Bu teknik immünoloji alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Örneğin, hastalık durumlarında monosit alt kümesi oranlarının veya farklı belirteçlerin nasıl ifade edildiğinin belirlenmesi gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin kendi yerel durumuna yakın olması ve açık talimatlar ve gerekçeler, standart bir gating yöntemi sağlamak için kullanılır.
Birçok makale hücrelerin gating nasıl yapıldığı konusunda net talimatlar vermez, çünkü genellikle, bu yönteme yeni bireyler, mücadele edebilir. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi, kan örneklerinin toplanması ve beyaz kan hücresi sayısının belirlenmesi ile bu protokole başlayın. Mililitre başına yaklaşık 5 milyon beyaz kan hücresi konsantrasyonu ayarlamak için fosfat-tamponlu tuzlu ile kan seyreltmek.
Kan, anti CD14-V450, anti CD16-APC ve anti HLA-DR-PerCP birleştirerek tüplerin sayısı için yeterli ana karışımı hazırlayın. Girdap ve pipet 51.9 mikrolitre karışımı her tüp içine. Pe etiketli M1 ve M2 marker antikorların yanı sıra T hücreleri, B hücreleri, nötrofiller ve doğal öldürücü hücreler için belirteçleri de ilgili tüplere ekleyin.
Girdap ve inkübasyon 30 dakika boyunca karanlıkta 4 santigrat derece. Şimdi, 250 mikrolitre kombine kırmızı kan hücresi lisisve beyaz kan hücresi sabitleme çözeltisi ekleyin ve hemen karışımı yavaşça girdaplayın. Girdaplı karışımı karanlıkta 10 dakika kuluçkaya yatırın, 4 derece.
10 dakika sonra, PBS 250 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca, 260g hücreleri aşağı spin. Supernatant çıkarın ve% 1 formaldehit 300 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. Analiz yapılana kadar ışıktan korunan hücreleri dört derecede saklayın.
Akış sitometrisi numune hazırlığından sonraki 48 saat içinde yapılmalıdır. Başlamak için, tesis personelinin kalite kontrol kontrolleri yaptığından emin olmak için akış sitometre günlüğünü kontrol edin. Akış sitometri deneyi kurmak için, tüpler eklemek için yeni deney, ardından yeni örnek ve yeni tüp tıklayın.
Simgeye tıklayarak bivariate çizimleri seçin ve erişim parametrelerini seçmek için açılır menüleri kullanın. Bir CD16/CD14 çizimi ve satın almayı izlemek için zaman yanında dedektör gösteren bir çizimin eklenmesini sağlayın. Tüpü ekleyin ve tıklayın, edinin.
Dedektör sinyallerinin ölçek dışında olmamasını sağlayarak gösterge gerilim ayarlarını kontrol edin. CD14/CD16 çiziminin monosit kapısına düşen hücreleri gözlemleyin. Klasik monosit kapısı için kayıt eşiğini 5.000 olay olarak ayarlayın ve kayda tıklayın.
Kalan tüpler için veri kaydetmeye devam edin. Tüm tüplere ait veriler kaydedildikten sonra, akış verilerini analiz için fcs dosyaları olarak dışa aktarın. Monosit gating gerçekleştirmek için, analiz yazılımında dosyaları açın, tüp adını çift tıklatın ve ileri dağılım alanı ve ileri dağılım yüksekliği çizim hücreleri görselleştirmek için açılır menülerden parametreleri seçin.
Çokgen kapı araç simgesini tıklatarak ve hücreleri çevreleyerek bir çift dışlama kapısı oluşturun. Geçitli bölgeye çift tıklayarak kapılı hücreleri seçin. Yeni ekran kutusunda, hücreleri ileri dağılım alanında n için yan dağılım alanı çiziminde görüntülemek için açılır menü parametrelerini ayarlayın.
Dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve cömertçe lenfositler, doğal öldürücü hücreler ve granülositlerin çoğunluğu dışlamak için, ileri ve yan dağılım özelliklerine dayalı monosit popülasyon seçin. Kapılı hücreleri seçin ve açılan menüleri kullanarak parametreleri seçerek CD14/CD16 çiziminde yeniden görüntüleyin. Karakteristik, ters l şekline göre monositleri seçmek için çokgen kapısına tıklayın.
Klasik olmayan popülasyon solundaki hücrelerden farklı değilse, kontaminasyon muhtemeldir ve araştırılmalıdır. Geçitli hücreleri seçin ve parametreleri seçmek için açılır menüleri kullanarak monositleri CD/16 HLA-DR çiziminde görüntüleyin. HLA-DR pozitif hücreleri seçmek ve kalan doğal öldürücü hücreleri ve nötrofilleri dışlamak için çokgen kapısına tıklayın.
Geçitli hücreleri seçin ve parametreleri seçmek için açılır menüleri kullanarak HLA-DR pozitif hücrelerini CD14/HLA-DR çiziminde görüntüleyin. Çokgen kapısına tıklayın ve HLA-DR yüksek/CD14 düşük B hücrelerini dışlamak için bir kapı çizin. Kapılı hücreleri seçin ve cd16/CD14 çiziminde görüntülemek için açılır menüleri kullanın.
Çizim seçeneklerinden, alt küme oranlarını belirlemek için monosit alt küme kapılarının çizilmesini sağlayacak zebra çizimini seçin. Şimdi, dikdörtgen kapı simgesine tıklayın ve CD14 yüksek/CD16 düşük klasik monosit popülasyonu etrafında yaklaşık dikdörtgen bir kapı çizerek klasik monositleri seçin. Ekranda, klasik monositler için ortanca floresan yoğunluğunu görüntülemek için ortancaları seçin, gösterin.
Geçidi, popülasyonun soldaki ve sağdaki ortancadan eşit dağılıma sahip olması ve soldaki tüm hücreleri kapsayacak şekilde ayarlayın. Klasik kapının sağına hücreleri kapsayan dikdörtgen bir geçit çizerek ara popülasyonu seçin. Tamamen klasik monosit kapısı içinde olan eşmerkezli dairelerin alt kısmıyla kapıyı hizalayarak, klasik olmayan hücreleri dışlamak için kapının alt kısmını ayarlayın.
Klasik olmayan alt kümeyi, ara alt kümenin alt kenarından dikdörtgen bir kutu çizerek ve tüm hücreleri popülasyonun altına seçerek kaplayın. Ekranın altında, her monosit alt kümesinin yüzdesini belirlemek için kapı sıklıklarını seçin, gösterin. Son olarak, her monosit alt kümesinden hücreleri seçin.
Her monosit alt kümesi için her işaretçiyi görüntüleyen bir histogram oluşturmak için açılır parametreyi değiştirin. Ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi ortanca veya geometrik ortalamayı kullanarak ifade derecesini hesaplayın. Başarıyla kapılı monosit popülasyonları burada gösterilmiştir.
Ve oranlar literatürdekilerle aynı doğrultuda. Bu örneklem için oranlar% 88.1 klasik, % 4.33 ara ve% 7.49 klasik olmayan olarak hesaplanmıştır. Diğer popülasyonların göreceli konumunu değerlendirerek, burada mavi renkte gösterilen T hücreleri ve nötrofillerin cd16/CD14 çiziminde monosit, ters l şeklinin dışında iyi takip ettiği açıktır.
Ancak, hem doğal öldürücü hücreler hem de Burada mavi renkte gösterilen B hücre popülasyonları klasik olmayan monosit popülasyonuyla örtüştü. Kontamine hücre tiplerinin kaldırıldığını doğrulayan ısı haritaları burada gösterilmiştir. Doğal öldürücü hücreler HLA-DR CD16 adımı ile dışarı kapılı olmuştur, oysa, B hücreleri HLA-DR CD/14 adım tarafından dışarı kapılı edilmiştir.
Kırmızı renkteki izotip kontrollerine göre mavi renkteki M1 ve M2 işaretçilerin ifadesi burada gösterilmiştir. CD120b bir M1 işaretçisi, tüm monosit alt kümeleri için, onun iyotip kontrolü üzerinde net bir kayma gösterir. Bu aynı zamanda CD93 bir M2 işaretleyici için de geçerlidir, ifade klasik, orta orta ve klasik olmayan düşük yüksek tir.
Bu yordamı denerken, kontamine olan hücrelerin dışarı yalıtılmış olduğundan emin olmak önemlidir, çünkü aksi takdirde sayısal ifadeye katkıda bulunabilirler. Bu yordamı takiben, diğer belirteçleri incelenebilir. Gibi ek sorulara cevap vermek için, nasıl monosit marker ekspresyon değişiklikleri hastalık.
İnsan kanı ve formaldehit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, ve bu nedenle kişisel koruyucu ekipman ve biyolojik tehlike başlığı kullanma gibi önlemler, bu işlemi yaparken her zaman alınmalıdır.
