この手法は、免疫学分野の主要な質問に答える助けとなります。例えば、疾患状態における単球サブセットの割合、または異なるマーカーの発現がどのように変化するかを決定する。この手法の主な利点は、細胞がネイティブ状態に近い、そして明確な指示と正当化が使用され、標準化された格言法を提供することです。
一般的に、この方法に新しい個人は、多くの論文が細胞の格座がどのように行われたかについて明確な指示を与えていないので、苦労するかもしれません。テキストプロトコルで詳述されているように、血液サンプルの収集と白血球数の決定でこのプロトコルを開始します。リン酸緩衝生理食塩水で血液を希釈し、1ミリリットル当たり約500万個の白血球に濃度を調整する。
血液、抗CD14-V450、抗CD16-APCおよび抗HLA-DR-PerCPを組み合わせることによって、チューブの数のための十分なマスターミックスを準備します。各チューブに51.9マイクロリットルの混合の渦およびピペット。PE標識M1およびM2マーカー抗体、ならびにT細胞、B細胞、好中球、およびナチュラルキラー細胞のマーカーを対応するチューブに加えます。
渦と暗闇の中で摂氏4度で30分間インキュベートします。さて、赤血球溶解と白血球固定溶液を合わせた250マイクロリットルを加え、すぐに混合物を穏やかに渦液にします。渦液混合物を暗闇の中で摂氏4度で10分間インキュベートします。
10分後、PBSを250マイクロリットル加え、室温で10分間、260gで細胞をスピンダウンします。上清を取り除き、細胞を1%ホルムアルデヒドの300マイクロリットルで再懸濁する。細胞を摂氏4度で保存し、分析が行われるまで光から保護します。
フローサイトメトリーは、サンプル調製の48時間以内に行う必要があります。まず、フローサイトメーターのログをチェックして、施設スタッフが品質管理チェックを行っていることを確認します。フローサイトメトリー実験を設定するには、新しい実験をクリックし、新しい標本と新しいチューブをクリックしてチューブを追加します。
アイコンをクリックして二変量プロットを選択し、ドロップダウンメニューを使用してアクセスパラメータを選択します。CD16/CD14プロットと時間と共に検出器を表示するプロットを含めて、取得を監視します。チューブを挿入し、クリックし、取得します。
計測器の電圧設定を確認し、検出器の信号がスケールをオフにしていないことを確認します。CD14/CD16プロットの単球ゲートに落ちる細胞を観察します。記録しきい値を 5,000 イベントに設定し、レコードをクリックします。
残りのチューブのデータを記録し続けます。すべてのチューブのデータが記録されたら、解析のためにフローデータを fcs ファイルとしてエクスポートします。単球ゲートを実行するには、解析ソフトウェアでファイルを開き、チューブ名をダブルクリックし、ドロップダウンメニューからパラメータを選択して、前方散乱領域と前方散乱高さプロットのセルを視覚化します。
ポリゴン ゲート ツール アイコンをクリックし、セルを囲んで、二重除外ゲートを作成します。ゲート領域をダブルクリックして、ゲートセルを選択します。新しい表示ボックスで、ドロップダウンメニューパラメータを調整して、前方散布領域と側面散布図のセルを表示します。
長方形のゲートアイコンをクリックし、前方および側面散乱特性に基づいて、単球集団を寛大に選択して、リンパ球、ナチュラルキラー細胞および顆粒球の大部分を除外する。ゲートセルを選択し、CD14/CD16 プロットで再表示し、ドロップダウンメニューを使用してパラメータを選択します。ポリゴン ゲートをクリックして、その特性、反転 l 形状に基づいて単球を選択します。
非古典的な集団が細胞から左に区別されない場合、汚染が発生する可能性が高く、調査する必要があります。ゲートセルを選択し、CD/16 HLA-DR プロットで単球を表示するには、ドロップダウンメニューを使用してパラメータを選択します。ポリゴンゲートをクリックしてHLA-DR陽性細胞を選択し、残りのナチュラルキラー細胞と好中球を除外します。
ゲートセルを選択し、パラメータを選択するためのドロップダウンメニューを使用して、CD14/HLA-DRプロット上にHLA-DR陽性セルを表示します。ポリゴン ゲートをクリックし、ゲートを描画して HLA-DR ハイ/CD14 低 B セルを除外します。ゲートセルを選択し、ドロップダウンメニューを使用してCD16/CD14プロットに表示します。
プロットオプションから、単球サブセットゲートを描画できるゼブラプロットを選択して、サブセットの比率を決定します。さて、長方形のゲートアイコンをクリックし、CD14高/CD16低古典的な単球集団の周りに近似長方形のゲートを描くことによって、古典的な単球を選択します。ディスプレイの下で、選択して中央値を示し、古典的な単球の蛍光強度の中央値を表示する。
母集団が左と右の中央値から等しい分布を持ち、左のすべてのセルを包含するようにゲートを調整します。古典的なゲートの右側にあるセルを囲む長方形のゲートを描画して、中間母集団を選択します。ゲートの下部を調整して非古典的なセルを除外し、古典的な単球ゲート内にある同心円の底にゲートを整列させます。
非古典的なサブセットをゲートし、中間サブセットの下端から下に矩形のボックスを描き、すべてのセルを母集団の下端まで選択します。[表示]で、[ゲート周波数を表示]を選択して、各単球サブセットの割合を決定します。最後に、各単球サブセットからセルを選択します。
ドロップダウン パラメータを変更して、各マーカーを表示する各単球サブセットのヒストグラムを作成します。次に、テキストプロトコルに記載されているように、中央値または幾何平均を用いて式の程度を計算する。正しくゲートされた単球集団がここに示されています。
そして、プロポーションは文献のものと一致しています。このサンプルの割合は、88.1%古典、4.33%中間体、7.49%非古典的として計算された。他の集団の相対的な位置を評価することによって、ここに示すT細胞および好中球が青色で、CD16/CD14プロット上の単球、反転l形状の外側によく従うことは明らかである。
しかしながら、ナチュラルキラー細胞とB細胞集団の両方が、ここに青色で示され、非古典的な単球集団と重なった。汚染する細胞タイプが除去されたことを確認するヒートマップを、ここに示す。ナチュラルキラー細胞はHLA-DR CD16ステップによってゲートアウトされているのに対し、B細胞はHLA-DR CD/14ステップによってゲートアウトされている。
M1 および M2 マーカーの表現を、赤で示したアイソタイプ コントロールに対して、青で示します。CD120bはM1マーカーであり、そのアイソタイプ制御の上に、すべての単球サブセットについて明確なシフトを示す。これは、CD93のM2マーカーの場合でもあり、表現は古典的に高く、中間体では中程度で、非古典では低い。
この手順を試みる間、汚染細胞は定量化された表現に寄与する可能性があるため、必ず汚染細胞がゲートアウトされていることを覚えておくことが重要です。この手順に従って、他のマーカーを調べてもよい。病気における単球マーカー発現の変化などの追加の質問に答えるために。
人間の血液やホルムアルデヒドを使用することは危険であり、個人的な保護具やバイオハザードフードの使用などの予防措置は、常にこの手順を実行するときに取られるべきであることを忘れないでください。
