이 기술은 면역학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들면, 단핵 하위 집합 비율, 또는 다른 마커의 표현이 질병 상태에서 어떻게 변경되는지 결정합니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 네이티브 상태에 가깝고 명확한 지침과 정당화가 표준화 된 게이팅 방법을 제공하기 위해 사용된다는 것입니다.
일반적으로, 많은 논문이 세포의 게이팅이 수행 된 방법에 대한 명확한 지침을 제공하지 않기 때문에이 방법에 새로운 개인은 투쟁 할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 바와 같이 혈액 샘플 의 수집 및 백혈구 수의 결정과 함께이 프로토콜을 시작합니다. 인산염 완충식식염으로 혈액을 희석하고 밀리리터 당 약 5백만 개의 백혈구로 농도를 조절합니다.
혈액, 안티 CD14-V450, 안티 CD16-APC 및 안티 HLA-DR-PerCP를 결합하여 튜브 의 수에 대한 충분한 마스터 믹스를 준비합니다. 소용돌이와 파이펫 51.9 마이크로리터가 각 튜브에 섞어 넣습니다. PE 표지M1 및 M2 마커 항체뿐만 아니라 T 세포, B 세포, 호중구 및 천연 킬러 세포를 해당 튜브에 첨가하십시오.
소용돌이와 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양하십시오. 이제 결합된 적혈구 용해와 백혈구 고정 용액의 250 마이크로리터를 추가하고 혼합물을 부드럽게 소용돌이시십시오. 소용돌이 혼합물을 어둠 속에서 섭씨 4도에서 10분 동안 배양합니다.
10분 후, PBS 250마이크로리터를 넣고 실온에서 10분 동안 260g의 셀을 회전시합니다. 상체를 제거하고 1% 포름알데히드의 300 마이크로리터에서 세포를 다시 분리합니다. 분석이 수행될 때까지 빛으로부터 보호되는 섭씨 4도에 셀을 저장합니다.
유동 세포측정은 시료 준비 후 48시간 이내에 이루어져야 합니다. 먼저 유동 세포계 로그를 확인하여 시설 직원이 품질 관리 검사를 수행했는지 확인합니다. 유동 세포 측정 실험을 설정하려면 새로운 실험을 클릭하고 새로운 표본과 새로운 튜브를 클릭하여 튜브를 추가합니다.
아이콘을 클릭하여 바이바리에이트 플롯을 선택하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 액세스 매개 변수를 선택합니다. CD16/CD14 플롯과 감지기를 시간과 함께 표시하는 플롯을 포함하여 수집을 모니터링합니다. 튜브를 삽입하고 클릭하여 획득합니다.
계측기 전압 설정을 확인하여 검출기 신호가 스케일이 끊어지지 않도록 합니다. CD14/CD16 플롯의 단핵구 게이트에 속하는 세포를 관찰한다. 클래식 단핵구 게이트에 대한 레코딩 임계값을 5, 000 이벤트로 설정하고 레코드를 클릭합니다.
나머지 튜브에 대한 데이터를 계속 기록합니다. 모든 튜브에 대한 데이터가 기록된 후 흐름을 분석을 위한 fcs 파일로 내보냅니다. 단일 세포 게이팅을 수행하려면 분석 소프트웨어에서 파일을 열고 튜브 이름을 두 번 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 매개 변수를 선택하여 전방 분산 영역과 전방 분산 높이 플롯의 셀을 시각화합니다.
다각형 게이트 도구 아이콘을 클릭하고 셀을 둘러싸서 이중 제외 게이트를 만듭니다. 게이트 된 영역을 두 번 클릭하여 게이트 된 셀을 선택합니다. 새 디스플레이 상자에서 드롭다운 메뉴 매개 변수를 조정하여 측면 분산 영역 플롯과 셀을 전방 분산 영역에 표시합니다.
직사각형 게이트 아이콘을 클릭하고, 림프구, 자연 킬러 세포 및 과립구의 대부분을 제외하려면 전방 및 측면 산란 특성에 따라 단핵 구군을 아낌없이 선택합니다. 게이트된 셀을 선택하고 CD14/CD16 플롯에서 다시 표시하여 드롭다운 메뉴를 사용하여 매개변수를 선택합니다. 다각형 게이트를 클릭하여 특성에 따라 단핵구를 선택합니다.
비고전 적 집단이 세포에서 왼쪽으로 구별되지 않으면 오염가능성이 있으며 조사되어야 합니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 매개 변수를 선택하여 게이트된 셀을 선택하고 CD/16 HLA-DR 플롯에 단핵구를 표시합니다. 다각형 게이트를 클릭하여 HLA-DR 양성 세포를 선택하고 남은 자연 킬러 세포 및 호중구를 제외합니다.
게이트된 셀을 선택하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 CD14/HLA-DR 플롯에 HLA-DR 양수 셀을 표시하여 매개 변수를 선택합니다. 다각형 게이트를 클릭하고 게이트를 그려 HLA-DR 하이/CD14 로우 B 셀을 제외합니다. 게이트된 셀을 선택하고 드롭다운 메뉴를 사용하여 CD16/CD14 플롯에 표시합니다.
플롯 옵션에서 단핵구 하위 집합 게이트를 그려 하위 집합 비율을 결정할 수 있는 얼룩말 플롯을 선택합니다. 이제 직사각형 게이트 아이콘을 클릭하고 CD14 하이/CD16 낮은 클래식 단화 모집단 주위에 대략적인 직사각형 게이트를 그려 클래식 단핵구를 선택합니다. 디스플레이 아래에서 중앙값을 표시하여 클래식 단핵구의 중앙형광 강도를 표시합니다.
모집단이 왼쪽과 오른쪽의 중앙값에서 동일한 분포를 가지도록 게이트를 조정하고, 왼쪽에 있는 모든 세포를 포괄한다. 고전적인 게이트의 오른쪽에 있는 셀을 포괄하는 직사각형 게이트를 그려 중간 인구를 선택합니다. 게이트의 바닥을 조정하여 게이트를 고전적 단핵구 게이트 내에 있는 동심 원의 바닥과 정렬하여 비고전적으로 셀을 제외합니다.
비고전 적 하위 집합을 게이트, 중간 하위 집합의 아래쪽 가장자리에서 아래로 직사각형 상자를 그려, 인구의 하단에 모든 셀을 선택. 표시에서 게이트 주파수를 표시하여 각 단세포 하위 집합의 백분율을 결정합니다. 마지막으로 각 단세포 하위 집합에서 셀을 선택합니다.
드롭다운 매개변수를 변경하여 각 단세포 하위 집합에 대한 히스토그램을 생성하여 각 마커를 표시합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 중앙값 또는 기하학적 평균을 사용하여 식 의 정도를 계산합니다. 성공적으로 문이 닫힌 단두구 개체 수가 여기에 표시됩니다.
그리고 비율은 문학에 있는 것과 일치합니다. 이 샘플의 비율은 88.1 % 고전, 4.33 %의 중간및 7.49 %의 비고전으로 계산되었습니다. 다른 집단의 상대적 위치를 평가함으로써, 여기에 표시된 T 세포와 호중구가 CD16/CD14 플롯에서 단세포, 반전 된 l 모양 밖에서 잘 따르는 것이 분명합니다.
그러나, 자연 킬러 세포와 B 세포 인구, 파란색으로 여기 표시, 비 고전적인 단세포 인구와 겹쳐. 오염 세포 유형이 제거되었음을 확인하는 열지도가 여기에 표시됩니다. 천연 킬러 세포는 HLA-DR CD16 단계에 의해 밖으로 문이 되었습니다., 반면, B 세포는 HLA-DR CD/14 단계에 의해 밖으로 게이트 되었습니다.
빨간색으로 된 등색 컨트롤을 기준으로 파란색으로 M1 및 M2 마커의 표현이 여기에 표시됩니다. CD120b M1 마커는 모든 단세포 하위 집합에 대해 동종형 컨트롤 보다 명확한 변화를 보여줍니다. 이것은 또한 CD93 M2 마커의 경우, 표현은 고전에서 더 높고 중간에 중간정도, 비 고전적 에서 낮은.
이 절차를 시도하는 동안, 오염된 세포가 정량화된 식에 기여할 수 있기 때문에, 밖으로 문이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다른 마커를 검사 할 수 있습니다. 단세포 마커 발현이 질병에서 어떻게 변하는지와 같은 추가 질문에 대답하기 위해.
인간의 혈액과 포름알데히드와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으므로 개인 보호 장비 및 생물학적 위험 후드 사용과 같은 예방 조치는 이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.
