Cette technique peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie. Par exemple, déterminer comment les proportions du sous-ensemble des monocytes, ou l’expression de différents marqueurs, sont modifiées dans les états de la maladie. Le principal avantage de cette technique, c’est que les cellules sont proches de leur état d’origine, et que des instructions claires et la justification sont utilisées, pour fournir une méthode de gating normalisée.
Généralement, les individus nouveaux à cette méthode peuvent lutter, parce que beaucoup d’articles ne donnent pas des instructions claires sur la façon dont le gating des cellules a été exécuté. Commencez ce protocole par la collecte d’échantillons de sang et la détermination du nombre de globules blancs, tel que détaillé dans le protocole de texte. Diluer le sang avec de la solution saline tamponnée de phosphate, pour ajuster la concentration à environ 5 millions de globules blancs par millilitre.
Préparez un mélange maître suffisant pour le nombre de tubes en combinant le sang, anti CD14-V450, anti CD16-APC et anti HLA-DR-PerCP. Vortex et pipette 51,9 microlitres de mélange dans chaque tube. Ajoutez des anticorps marqueurs M1 et M2 étiquetés PE, ainsi que des marqueurs pour les cellules T, les cellules B, les neutrophiles et les cellules tueuses naturelles à leurs tubes correspondants.
Vortex et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Maintenant, ajouter 250 microlitres de lyse combinée globule rouge et solution de fixation des globules blancs, et vortex immédiatement le mélange, doucement. Incuber le mélange vortexé pendant 10 minutes dans l’obscurité, à quatre degrés Celsius.
Après 10 minutes, ajouter 250 microlitres de PBS et faire tourner les cellules à 260g, pendant 10 minutes à température ambiante. Enlevez le supernatant, et resuspendez les cellules dans 300 microlitres de 1% de formaldéhyde. Stockez les cellules à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière jusqu’à ce que l’analyse soit effectuée.
La cytométrie du débit doit être effectuée dans les 48 heures suivant la préparation de l’échantillon. Pour commencer, vérifiez le journal du cytomètre d’écoulement pour vous assurer que le personnel de l’établissement a effectué des vérifications de contrôle de la qualité. Pour configurer l’expérience de cytométrie de flux, cliquez sur une nouvelle expérience, suivie d’un nouveau spécimen et d’un nouveau tube, pour ajouter des tubes.
Sélectionnez les parcelles bivariées, en cliquant sur l’icône, et utilisez les menus dropdown, pour sélectionner les paramètres d’accès. Assurer l’inclusion d’une parcelle CD16/CD14 et d’une parcelle affichant un détecteur à côté du temps, afin de surveiller l’acquisition. Insérez le tube et cliquez, acquérir.
Vérifiez les paramètres de tension de l’instrument, en vous assurant que les signaux du détecteur ne sont pas hors échelle. Observez les cellules tombant dans la porte des monocytes de la parcelle CD14/CD16. Fixez le seuil d’enregistrement à 5000 événements pour la porte monocyte classique, et cliquez sur l’enregistrement.
Continuez d’enregistrer les données pour les tubes restants. Une fois que les données de tous les tubes ont été enregistrées, exportez les données de flux sous forme de fichiers fcs pour analyse. Pour effectuer le gating monocyte, ouvrez les fichiers dans le logiciel d’analyse, cliquez deux fois sur le nom du tube et sélectionnez les paramètres des menus de dropdown pour visualiser les cellules sur une zone de dispersion avant par rapport à une parcelle de hauteur de dispersion vers l’avant.
Créez une porte d’exclusion doublet, en cliquant sur l’icône de l’outil de porte polygone, et en enfermant les cellules. Sélectionnez les cellules fermées en cliquant en double sur la région fermée. Dans la nouvelle boîte d’affichage, ajustez les paramètres du menu dropdown pour afficher les cellules sur une zone de dispersion avant par rapport à une parcelle de zone de dispersion latérale.
Cliquez sur l’icône de la porte rectangulaire et sélectionnez généreusement la population de monocytes, en fonction des propriétés de dispersion avant et latérale, pour exclure la majorité des lymphocytes, des cellules tueuses naturelles et des granulocytes. Sélectionnez les cellules gated et redisplay sur une parcelle CD14/CD16, en sélectionnant les paramètres en utilisant les menus dropdown. Cliquez sur la porte polygone, pour sélectionner les monocytes en fonction de leur forme l caractéristique et inversée.
Si la population non classique n’est pas distincte des cellules à sa gauche, alors la contamination est probable et devrait être étudiée. Sélectionnez les cellules fermées et affichez les monocytes sur une parcelle CD/16 HLA-DR, en utilisant les menus décrocheurs pour sélectionner les paramètres. Cliquez sur la porte polygone pour sélectionner les cellules positives HLA-DR, et exclure les cellules tueuses naturelles restantes et les neutrophiles.
Sélectionnez les cellules fermées et affichez les cellules positives HLA-DR sur une parcelle CD14/HLA-DR à l’aide de menus de dropdown pour sélectionner les paramètres. Cliquez sur la porte polygone, et dessinez une porte pour exclure les cellules HLA-DR high/CD14 low B. Sélectionnez les cellules gated et utilisez les menus dropdown pour les afficher sur une parcelle CD16/CD14.
À partir d’options de parcelle, sélectionnez la parcelle zébrée, qui permettra de tirer les portes du sous-ensemble des monocytes, afin de déterminer les proportions sous-ensembleées. Maintenant, cliquez sur l’icône de la porte rectangulaire, et sélectionnez les monocytes classiques en dessinant une porte rectangulaire approximative autour de la faible population de monocytes classiques CD14/CD16. Sous l’affichage, sélectionnez, montrez des médianes, pour afficher l’intensité médiane de fluorescence pour les monocytes classiques.
Ajustez la porte de telle sorte que la population ait une répartition égale de la médiane à gauche et à droite, et englobe toutes les cellules vers la gauche. Sélectionnez la population intermédiaire en dessinant une porte rectangulaire qui englobe les cellules à droite de la porte classique. Ajustez le bas de la porte pour exclure les cellules non classiques, en alignant la porte avec le fond des cercles concentriques, qui sont complètement à l’intérieur de la porte classique des monocytes.
Portez le sous-ensemble non classique, en tirant une boîte rectangulaire vers le bas à partir du bord inférieur du sous-ensemble intermédiaire, en sélectionnant toutes les cellules au bas de la population. Sous affichage, sélectionnez, affichez les fréquences de la porte, afin de déterminer le pourcentage de chaque sous-ensemble de monocytes. Enfin, sélectionnez les cellules de chaque sous-ensemble de monocytes.
Modifiez les paramètres de dropdown pour créer un histogramme pour chaque sous-ensemble de monocytes, affichant chaque marqueur. Ensuite, calculez le degré d’expression, en utilisant la moyenne médiane ou géométrique, tel que décrit dans le protocole de texte. Des populations de monocytes fermées avec succès sont montrées ici.
Et les proportions sont en ligne avec celles de la littérature. Les proportions de cet échantillon ont été calculées comme étant 88,1 % classiques, 4,33 % intermédiaires et 7,49 % non classiques. En évaluant la position relative d’autres populations, il est clair que les lymphocytes T et les neutrophiles montrés ici en bleu, suivent bien en dehors du monocyte, forme inversée l, sur une parcelle CD16/CD14.
Cependant, les cellules tueuses naturelles et les populations de cellules B, montrées ici en bleu, se chevauchaient avec la population non classique de monocytes. Les cartes thermiques confirmant que les types de cellules contaminantes ont été supprimées, sont affichées ici. Les cellules tueuses naturelles ont été fermées par l’étape CD16 HLA-DR, tandis que les cellules B ont été fermées par l’étape CD/14 HLA-DR.
L’expression des marqueurs M1 et M2 en bleu, par rapport à leurs commandes d’isotype en rouge, sont affichées ici. CD120b un marqueur M1, montre un changement clair au-dessus de son contrôle isotype, pour tous les sous-ensembles de monocytes. C’est également le cas du CD93, un marqueur M2, l’expression étant plus élevée en classique, modérée sur les intermédiaires et faible sur non classique.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de s’assurer que les cellules contaminantes sont fermées, car elles peuvent autrement contribuer à l’expression quantifiée. Après cette procédure, d’autres marqueurs peuvent être examinés. Afin de répondre à d’autres questions, telles que, comment l’expression des marqueurs monocytes change dans la maladie.
N’oubliez pas que le travail avec le sang humain et le formaldéhyde peut être dangereux, et donc des précautions telles que, l’équipement de protection individuelle, et l’utilisation d’une hotte de danger biologique, devraient toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
