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Electroporation שטח pial ילודים

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense and transmit information about its environment to the underlying tissues, promoting voiding function and behavior. Disruption of the urothelial barrier, or its sensory/transducer function, can lead to disease. Studying these complex events is hampered by lack of simple strategies to alter gene and protein expression in the urothelium. Methods are described here that allow investigators to generate large amounts of high-titer adenovirus, which can then be used to transduce rodent urothelium with high efficiency, and in a relatively straightforward manner. Both cDNAs and small interfering RNAs can be expressed using adenoviral transduction, and the impact of transgene expression on urothelial function can be assessed 12 h to several days later. These methods have broad applicability to studies of normal and abnormal urothelial biology using mouse or rat animal models.

Methods are described for the generation of large amounts of recombinant adenoviruses, which can then be used to transduce the native rodent urothelium allowing for expression of transgenes or downregulation of endogenous gene products.

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Electroporation-Mediated In Vitro Gene Delivery: An Electric Pulse Technique to Introduce Fluorescent Reporter Protein-Encoding Plasmids Into Cultured Cells

Source: Lo, J. C. W. et al., <a href="https://www.jove.com/v/63283">Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2021)
This video demonstrates the electroporation technique that introduces fluorescent protein-encoding plasmid DNA into mouse primary cerebellar granule cell precursors.

Electroporation-Mediated in Vitro Gene Delivery: טכניקת פולס חשמלי להחדרת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטיים לתאים בתרבית

Source: Lo, J. C. W. et al., Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Gene Transfer Techniques

Transfection

Urine Depletion and Bladder Rinsing in Mouse Model: A Catheter-based Procedure to Empty and Wash Murine Urinary Bladder

Source: Yu, C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe a catheter-based procedure to empty and rinse the urinary bladder of a mouse model. The prepped mouse can then be used for further experimental procedures.

דלדול שתן ושטיפת שלפוחית השתן בעכבר מודל: הליך מבוסס קטטר לריקון ושטיפת שלפוחית השתן

Source: Yu, C. et al. Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe ...

Cancer Research

Urinary Tract Cancer

In vivo studies

Delivery of DNA Plasmids into Urothelium of Mouse Bladder: An Electroporation-based Procedure to Efficiently Deliver DNA Plasmids into Urothelial Cells of Murine Bladder to Generate Genetically Engineered Models

Source: Chuan, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation.</a> J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video demonstrates the delivery of DNA plasmid into the urothelium of the mouse bladder using a combination of urethral catheterization and electroporation techniques. The described procedure allows the generation of mouse bladder cancer models.

העברת פלסמידים של DNA לתוך אורותל של שלפוחית השתן של עכבר: הליך מבוסס אלקטרופורציה כדי להעביר ביעילות פלסמידים DNA לתוך תאי השתן של שלפוחית השתן כדי ליצור מודלים מהונדסים גנטית

Source: Chuan, Y. et al. Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation. J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

Source: Woodard, L. E. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56324" target="_blank">Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

הזרקת אגן כליות הידרודינמית: טכניקה להעברת DNA ישירות לתאי כליות של מודל מורין

Source: Woodard, L. E. et al. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, ...

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

סרטן שלפוחית השתן לדגם orthotopic ג'ין משלוח לימודים

Electroporation שטח pial ילודים

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

Electroporation-Mediated in Vitro Gene Delivery: טכניקת פולס חשמלי להחדרת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטיים לתאים בתרבית

דלדול שתן ושטיפת שלפוחית השתן בעכבר מודל: הליך מבוסס קטטר לריקון ושטיפת שלפוחית השתן

הזרקת אגן כליות הידרודינמית: טכניקה להעברת DNA ישירות לתאי כליות של מודל מורין

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

סרטן שלפוחית ​​השתן לדגם orthotopic ג'ין משלוח לימודים

Electroporation שטח pial ילודים

בVivo Microinjection וElectroporation של אשך העכבר

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס

Electroporation-Mediated in Vitro Gene Delivery: טכניקת פולס חשמלי להחדרת פלסמידים מקודדי חלבון פלואורסצנטיים לתאים בתרבית

דלדול שתן ושטיפת שלפוחית השתן בעכבר מודל: הליך מבוסס קטטר לריקון ושטיפת שלפוחית השתן

הזרקת אגן כליות הידרודינמית: טכניקה להעברת DNA ישירות לתאי כליות של מודל מורין

סרטן שלפוחית השתן לדגם orthotopic ג'ין משלוח לימודים